Article de méthode

Tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage en virologie : imagerie 3D d’échantillons congelés à haute pression et substitués par congélation

DOI :

10.3791/68568

⸱

6 août 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole vidéo illustre comment effectuer une tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage d’échantillons virologiques. Pour des résultats optimaux, les échantillons sont préparés par congélation à haute pression et substitution ultérieure de la congélation.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie électronique (EM) et surtout les techniques EM tridimensionnelles (3D) sont devenues des méthodes établies en virologie structurale. L’étude de l’altération de l’ultrastructure cellulaire induite par le virus, comme les usines de réplication induites par le virus Zika (ZIKV) ou les organites de réplication du coronavirus, nécessite une imagerie 3D. La tomographie par microscopie électronique à transmission (MET) est une méthode largement utilisée, malgré sa limitation aux échantillons d’une épaisseur allant jusqu’à 200 nm. La microscopie électronique à balayage ionique focalisé (MEB) peut produire des données 3D de plus grands volumes avec une résolution isotrope, bien que généralement inférieure. D’autres techniques, telles que la microscopie électronique à balayage facial (MEB-BF), la tomographie par réseau MEB ou l’imagerie TEM de coupes en série, sont utilisées pour l’imagerie de plus grands volumes. Cependant, par rapport aux techniques mentionnées précédemment, ces techniques se font au prix d’une résolution beaucoup plus faible le long de l’axe Z de l’échantillon. La tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage (STEM) est une technique qui fournit des informations 3D sur des échantillons allant jusqu’à 1 μm d’épaisseur avec une résolution isotrope de quelques nanomètres.

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation d’échantillons virologiques congelés à haute pression, substitués par congélation et enrobés de résine et leur analyse à l’aide de la tomographie STEM. Ce protocole bénéficie des avantages de l’imagerie à température ambiante tout en préservant l’ultrastructure biologique dans un état quasi natif. Nous montrons deux exemples représentatifs de questions auxquelles on peut répondre à l’aide de la tomographie STEM. Dans un premier temps, nous appliquons le protocole d’étude de la morphogenèse virionique d’un virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) recombinant. Les tomogrammes STEM offrent des informations sur le bourgeonnement du VSV recombinant qui ne sont pas accessibles par l’imagerie 2D. Deuxièmement, nous montrons la microscopie corrélative à la lumière et électronique (CLEM) à l’aide de l’imagerie par transfert d’énergie de résonance de Foerster (FRET) et de la tomographie STEM (FRET-3D-CLEM) de nanofibrilles peptidiques EF-C. Cette combinaison récemment publiée donne de nouvelles perspectives sur l’absorption et le désassemblage des nanofibrilles peptidiques favorisant l’infection, en particulier en profitant du grand volume accessible par tomographie STEM.

Introduction

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Figure 1 : Comparaison de différentes techniques de microscopie 3D, en tenant compte de la résolution, de l’instrumentation, du temps d’acquisition et de l’effort. Le volume maximal réalisable de ces techniques se situe entre la tomographie cryo-TEM techniquement exigeante qui offre une résolution moléculaire, et la microscopie optique, où la résolution est limitée par la limite de diffraction de la lumière. Abréviations : MET = microscopie électronique à transmission ; STEM = balayage TEM ; MEB = microscopie électronique à balayage ; FIB = faisceau d’ions focalisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les structures et les systèmes liés aux virus s’étendent sur une échelle allant du régime sous-angström (p. ex., petites molécules pour la virothérapie, protéines virales isolées) à plusieurs mètres (p. ex., organismes infectés entiers). Les particules virales sont dans la gamme de 20 à 1 000 nm et sont principalement étudiées dans leur contexte biologique, comme les cellules hôtes et les lignées cellulaires productrices virales, qui sont dans la gamme μm. La visualisation de structures spécifiques liées à des virus dépend donc du choix d’une technique qui offre un champ de vision suffisant et une résolution appropriée. L’étude des cellules et des morceaux de tissus infectés par le virus repose sur des techniques de microscopie (Figure 1). Alors que des images globales des cellules et des tissus peuvent être acquises à l’aide de la microscopie optique classique, les structures intracellulaires impliquées dans la réplication du virus sont souvent étudiées à l’aide de la microscopie électronique (EM). Bien qu’elle soit aujourd’hui principalement utilisée dans la recherche virologique fondamentale, l’EM est également utilisée dans le diagnostic 1,2 et a également trouvé sa place dans les applications biopharmaceutiques3.

Souvent, les approches EM 2D comme la microscopie électronique à transmission (MET) classique ne peuvent pas répondre de manière suffisante à une question biologique donnée. En virologie, c’est particulièrement le cas lors de l’étude des interactions virus-hôte-cellule telles que l’attachement et l’entrée des virions, la formation d’usines virales ou la morphogenèse des virions 4,5,6,7,8,9. Par conséquent, la tomographie EM est utilisée pour analyser l’ultrastructure 3D d’échantillons biologiques. En principe, il y a deux façons d’acquérir un tomogramme d’un certain échantillon : 1) l’imagerie par étapes de tranches de série qui sont ensuite combinées dans une pile d’images 3D, ou 2) l’acquisition de projections sous différents angles de vue de l’échantillon, suivie d’une reconstruction informatique de l’information en une pile d’images virtuelles.

Les techniques du premier type comprennent l’imagerie de coupes en série par TEM ou MEB (tomographie en réseau MEB), la tomographie par voie de bloc en série et la tomographie par faisceau d’ions focalisés (FIB)-MEB. L’imagerie MEB et TEM des coupes en série n’a pas la résolution en z, qui est limitée par l’épaisseur de la section, mais offre un large champ de vision et s’appuie sur un équipement facilement disponible dans la plupart des laboratoires EM4. La tomographie FIB-SEM peut produire une résolution isotrope, mais les coûts de l’appareil et de la maintenance peuvent être difficiles, et l’imagerie de cellules entières à résolution isotrope prend du temps 9,10.

Le deuxième type de tomographie repose exclusivement sur la transmission du faisceau d’électrons à travers un échantillon. Cela peut être fait à l’aide de deux modalités d’imagerie différentes : la MET ou la microscopie électronique à transmission à balayage (STEM). Alors que la tomographie TEM est plus répandue et plus facile à mettre en œuvre, l’épaisseur de la section est limitée à ~200 nm. Par conséquent, les structures plus grandes que l’épaisseur de la section, telles que les mitochondries, les vésicules ou les virions, ne peuvent pas être imagées dans un seul tomogramme. La tomographie STEM offre la possibilité d’imager des échantillons jusqu’à 1 μm d’épaisseur11,12. Cependant, il nécessite un STEM avec une tension d’accélération élevée (≥200 kV) et une configuration qui prend en charge des angles d’inclinaison élevés ainsi qu’un petit angle de semi-convergence13. Bien que l’imagerie STEM soit une technique courante en science des matériaux, elle reste une technique rare dans les laboratoires de ME biologiques.

Ici, nous présentons une approche axée sur l’application pour utiliser la tomographie STEM pour les échantillons virologiques. En raison de la grande complexité et de la nature laborieuse de la tomographie EM, une préparation d’échantillon de haute qualité est cruciale. Alors que la TEM cryogénique (tomographie) est sans aucun doute l’étalon-or pour les investigations au niveau moléculaire, l’imagerie à température ambiante de cellules congelées à haute pression et substituées par congélation fournit une préservation solide et une clarté de l’ultrastructure cellulaire 7,14. En bref, les cellules adhérentes sont cultivées sur un disque de saphir et infectées ou traitées comme souhaité. Les cellules sont ensuite immobilisées en les congelant sous haute pression à des vitesses de refroidissement très élevées, ce qui entraîne une vitrification de l’eau à l’intérieur. Par la suite, l’eau est remplacée par un solvant tandis que les échantillons sont contrastés et ramenés lentement à température ambiante. Les échantillons sont ensuite progressivement noyés dans de la résine.

Il existe de nombreux protocoles pour la congélation à haute pression et la substitution de la congélation, qui diffèrent par la machinerie, le système de support et la composition de l’échantillon. Des protocoles détaillés pour la congélation à haute pression ont été publiés, dont un par Walther et al.15, et un protocole vidéo par Steyer et al.16, qui se concentre sur la préparation des tissus pour FIB-SEM à l’aide de l’amélioration du contraste assistée par micro-ondes. Pour la recherche virologique, Read et al.17 et Romero-Brey18 ont publié des protocoles détaillés pour la préparation de cellules infectées par le virus par congélation à haute pression avec des disques de saphir et analyse ultérieure par tomographie électronique. Une section ultramince a également été décrite précédemment 15,17. Reportez-vous à la littérature citée pour plus de détails sur ces approches.

Ici, nous présentons un flux de travail qui est une version adaptée et mise à jour des protocoles15,17 précédemment publiés, associée pour la première fois à un guide vidéo détaillé. Le protocole fournit un flux de travail pour la préparation des échantillons à l’aide de la congélation à haute pression, de la substitution par congélation et de l’intégration dans de la résine époxy. Les sections d’une épaisseur de 800 à 1 000 nm sont découpées à l’aide d’un ultramicrotome. Une série d’inclinaison est acquise avec un STEM de 200 kV, à l’aide des outils logiciels EM. Ce protocole est optimisé pour les cellules adhérentes et fournit un flux de travail complet tout en permettant des modifications pour d’autres types d’échantillons, tels que les cellules de tissu ou de suspension. Pour la tomographie STEM dans des conditions cryogéniques, reportez-vous aux travaux du groupe19,20 de Michael Elbaum.

Protocole

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1. Culture cellulaire

  1. Préparation des disques de saphir
    1. Nettoyez les disques de saphir en les lavant 3x dans 100 % d’éthanol pendant 20 min. Retirez le reste de l’éthanol en tirant les disques sur un papier filtre sec. Laissez les disques dans une chambre de séchage à 37 °C pendant au moins 30 min, ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs.
      REMARQUE : Dans ce protocole, des disques de saphir d’un diamètre de 3 mm et d’une épaisseur de 0,16 mm sont utilisés. Pour d’autres systèmes, un flux de travail optimisé pour les cellules de tissus ou de suspension, reportez-vous à Walther et al.15. Certains « trucs et astuces » pour les cellules cultivées et d’autres systèmes sont fournis par McDonald et al.21.
    2. Enduisez les disques de saphir en plaçant environ 50 disques de saphir à plat sur un verre de montre propre et en les recouvrant d’une couche de carbone de 10 à 15 nm d’épaisseur à l’aide d’un dispositif de revêtement en carbone. Faites cuire les disques pendant la nuit à 120 °C pour stabiliser la couche de carbone.
      REMARQUE : Pour les approches EM corrélatives, introduisez un système de coordonnées : placez une grille de chercheur sur les disques de saphir avant le revêtement de carbone, de sorte que la grille soit visible en négatif sur le disque21.
    3. Pour pouvoir identifier plus tard la face recouverte de carbone du disque de saphir, utilisez un outil tranchant (par exemple, la pointe d’une pince à épiler) pour gratter une marque dans le carbone qui ne peut être lue correctement que d’un seul côté.
      REMARQUE : Nous recommandons le chiffre « 2 » ou similaire (Figure 2A,B). Ignorez cette étape pour les disques en saphir avec un système de coordonnées revêtu.
    4. Conservez les disques de saphir dans une chambre de séchage à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement.
      REMARQUE : Il n’est pas conseillé de réutiliser les disques de saphir car cela augmente la probabilité qu’ils se cassent lors de la congélation à haute pression.
  2. Culture cellulaire
    1. Peu de temps avant le placement en culture cellulaire, déchargez incinitativement le côté recouvert de carbone des disques à l’aide d’un dispositif de décharge luminescente pour les rendre hydrophiles (par exemple, 0,26 mbar avec un courant de 20 mA pendant 40 s). Ensuite, stérilisez les disques en les exposant à la lumière UV pendant 15 min.
      REMARQUE : Une exposition à la lumière UV pendant plus de 30 minutes peut endommager le revêtement en carbone.
    2. À l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les disques au fond d’une boîte de culture contenant des milieux, en veillant à ce qu’ils ne flottent pas. Grainez soigneusement les cellules sur le dessus. Si les disques de saphir flottent dans le milieu de culture cellulaire, ils se déchargent plus longtemps lors de la répétition de l’expérience.
      REMARQUE : Il est crucial que le « 2 » soit correctement orienté, ce qui signifie que le côté recouvert de carbone est orienté vers le haut. Une monocouche cellulaire sur les disques avec une confluence finale de ~80 % est souhaitée. La croissance cellulaire sur les disques de saphir peut différer de celle de la boîte de culture environnante. Vérifiez la distribution et la qualité des cellules sur les disques à l’aide d’un microscope à lumière inversée avant de poursuivre le protocole. La distribution des cellules peut être améliorée en balançant doucement la plaque tout en ensemenceant les cellules.
      Pour les cellules de suspension, recouvrir les disques de saphir recouverts de carbone avec de la poly-L-lysine ou utiliser des capillaires, comme décrit aupoint 15. N’exposez pas les disques recouverts de poly-L-lysine à la lumière UV, car cela pourrait endommager le revêtement de poly-L-lysine.
    3. Effectuez tout traitement souhaité des cellules (par exemple, infection, traitement médicamenteux) tout en maintenant les disques de saphir en place. Manipulez les disques avec précaution pour éviter de détacher les cellules ou de rayer la couche de carbone. Incuber les cellules en conséquence. Effectuez une préfixation chimique avec, par exemple, 2,5 % de glutaraldéhyde, 1 % de saccharose dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,3) ou 4 % de paraformaldéhyde, selon les réglementations locales, avant de transporter les échantillons vers le congélateur haute pression 1,7,22.
      REMARQUE : Avant que les échantillons infectés ne quittent les laboratoires de biosécurité, respectez toutes les réglementations locales en matière de biosécurité applicables au système modèle.

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Figure 2 : Congélation à haute pression. (A) Disques de saphir montrant une couche de carbone avec « 2 » (à gauche) ou un système de coordonnées pour la lumière corrélative et la microscopie électronique (à droite). (B) Représentation schématique d’un sandwich SD-espaceur or-SD tel qu’il est préparé pour la congélation à haute pression. Les cellules cultivées sur les disques se font face et sont ainsi protégées dans la cavité étroite. (C) Support pour la congélation à haute pression qui contient un sandwich SD. (D) Matériaux et dispositifs pour le chargement du support HPF : (1) Plaque chauffante, (2) Stéréomicroscope, (3) Papier filtre, (4) Tube à réaction contenant du 1-hexadécène, (5) Pince à épiler, (6) SD non revêtus, (7) Boîte de Pétri avec entretoises dorées, (8) Support HPF. (E) Configuration du système HPF : (1) Boîte LN pour le transfert des échantillons congelés (voir aussi F), (2) Sèche-cheveux pour accélérer le réchauffement du support HPF après la congélation, (3) Dewar d’azote pour remplir la boîte LN. (F) Boîte LN pour le stockage d’échantillons congelés après une congélation à haute pression avec une auge centrale (contour pointillé) dans laquelle le support HPF peut être ouvert et les SD peuvent être manipulés en toute sécurité. Matériaux nécessaires directement après la congélation à haute pression : (1) Support pour jusqu’à six récipients d’échantillons, (2) Pince à épiler isolée, (3) Récipients d’échantillons avec couvercle. Les récipients contiennent de petits trous et de petits poids (par exemple, une vis) afin qu’ils s’immergent dans l’azote liquide. Abréviations : SD = disque de saphir ; HPF = congélateur haute pression ; LN = azote liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparation d’échantillons pour la microscopie électronique

  1. Congélation à haute pression
    REMARQUE : Ce protocole décrit la congélation à haute pression avec le congélateur à haute pression (HPF, Table des matériaux). Les étapes décrites ne doivent pas différer beaucoup pour d’autres machines, car elles ont le même objectif.
    1. Suivez les instructions du fabricant pour configurer le congélateur haute pression. Assurez-vous d’une alimentation adéquate en azote liquide (Figure 2E), allumez la machine et effectuez un essai.
    2. Configurez un espace de travail pour charger les disques dans le support HPF (Figure 2D). Préparez les éléments suivants : une plaque chauffante (1), un stéréomicroscope (2), des morceaux de papier filtre (3), un tube à réaction avec de l’hexadécène comme charge (4), une pince à épiler (5), des disques saphir vides/non revêtus pour congeler un nombre impair de SD avec des cellules (6), des entretoises en or (7) et le support HPF (8, détail sur la figure 2C).
    3. Préparez un espace de travail pour la manipulation des échantillons congelés (Figure 2E,F). Avant de commencer la congélation à haute pression, préparez les équipements suivants :
      1. Préparez la boîte LN et remplissez-la d’azote liquide (Figure 2E, F) en vue de la manipulation et du transfert des disques de saphir gelés du support HPF aux capsules de stockage.
      2. Préparez un petit dewar (3 sur la figure 2E) et remplissez-le d’azote liquide : soyez prêt à remplir la LN-box avec de l’azote liquide plusieurs fois pendant le processus de congélation.
      3. Gardez une pince à épiler isolée (2 dans la figure 2F) à portée de main.
      4. Préparez des récipients d’échantillons qui contiendront les disques de saphir après la congélation à haute pression (capsules de stockage, 3 sur la figure 2F). Assurez-vous qu’ils ont un couvercle et plusieurs trous pour que l’azote liquide puisse se déverser et de petits poids (par exemple, de petites vis ou similaires) pour s’assurer qu’ils ne flottent pas. Étiquetez les récipients avant de les utiliser et prérefroidissez-les dans la boîte LN.
        REMARQUE : Nous utilisons des capsules BEEM comme capsules de stockage.
    4. Conserver les échantillons dans un incubateur à proximité du congélateur haute pression si les cellules n’ont pas été préfixées, ou si cela n’est pas possible, sur une plaque chauffante (1 sur la figure 2D), afin de maintenir les conditions physiologiques (37°C, 5 % CO2) le plus longtemps possible.
    5. Assurez-vous d’un nombre suffisant de cellules sur les disques de saphir et d’une bonne qualité de cellules avant de commencer la congélation à haute pression. Pour ce faire, inspectez les disques à l’aide d’un microscope à lumière inversée.
    6. Effectuez la congélation à haute pression.
      1. Prenez un disque de saphir de la boîte de culture à l’aide d’une pince à épiler et placez-le dans le support HPF (Figure 2C) avec le côté recouvert de carbone vers le haut (« 2 » est lisible). Avant cela, retirez l’excès de média en trempant rapidement le disque sur du papier filtre, mais veillez à ne pas laisser les cellules tomber à sec.
      2. Trempez une entretoise en or dans de l’hexadécène et placez-la soigneusement sur le disque de saphir. Prenez un deuxième disque de saphir et positionnez-le sur le dessus de l’entretoise en or, le côté recouvert de carbone vers le bas, formant un sandwich disque de saphir - entretoise d’or - disque de saphir avec les cellules pointant l’une vers l’autre. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air emprisonné dans la cavité du sandwich.
      3. Fermez le support HPF. Effectuez cette étape avec précaution mais rapidement pour minimiser le stress sur l’échantillon, en particulier pour les cellules vivantes qui n’ont pas été préfixées.
        REMARQUE : Pour les échantillons contenant des substances cancérogènes, mutagènes ou reprotoxiques (CMR), comme les fixateurs chimiques, chargez le support HPF sous une hotte pour minimiser l’exposition.
      4. Démarrez le processus de congélation. Insérez rapidement le support HPF dans le congélateur haute pression, verrouillez-le conformément aux instructions du fabricant et lancez le processus de congélation.
    7. Retirez les échantillons vitrifiés du support HPF. Transférez rapidement l’extrémité du support HPF qui transporte les disques de saphir maintenant gelés dans la boîte LN prérefroidie. Retirez délicatement les disques du support HPF dans l’auge centrale de la boîte LN (ligne pointillée sur la Figure 2F). Après cela, réchauffez le support HPF et retirez tout résidu d’éthanol ou d’hexadécène avant de commencer à assembler le sandwich suivant.
      REMARQUE : À partir de maintenant, assurez-vous que tout ce qui touche les disques est prérefroidi à l’azote liquide. Effectuez rapidement les étapes de transfert dans une atmosphère d’azote et stockez les disques dans de l’azote liquide pour éviter la décongélation de l’échantillon. Pratiquez à l’avance le transfert du support du HPF vers la LN-box pour assurer une transition rapide et en douceur. Le processus de réchauffement du support peut être accéléré après la congélation à l’aide d’un sèche-cheveux (2 sur la figure 2E).
    8. Après avoir retiré les disques de saphir du support, placez-les dans les récipients étiquetés, soit pour le transfert vers le dispositif de substitution de congélation, soit pour le stockage de l’azote liquide jusqu’à un traitement ultérieur. Si les disques de saphir sont étroitement empilés après HPF, utilisez un scalpel pour séparer les disques de saphir avant la substitution de gel.
      REMARQUE : Veillez à ne pas casser les disques et à éviter les forces de cisaillement. Prévoyez suffisamment de temps pour cette étape.
  2. Substitution de gel
    1. Installez le dispositif de substitution de congélation en suivant les instructions du fabricant. Remplissez le dewar d’azote liquide et démarrez le programme de prérefroidissement de la chambre d’échantillonnage à -90 °C. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’azote liquide pour l’ensemble du processus de substitution.
      REMARQUE : Les produits chimiques impliqués sont dangereux. Effectuez toutes les étapes sous une hotte et respectez les directives locales en matière d’environnement, de santé et de sécurité (EHS).
    2. Préparez la solution de congélation de substitution contenant 0,1 % (p/v) d’acétate d’uranyle, 0,2 % (p/v) de tétroxyde d’osmium (OsO4) et 5 % (v/v) d’eau dans de l’acétone. Pour préparer un volume de 6 mL (suffisant pour remplir 24 cryoflacons, ce qui équivaut à la capacité maximale du dispositif de substitution utilisé ici), suivez ces étapes :
      1. Pesez 6 mg d’acétate d’uranyle dans un récipient en verre avec un couvercle hermétique.
      2. Ajouter 300 μL de tétroxyde d’osmium à 4 % (p/v) dans l’eau.
      3. Fermez le récipient et sonifiez pendant 5 minutes pour dissoudre l’acétate d’uranyle.
      4. Ajouter 5,7 ml d’acétone, mélanger et répartir uniformément la solution dans des flacons cryogéniques compatibles avec le dispositif de substitution de congélation.
    3. Placez les flacons cryogéniques fermés contenant la solution de congélation et de substitution dans le dispositif de congélation prérefroidi à -90 °C et attendez que la solution soit également refroidie à -90 °C (pendant environ 20 min).
    4. Remplissez la boîte LN avec de l’azote liquide. Pour transférer les disques de saphir dans le dispositif de substitution de congélation, une pince à épiler pré-refroidie, un scalpel et des pinces (ou grandes pinces à épiler) dans de l’azote liquide.
    5. À l’aide de la grande pince à épiler prérefroidie, transférez les capsules de stockage contenant les échantillons congelés à haute pression du réservoir de stockage dans la boîte LN.
      REMARQUE : Travaillez rapidement pour éviter toute décongélation des échantillons. Lors du traitement d’échantillons directement après la congélation à haute pression, cette étape peut être sautée.
    6. Transférez les échantillons congelés à haute pression dans le dispositif de substitution de congélation. Séparez les disques de saphir un à un tout en les gardant dans de l’azote liquide. Transférez rapidement chaque disque individuellement dans un flacon cryogénique avec une solution de substitution de congélation, en vous assurant que le disque est complètement immergé. Fermez le flacon cryogénique et remettez-le immédiatement dans le dispositif de substitution de congélation.
      REMARQUE : Pendant le transfert, conservez le cryoflacon dans l’atmosphère d’azote liquide pour éviter que la solution de substitution ne se réchauffe, mais pas dans l’azote liquide pour éviter qu’il ne gèle. Tenez le flacon avec les doigts près du couvercle pour éviter de réchauffer la solution de substitution. Manipulez la solution de substitution avec précaution, car elle contient des substances toxiques.
    7. Une fois que tous les disques sont transférés dans le périphérique de substitution, lancez le processus de substitution de gel. Réglez l’appareil pour augmenter progressivement la température pendant 16 h de -90 °C à 0 °C, avec une étape d’incubation de 1 h à 0 °C, suivie d’une augmentation progressive jusqu’à 20 °C sur 1 h.
    8. Dès que les échantillons atteignent 20 °C, continuez directement avec le lavage des échantillons pendant 3 x 30 min avec 100 % d’acétone.
      REMARQUE : Ne laissez pas les cellules sur les disques tomber à sec. Effectuez toutes les étapes suivantes sous une hotte. Collectez tous les déchets dans un conteneur approprié et éliminez-les conformément aux réglementations locales en matière d’environnement, de santé et de sécurité.
  3. Encastrement
    1. Préparez fraîchement la résine époxy selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes avec de la résine époxy sous une hotte. Nous recommandons de préparer de la résine fraîche pour chaque procédure d’enrobage en raison de la viscosité plus faible et donc d’une meilleure infiltration de l’échantillon.
    2. Pour pré-intégrer les échantillons, incubez les échantillons dans une solution contenant 1/3 de résine époxy et 2/3 d’acétone pendant 1 h. Remplacez la solution par 2/3 de résine époxy et 1/3 d’acétone et incubez pendant 3 h. Remplacez la solution par de la résine époxy à 100 % et laissez-la incuber toute la nuit avec le couvercle du flacon ouvert pour permettre à l’acétone restante de s’évaporer.
    3. Le lendemain, transférez les disques de saphir dans de nouveaux tubes de réaction étiquetés remplis de résine époxy fraîchement préparée. Positionnez les disques horizontalement, soutenus par la paroi du tube réactionnel, et assurez-vous que le côté avec les cellules est orienté vers le haut dans le tube réactionnel (le « 2 » est lisible au stéréomicroscope). Placez les tubes réactionnels avec le couvercle ouvert dans un four à 60 °C et laissez la résine époxy polymériser pendant au moins 48 h.
      REMARQUE : Si un fragment de disque de saphir doit être intégré, incrustez-le à l’aide d’une pointe polymérisée d’un bloc de résine d’une expérience précédente : Placez la pointe dans le tube de réaction, remplissez le tube de résine fraîche et placez le disque cassé sur la pointe polymérisée.
      Tous les consommables à usage unique contaminés par de la résine époxy doivent être placés dans un four à 60 °C pour permettre à la résine de polymériser complètement avant de l’éliminer. Les pinces à épiler et autres articles peuvent être essuyés au préalable avec de l’éthanol.
    4. Immerger l’extrémité d’un tube réactionnel fermé dans de l’azote liquide pendant environ 10 s. Ensuite, retirez le bloc de résine du tube de réaction en frappant le tube de réaction sur la table. Le disque de saphir se sépare facilement de la couche de carbone qui reste au-dessus des cellules intégrées.
      REMARQUE : Assurez-vous que votre milieu d’enrobage tolère les changements de température induits par le traitement à l’azote liquide.
  4. Préparation des coupes de tomographie STEM
    1. Préparez des coupes beaucoup plus épaisses que les sections ultraminces pour l’imagerie TEM, généralement entre 800 nm et 1 μm.
      REMARQUE : La préparation des coupes pour la tomographie STEM diffère légèrement de l’échotomie conventionnelle. Pour un protocole détaillé décrivant la préparation des coupes de tomographie STEM, voir Walther et al.15 et Villinger et al.10.
      Avant de poursuivre la préparation des coupes de tomographie STEM, assurez-vous que la qualité des cellules est bonne. Pour cela, effectuez une coupe ultramince (~70 nm) et une analyse TEM (Figure 3D,E).
    2. Collectez les sections sur des grilles de cuivre à barres parallèles, de sorte qu’aucune barre de grille ne bloque le faisceau d’électrons lors de l’inclinaison de l’échantillon à des angles élevés. Pour une meilleure fixation de la section, traitez les grilles avec 0,01 % de poly-L-lysine : préparez une petite aliquote de poly-L-lysine à 0,01 % à partir d’une solution mère à 0,1 %, trempez les grilles dans l’aliquote, séchez-les soigneusement en faisant glisser le bord de la grille sur un papier filtre. Déchargez les grilles et utilisez-les pour collecter les sections.
    3. Traiter les sections avec de l’or colloïdal comme repères pour l’alignement de la série d’inclinaison (voir section 3).
    4. Appliquez une couche de carbone sur les sections pour les stabiliser et les rendre plus conductrices.

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Figure 3 : Contrôle de la qualité par TEM - différentes apparences des cellules après l’enrobage, le rognage et la section ultramince. (A) Cellules enrobées de résine époxy après le retrait du DS. La couche de carbone avec le « 2 » rayé reste sur les cellules incrustées de résine et est clairement visible. Les cellules presque transparentes sont réparties uniformément sur la face du bloc. (B) Face du bloc coupé avant la microtomie. Une partie du 2 rayé est encore visible à la surface du bloc de résine. (C) Sections minces de 70 nm montées sur une grille TEM. (D) Vue d’ensemble TEM d’une section ultramince entière. Notez les trous dans la section (pointes de flèches blanches) qui résultent d’une infiltration incomplète de résine et qui sont un artefact courant. (E) Vue agrandie d’une cellule sélectionnée marquée d’un rectangle blanc en (D). Semblable à (D), un enrobage incomplet est visible au niveau de la membrane plasmique (pointes de flèches blanches) ; Cependant, le reste de la cellule présente une bonne conservation et un bon encastrement. Barres d’échelle = 100 μm (D), 10 μm (E). Abréviations : SD = disque de saphir ; MET = microscopie électronique à transmission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Imagerie

  1. Acquisition de la série STEM tilt
    1. Installez le microscope selon les directives du fabricant. Assurez-vous que le faisceau est bien aligné.
    2. Remplissez soigneusement le dewar d’azote liquide au microscope.
    3. Sélectionnez le support de tomographie approprié dans le logiciel de fonctionnement du microscope.
    4. Insérez la grille dans le support. Faites attention à ce que les barres de la grille soient orientées perpendiculairement à l’axe d’inclinaison pour éviter que les barres ne bloquent le faisceau d’électrons à des angles d’inclinaison élevés.
    5. Insérez le support dans le microscope.
    6. Alignez la poutre en effectuant les opérations suivantes :
      1. Chargez le fichier d’alignement fourni par le fabricant. Ouvrez la vanne de faisceau et travaillez en mode TEM pour l’instant. Réglez un grossissement d’environ 20 000x et réglez la mise au point standard en appuyant sur STD Focus.
      2. Recherchez un trou dans l’échantillon. C’est plus facile en mode à faible grossissement (appuyez sur LowMag).
      3. Assurez-vous qu’aucune ouverture n’est insérée. Réglez la taille du spot sur 1 et Alpha sur 3. Minimisez le faisceau sur l’écran de visualisation en tournant le bouton de luminosité dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et centrez-le avec les boutons de décalage du faisceau.
      4. Alignement correct du pistolet : Dans le panneau d’alignement du logiciel de fonctionnement du microscope, sélectionnez le pistolet et le wobbler d’anode. Ajustez la symétrie du faisceau à l’aide des boutons DEF/STIG . Vérifiez que le mouvement du faisceau sur l’écran fluorescent est homogène. Déplacez le point le plus lumineux au milieu de l’écran à l’aide des boutons SHIFT ; Désélectionnez tout lorsque vous avez terminé.
      5. Corriger les stigmateurs de condenseur : Dans le même panneau d’alignement , sélectionnez CLA et le HT wobbler. Ajustez avec les boutons DEF/STIG pour obtenir un mouvement homogène.
      6. Réglez l’ouverture de l’objectif du condensateur : Maximisez le faisceau sur l’écran fluorescent en tournant le bouton de luminosité dans le sens des aiguilles d’une montre. Insérez la plus petite ouverture de l’objectif du condenseur et assurez-vous qu’elle est correctement alignée dans le faisceau en alternant la luminosité. Si le faisceau se déplace de manière asymétrique sur l’écran de visualisation, ajustez manuellement l’ouverture à l’aide des variateurs d’ouverture manuels. Si l’ouverture semble déformée sur l’écran fluorescent, corrigez à nouveau les stigmateurs de condenseur CLA avec DEF/STIG (étape précédente 3.1.6.5).
      7. Passez en mode STEM (sélectionnez ASID).
        REMARQUE : Vous pouvez interrompre le dialogue de relaxation de l’objectif après 5 à 10 s.
      8. Déplacez la platine vers une région fine et riche en contraste de l’échantillon. Appuyez sur STD Focus et retirez toutes les ouvertures. Passez à un grossissement de 25 000 avec une taille de spot de 1,5 nm, réglez la longueur de l’appareil photo entre 80 et 120 cm et sélectionnez le mode spot.
      9. Modifiez la valeur z du goniomètre jusqu’à ce que le ronchigramme soit visible sur l’écran de visualisation. Modifiez la longueur de la caméra si le ronchigramme est faible. S’il n’est pas rond, utilisez le bouton COND Stig pour l’ajuster.
      10. Insérez la plus petite ouverture d’objectif du condenseur. Utilisez les variateurs d’ouverture manuels pour centrer l’ouverture autour du ronchigramme.
    7. Insérez le détecteur approprié. En fonction de la question de recherche, utilisez le détecteur à fond clair et/ou le détecteur à fond noir. Activez le mode de balayage et acquérez une première image de test de l’échantillon.
    8. Sélectionnez un grossissement supérieur à celui souhaité pour le tomogramme (supérieur à 800 000x). Mise au point correcte et astigmatisme : faites-le à proximité, mais pas directement dans la région d’intérêt (ROI), pour éviter d’endommager le faisceau dans les zones critiques de l’échantillon.
      REMARQUE : Les marqueurs fiduciaux en or peuvent faciliter cette étape.
    9. Réglez la hauteur eucentrique pour vous assurer que le ROI reste centré sur toute la plage d’inclinaison (c’est-à-dire -72° à 72°). Sélectionnez une caractéristique près du ROI, amenez-la au centre, concentrez-vous, corrigez l’astigmatisme et inclinez la platine par étapes à - 72 °. Ajustez la position z du support pour maintenir la fonction centrée et ajustez le contraste et la luminosité si nécessaire. Si nécessaire, répétez l’opération en inclinant progressivement à +72 °.
    10. Choisissez le champ de vision en revenant à la zone d’intérêt, faites la mise au point et acquérez une image de vue d’ensemble (Figure 4). Réglez le grossissement souhaité pour l’acquisition de la série d’inclinaison.
    11. Configurez l’acquisition automatique en série d’images de -72° à +72° et d’images tous les 1,5°.
    12. Pour contrer les effets mécaniques qui se produisent lors du changement de direction de l’inclinaison de la scène, commencez la série d’inclinaison avec un angle plus grand que celui avec lequel commencer l’imagerie. Si vous imagez de -72° à 72°, commencez par incliner la platine de 0° à -74°, puis lancez l’acquisition d’images sur le chemin de +72°, en acquérant la première image à -72°.
    13. Démarrez l’acquisition automatique de la série d’inclinaison. Assurez-vous d’activer le focus dynamique dans le logiciel d’acquisition.
      REMARQUE : Si l’acquisition de la série d’inclinaison est terminée prématurément, corrigez la hauteur eucentrique. En particulier à un grossissement plus élevé, cela peut entraîner des problèmes d’acquisition automatique des séries d’inclinaison en raison de la migration du retour sur investissement hors du champ de vision.
      Un logiciel couramment utilisé pour la tomographie STEM et TEM est SerialEM. Kirchweger et al.20 ont publié un protocole vidéo pour la tomographie Cryo-STEM à l’aide de SerialEM, qui peut être facilement adapté à la tomographie STEM à température ambiante.

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Figure 4 : Acquisition de la série Tilt. (A) STAM 200 kV. (B) Vue d’ensemble STEM d’une cellule congelée à haute pression et substituée par congélation noyée dans de la résine époxy. La série d’inclinaison illustrée en (C-E) a été acquise à la position marquée par le rectangle blanc. (C-E) Images sélectionnées d’une série d’inclinaison acquises de -72° à +72°. Des repères en or des deux côtés de la section sont utilisés pour la reconstruction par tomogramme informatique. Les repères groupés comme ceux marqués par des ellipses blanches ne peuvent pas être utilisés pour la reconstruction du tomogramme, mais sont bien reconnaissables à des angles d’inclinaison élevés. Ces structures ou des structures similaires en dehors de la région d’intérêt sont utiles pour définir la hauteur eucentrique. Barre d’échelle = 1 μm (B). Abréviation : STEM = microscopie électronique à transmission à balayage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Reconstruction et segmentation du tomogramme

  1. Effectuer la reconstruction d’un tomogramme (par exemple, avec le logiciel Etomo du progiciel IMOD23).
    1. Effectuez le premier alignement de la série d’inclinaison et reconstruisez le tomogramme à l’aide d’une projection arrière lestée.
      REMARQUE : Un protocole détaillé se trouve sur le site Web de l’IMOD : Guide de tomographie IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Pour le traitement des images acquises avec le détecteur de champ noir, se référer aux travaux précédemment publiés11,13.
  2. Segmentez les structures cellulaires (par exemple, avec des logiciels tels que 3DMOD du package IMOD ou des solutions basées sur l’IA).

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tomographie STEM offre la possibilité d’imager des coupes plus épaisses que la tomographie TEM avec une résolution isotrope de l’ordre du nanomètre et, par rapport à la tomographie FIB-SEM, fournit un flux de travail d’imagerie relativement rapide. En virologie, cela est particulièrement utile car il permet d’imager un grand nombre de caractéristiques ultrastructurales pour l’analyse statistique en 3D, ou lors de la recherche d’événements rares. Nous présentons ici deux résultats représentatifs qui démontrent comment la tomographie STEM peut être utilisée en ce qui concerne ces deux aspects.

Visualisation des virions VSV recombinants en bourgeonnement

Il existe une grande variété de virus qui forment des particules de différentes formes et tailles. Pour analyser la forme des virions dans une suspension virale, une méthode simple comme la coloration négative TEM est souvent suffisante. La caractérisation de la morphologie des virions dans le contexte cellulaire est plus difficile. Cela est particulièrement vrai pour les virus qui forment des particules à la morphologie anisotrope, comme les rhabdoviridae. Le VSV est un rhabdovirus qui forme des virions en forme de balle de ~180 nm de longueur. Dans les cellules en suspension, les virions sont orientés de manière aléatoire, ce qui rend difficile de toujours discerner la forme de la balle dans les images 2D (Figure 5A-C). Pour définir correctement la forme de la balle de tous les virions VSV recombinants dans un échantillon, une méthode 3D à résolution isotrope est nécessaire, une méthode qui peut également fournir des informations volumétriques sur une zone d’échantillon suffisamment grande. Un tomogramme STEM peut inclure de nombreux virions complets dans un seul ensemble de données (figures 5D, E). Ainsi, il est possible d’imager un grand nombre de virions pour l’analyse statistique, même si un seul tomogramme par cellule est acquis. En comparaison, un tomogramme TEM d’une section de 200 nm d’épaisseur ne capturerait que quelques virions complets du VSV recombinant (comme le montre la figure 5E).

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Figure 5 : Tomographie STEM des sites de bourgeonnement recombinant du VSV. (A-C) Les détails d’une coupe virtuelle d’un tomogramme STEM obtenue à partir d’une coupe de 800 nm d’épaisseur montrent que la forme de la balle n’est pas toujours visible en raison des différentes orientations (A,B) des virions. (C) Seuls les virions orientés parallèlement au plan de visualisation se présentent sous forme de balles bien définies. (D) Les sites de bourgeonnement du VSV recombinant ressemblent à de grands amas de virions sans orientation préférée. (E) La vue latérale du tomogramme démontre la capacité de capturer de nombreux virions complets du VSV recombinant dans une seule section à l’aide de la tomographie STEM. La pile d’images virtuelles a une épaisseur d’environ 600 nm à cette position. Les lignes pointillées représentent l’épaisseur approximative d’une coupe pour la tomographie TEM (200 nm), où seuls quelques virions complets en forme de balle seraient inclus. Barre d’échelle = 500 nm (D). Abréviations : STEM = microscopie électronique à transmission à balayage ; VSV = virus de la stomatite vésiculeuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dégradation des nanofibrilles peptidiques EF-C

Dans le contexte de la thérapie génique, les nanofibrilles peptidiques améliorant la transduction sont devenues un sujet d’intérêt. Dans une étude récemment publiée24, l’imagerie corrélative utilisant l’imagerie par transfert d’énergie par résonance de Foerster (FRET) et la tomographie STEM (FRET-3D-CLEM) a été utilisée pour étudier l’absorption et le désassemblage des nanofibrilles peptidiques EF-C. Des rendements FRET élevés, correspondant à des paires de FRET proches les unes des autres, émettent une fluorescence rouge correspondant à des fibrilles assemblées. Les faibles rendements FRET, correspondant à des paires FRET éloignées les unes des autres, émettent une fluorescence verte, représentant des fibrilles désassemblées. Les deux signaux apparaissent dans les cellules lorsqu’elles sont en train d’absorber et de dégrader les nanofibrilles peptidiques EF-C. Les zones où l’on trouve des efficacités FRET élevées et faibles apparaissent en jaune (Figure 6A).

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Figure 6 : Imagerie de la dégradation des nanofibrilles peptidiques EF-C par imagerie FRET corrélative et tomographie STEM (FRET-3D-CLEM). (A) Microscopie confocale d’une cellule incubée avec des nanofibrilles EF-C marquées avec une paire FRET. Les signaux verts correspondent à des fibrilles présumées démontées. Le rouge correspond à des fibrilles présumées intactes. Le jaune correspond aux zones où un mélange du signal rouge et du signal vert est détecté. Noyau nu. (B) Vue d’ensemble STEM d’une section de 800 nm d’épaisseur à partir de la même cellule. (C) La position du tomogramme est indiquée. L’image est un composite de deux images acquises sur des sections différentes, car la cellule a été partiellement bloquée par la grille à barres sur l’une des sections. Le noyau est marqué avec Nu en A, B et C. (C) Coupe virtuelle du tomogramme. Les pointes de flèches rouges marquent les régions qui se chevauchent avec des signaux de fluorescence rouges. La tomographie STEM confirme la présence de fibrilles intactes. La pointe de flèche verte pointe vers une région où les fibrilles sont démontées. (D) Segmentation du tomogramme. Un filopodium endocytosé pince la membrane vésiculaire (flèche blanche). Le grand volume qui peut être étudié à l’aide d’un tomogramme STEM (ici environ : 7 μm x 7 μm x 550 nm) facilite l’observation d’un événement aussi rare. (E) Sections virtuelles 19, 24 et 29 du tomogramme. Avec une taille de pixel de 6,8 nm, les sections sont chacune espacées de 27,2 nm. La figure est reproduite à partir des données publiées par Rauch-Wirth et al.24 . Barres d’échelle = 5 μm (A), 1 μm (C). Abréviations : STEM = microscopie électronique à transmission à balayage ; FRET = Transfert d’énergie de résonance de Foerster. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cette approche corrélative a permis de visualiser que les fibrilles EF-C sont absorbées par la cellule et se dégradent par la suite. La microscopie optique nous permet de choisir des cellules pour la microscopie électronique qui fournissent des signaux rouges et verts, afin de comparer l’aspect ultrastructurel en corrélation avec les différents signaux de fluorescence. Les tomogrammes STEM de la même cellule montrent que le signal rouge peut provenir soit de fibrilles qui sont encore à l’extérieur de la cellule, soit d’une macropinocytose apparemment fraîchement internalisée (Figure 6C). De plus, CLEM a vérifié que le signal vert provenait bien de fibrilles dégradées (Figure 6B,C que l’on retrouve dans les lysosomes (Figure 6C, plus grande vésicule). En raison du grand volume accessible par la tomographie STEM et de la visualisation 3D des structures, il est plus facile de corréler le signal de la microscopie optique avec les caractéristiques ultrastructurales et de les interpréter. De plus, des événements rares, tels que le pincement de filopodes à l’intérieur du lysosome (Figure 6D,E, flèche blanche) peuvent être détectés avec cette approche.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tomographie STEM offre une résolution comparable à la tomographie TEM combinée à la possibilité d’étudier des volumes allant jusqu’à 1 μm d’épaisseur. Nous considérons donc qu’il est idéal pour l’imagerie des modifications des structures intracellulaires induites par les virus, comme le remodelage membranaire 4,6,25, le bourgeonnement des virions 7 ou l’endocytose5. En fonction de la question de recherche, d’autres techniques VolumeEM peuvent être envisagées. Pour une technique qui offre un champ de vision plus large avec une résolution comparable, nous recommandons la tomographie FIB-SEM. La tomographie FIB-SEM sera plus lente que la tomographie STEM lors de l’imagerie d’un volume comparable avec une résolution similaire, car le temps d’imagerie augmente lorsque la résolution augmente. Souvent, cela est ensuite contre-mesuré en imageant des champs de vision plus petits. De plus, une résolution z de 6,8 nm (figure 6) serait techniquement difficile avec le broyage par faisceau d’ions. Par conséquent, FIB-SEM est optimal pour l’imagerie de structures plus grandes comme les cellules entières et les tissus9, 10, 26, 27, bien qu’ils aient généralement des tailles de pixels (isotropes) de plusieurs dizaines de nanomètres. De plus, les tomogrammes FIB-SEM ne montrent pas d’effets de « coin manquant », ce qui est typique des tomogrammes reconstruits à partir d’une série d’inclinaisons. De plus, avec le développement des machines FIB plasma, des alternatives permettant un fraisage plus rapide et toujours précis sont actuellement introduites sur le terrain.

Si une haute résolution en z n’est pas cruciale, l’imagerie TEM ou MEB de coupes en série peut être une alternative qui permet d’étudier un très grand champ de vision en peu de temps28,29, cependant, généralement avec une résolution anisotrope. En tomographie TEM, différents tomogrammes de coupes épaisses en série peuvent être combinés30,31. La même chose est possible en tomographie STEM ; Cependant, compte tenu de l’épaisseur des sections qui peuvent être étudiées, il est moins nécessaire de combiner un certain nombre de tomogrammes. En virologie, la tomographie TEM est souvent utilisée pour caractériser le remodelage membranaire induit par le virus 32,33,34,35. Bien que la tomographie TEM elle-même fournisse des informations précieuses sur le cycle de réplication des virus, la plupart des cas d’utilisation bénéficieraient de la capacité de la tomographie STEM à imager des volumes plus épais. Cela est particulièrement vrai pour les virions de morphologie anisotrope, comme les rhabdoviridae, où la tomographie TEM ne peut capturer que quelques virions complets dans un tomogramme35 ou pour l’imagerie de plusieurs virions enveloppants dans un compartiment de réplication avec une taille du complexe d’assemblage viral cytoplasmique (cVAC) du cytomégalovirus humain (HCMV)4.

La tomographie STEM dans des conditions cryogéniques offre des informations fonctionnelles supplémentaires19 et un protocole vidéo est disponible20. Notre protocole diffère dans le flux de préparation des échantillons, qui, au lieu de conserver l’échantillon dans son état natif, fournit une conservation ultrastructurale quasi native. Bien que la tomographie STEM d’échantillons congelés à haute pression et substitués par congélation ne puisse pas atteindre la préservation ultrastructurale et la résolution atomique observées dans les EM cryogéniques, elle bénéficie des avantages d’un équipement plus simple, d’échantillons plus stables et d’un débit plus élevé.

Les étapes suivantes sont essentielles au succès de la méthode :

Tout d’abord, un objectif clair de l’expérience d’imagerie. En raison de la nature laborieuse de la technique, une expérience bien planifiée avec un objectif clair pour l’imagerie est nécessaire. Une connaissance détaillée du système modèle - lignée cellulaire et virus - doit être générée au préalable en utilisant d’autres méthodes moins difficiles à réaliser. Par conséquent, nous encourageons l’optimisation des taux d’infectivité dans les pré-expériences basées sur la microscopie optique et l’ajustement des conditions expérimentales en fonction du système biologique. Les paramètres d’optimisation incluent le nombre de cellules, la multiplicité de l’infection (MOI) et les points temporels basés sur le virus et l’événement à imager. Cela garantira une proportion élevée de cellules évaluables dans l’échantillon.

Deuxièmement, une préparation d’échantillons de haute qualité. Nous insistons sur l’importance d’une préparation des échantillons de qualité. À l’heure actuelle, nous considérons la vitrification par congélation à haute pression comme l’étalon-or pour les échantillons épais comme les cellules. La substitution de congélation, l’intégration et l’imagerie ultérieure à température ambiante constituent un moyen robuste d’obtenir des résultats de haute qualité lorsqu’ils sont combinés à la tomographie STEM. Par conséquent, il est crucial d’établir une routine stable pour la préparation des échantillons. Pour cela, nous aimerions mettre en évidence la littérature sur la congélation à haute pression14,21. Si une solution de substitution de congélation moins toxique doit être utilisée, nous recommandons d’utiliser du permanganate de potassium comme substitut du tétroxyde d’osmium, comme décrit par Schauflinger et al.36.

Enfin, un flux de travail fluide pour l’acquisition en série d’inclinaisons, y compris un microscope bien aligné, doit être établi conformément aux instructions d’utilisation du STEM et différera d’un microscope à l’autre. La mise en place d’un flux de travail fluide dépend également du générateur de numérisation et du logiciel d’acquisition d’images.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR et MD sont des employés de Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, une société pharmaceutique qui s’intéresse au développement et à la production de produits à base de virus. Cela n’a eu aucune influence sur la conception du papier ; Par conséquent, nous ne signalons aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette publication s’inscrit dans le cadre de la Stratégie mondiale en matière de technologies de développement et a été soutenue par la gestion mondiale de la technologie de Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. Nous remercions Renate Kunz et Jana Apolloni pour leur excellente assistance technique et leur discussion utile concernant la préparation des échantillons. Nous remercions Reinhard Weih pour son excellente assistance en cas de problèmes techniques et de maintenance de l’appareil. Nous remercions Torsten Friedrich pour la discussion utile et pour son aide dans la configuration du microscope. Les travaux de Clarissa Read, Julia LaRoche et Jan Münch ont été financés par une subvention du Centre de recherche coopérative de la Fondation allemande pour la recherche (SFB1279).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-HexadécèneMerck KGaA8220640500
Grille de 200 en cuivre avec barres parallèlesPlano GmbHG2014C
37 & deg ; Chambre de séchage en CBinder GmbH9010-0323
AcétoneVWR international GmbH20066330
DDSASciences de la microscopie électronique13710
Couteau en diamantDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Sciences de la microscopie électronique13600
Résine Embed-812Sciences de la microscopie électronique14900
Outils EMTVIPS GmbHLogiciels TVIPS : EM-Tools ; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Éthanol à 100 %Merck KGaA1.00983.2511
Papier filtreVWR international GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
FormvarSciences de la microscopie électronique15830-25
Unité de substitution par gel Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nmRéactifs et réactifs d’or AURION Immuno Accessoires425.011
Bois de pin doré et oslash ; 2000 & MU mScience Services GmbHGA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen KupferPlano GmbHNH6C
Plaque chauffanteMEDAX GmbH & Comté KG12501
Système de vaporisation à haut vide BAF 300BAL-TEC AG
Congélateur haute pression Wohlwend HPF Compact 01Bureau d’ingénierie M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Réservoir d’azote liquideH.Erben GmbH94500
Azote (liquide)VWR international GmbH-
NMASciences de la microscopie électronique19000
Tétraoxyde d’osmiumChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Four à 120 °F ; CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Poly-L-Lysine 0,1 % en valeur égale. SolutionTed Pella, Inc.18026
Tubes à verrouillage de coffre-fort 0,5 mLEppendorf SE0030 121.023
Contenants d’échantillons (capsules Beem)Plano GmbHG360-1
Disque en saphir dia. 3 x 0,16 mmBureau d’ingénierie M. Wohlwend GmbH500
Ultramicrotome Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
Acétate d’uranyleRiedel de Haë ; n AG31697
Chambre à lumière UVDiniesELG100S

Références

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