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Article de méthode

Épithélium pigmentaire rétinien primaire de souris transfecté par l’ARN Alu : un modèle in vitro pathologiquement pertinent pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge

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DOI :

10.3791/68570

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17 octobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons l’ensemble du processus d’établissement d’un modèle pathologique pertinent pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) primaires de souris en utilisant la transfection de l’ARN Alu.

Résumé

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier la DMLA non exsudative, nécessite des modèles expérimentaux qui reproduisent mieux la pathologie humaine. Les modèles in vivo actuels restent techniquement exigeants et chronophages, alors que les systèmes in vitro conventionnels ne parviennent pas à récapituler les déclencheurs pathologiques spécifiques à une maladie. Ici, nous présentons une méthode pour établir un modèle de dégénérescence épithéliale pigmentaire rétinienne (EPR) en utilisant des cellules EPR primaires de souris transfectées avec de l’ARN Alu, un rétrotransposon directement impliqué dans la pathologie de l’atrophie géographique.

Ce protocole détaille l’isolement enzymatique des cellules primaires de l’EPR de souris, suivi de la transfection de l’ARN Alu pour induire la dégénérescence de l’EPR. La validation intègre l’analyse morphologique (architecture hexagonale), fonctionnelle (perte de polarité et perturbation de la protéine ZO-1 de la souris) et moléculaire (PCR quantitative). En conséquence, nous avons observé des changements multifactoriels déclenchés par la transfection de l’ARN Alu : sécrétion inflammatoire de cytokines (gènes de souris Ifn-β, Il-6, Tnf-α ; p < 0,05) et sénescence cellulaire (gènes de souris p21 et p53 ; p < 0,05). Par rapport aux modèles traditionnels de stress aigu, ce système récapitule les cascades inflammatoires-dégénératives chroniques de la DMLA grâce à des techniques standardisées, garantissant ainsi la reproductibilité. En combinant des aspects d’essais in vitro simplifiés et de modèles in vivo complexes, cette approche pourrait servir de plate-forme préliminaire pour explorer les mécanismes induits par les rétrotransposons et sélectionner des candidats thérapeutiques potentiels.

Introduction

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une cause prédominante de déficience visuelle globale. Cependant, les traitements efficaces pour la DMLA non exsudative restent limités. Il est donc urgent de disposer de modèles de recherche reproductibles et efficaces pour découvrir les mécanismes de la maladie et identifier des cibles thérapeutiques 1,2. Au cœur de cet effort se trouve l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une monocouche située entre la membrane de Bruch (choroïde) et les photorécepteurs (rétine), qui joue un rôle central dans le maintien de l’homéostasie rétinienne en soutenant la fonction des photorécepteurs, en régulant la barrière hémato-rétinienne et en facilitant l’élimination des déchets 3,4.

Le dysfonctionnement ou la perte de cellules EPR est une caractéristique saillante de nombreuses maladies dégénératives rétiniennes, en particulier dans la DMLA, où le dysfonctionnement de l’EPR représente une étape précoce et critique dans sa progression 2,4,5. Notamment, chez les patients présentant une atrophie géographique (AG), la phase avancée de la DMLA, des niveaux réduits de l’enzyme de traitement des microARN Dicer 1 ribonucléase III (DICER1) entraînent une accumulation toxique d’ARN Alu, un transcrit de rétrotransposon directement lié à la dégénérescence de l’EPR et impliqué dans la pathologie humaine6.

Les modèles in vivo traditionnels, tels que le modèle d’iodate de sodium (NaIO3) et le modèle de β amyloïde (Aβ), conservent la complexité systémique de la maladie, mais sont confrontés à des limites critiques. Le modèle NaIO3 induit rapidement un stress oxydatif rétinien et des dommages à l’EPR, cependant, sa toxicité aiguë perturbe à la fois l’EPR et les photorécepteurs, ne parvenant pas à imiter la progression de la DMLA liée à la pathologie chronique et obscurcissant l’évaluation thérapeutique du dysfonctionnement subtil de l’EPR7. De même, le modèle Aβ introduit des facteurs de stress spécifiques à la maladie, mais nécessite une expertise technique approfondie et des délais prolongés par rapport aux approches in vitro 8,9. En revanche, les modèles d’EPR in vitro conventionnels, comme les modèles d’exposition à H2O2 et à l’hydroquinone, manquent de pertinence pathologique, ne parvenant pas à récapituler les facteurs de stress spécifiques à la maladie tels que les agrégats de protéines toxiques ou les déclencheurs inflammatoires1.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour établir un modèle de dégénérescence de l’EPR dans les cellules EPR primaires de souris à l’aide de l’ARN Alu, un ARN non codant dérivé d’un rétrotransposon directement impliqué dans la pathogenèse de l’EG6. L’ARN Alu active les voies inflammatoires et compromet l’intégrité de la barrière EPR10,11, imitant ainsi les caractéristiques pathologiques associées à la DMLA non exsudative. Cette méthode utilise l’isolement enzymatique et la culture de cellules EPR, suivis de l’induction de la dégénérescence EPR à l’aide d’ARN Alu. De plus, nous fournissons un système de validation complet, combinant des lectures morphologiques (architecture hexagonale), fonctionnelles (intégrité de la barrière et perte de polarité) et moléculaires (marqueurs inflammatoires et de sénescence) pour évaluer ce modèle de dégénérescence.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital général de Shanghai affilié à la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai. Ce protocole suit strictement le Règlement pour l’administration des affaires concernant les animaux d’expérimentation (publié par la Commission nationale des sciences et de la technologie) et les directives pour l’utilisation éthique des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle établies par l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Isolement des cellules primaires de l’EPR de souris

  1. Préparation des plaques revêtues
    1. Diluer Matrigel à raison de 150 μL de Matrigel pour 13 mL de DMEM/F12 (concentration finale d’environ 1,14 %).
    2. Enduire uniformément le fond de la plaque avec le Matrigel dilué (environ 150 μL pour une plaque de 48 puits). Incuber toute la nuit à 37 °C pour former un gel.
  2. Préparation de la solution
    1. Préparez le milieu de culture EPR complet à l’aide du mélange de milieu et de nutriments F-12 modifié Eagle de Dulbecco (DMEM/F12) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine.
    2. Préparez le mélange de papaïne en ajoutant 4,5 ml de solution saline équilibrée Earle’s (EBSS) dans un flacon de papaïne (100 unités/flacon).
    3. Préparez le mélange DNase I en ajoutant 500 μL d’EBSS dans un flacon de DNase I (1 000 unités/flacon).
    4. Préparez la solution de digestion de papaïne en ajoutant 250 μL de DNase I Mix à 4,5 mL de Papain Mix (ajustez le protocole fourni par le fournisseur pour obtenir une concentration finale de papaïne de 22 UI/mL), ce qui porte le volume final à 4,75 mL.
  3. Euthanasie et prélèvement de tissus
    1. Euthanasier des souris âgées de 2 à 3 semaines par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 5 % à raison de 150 à 200 mg/kg de poids corporel. Confirmez l’anesthésie profonde et la mort en vérifiant l’arrêt du rythme cardiaque et de la respiration.
    2. Vaporisez soigneusement la région oculaire avec de l’éthanol à 70 % avant l’énucléation pour éliminer les contaminants de surface 12,13,14. Appuyez doucement sur le bord périorbitaire pour faire saillir le globe. Ensuite, utilisez une pince pour extraire le globe oculaire, en préservant le nerf optique pour une dissection plus facile.
      REMARQUE : Tous les outils (p. ex., pinces, ciseaux) sont autoclavés et les procédures sont effectuées sous une hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité.
    3. Immergez immédiatement les globes oculaires dans un milieu de culture EPR complet stérile préchauffé à 37 °C.
  4. Digestion enzymatique
    REMARQUE :Toutes les étapes, y compris la digestion enzymatique et les procédures ultérieures, doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité.
    1. Transférez le globe oculaire dans une boîte et utilisez des pinces pour éliminer le tissu conjonctif adhérent et les muscles extraoculaires résiduels sous un stéréomicroscope.
    2. Rincer doucement les yeux 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s prérefroidie (D-PBS ; pas de Ca2+/Mg2+ ; à 4 °C).
      REMARQUE : Un milieu de culture EPR complet résiduel peut compromettre l’activité enzymatique de la papaïne.
    3. Immerger complètement les yeux dans 1 mL de solution de digestion de papaïne et incuber à 37 °C pendant 45 min.
  5. Séparation des cellules EPR
    1. Après la digestion, neutralisez l’activité enzymatique avec un milieu de culture EPR complet.
    2. Transférez le globe oculaire dans une boîte et, sous un stéréomicroscope, excisez la cornée, l’iris et le cristallin, et conservez l’œilleton postérieur.
      REMARQUE : Les cellules EPR ont été isolées et conservées sous forme de feuilles intactes (plutôt que de se dissocier en cellules uniques) pendant tout le processus.
    3. Séparez le complexe rétine-EPR de la choroïde, puis décollez la couche EPR de la rétine sous forme de feuilles continues dans un milieu de culture EPR complet. Rassemblez uniformément les couches d’EPR détachées dans un milieu de culture EPR complet et frais sous forme de mélange, puis cultivez-les sur des surfaces revêtues de Matrigel.
  6. Culture cellulaire
    1. Ensemencez le mélange dans une plaque à 24 puits recouverte de Matrigel (8 à 10 globes oculaires par puits sur lamelle, pour l’immunomarquage), une plaque à 48 puits recouverte de Matrigel (6 à 8 globes oculaires par puits, pour la qPCR) ou une plaque à 96 puits recouverte de Matrigel (5 à 6 globes oculaires par puits).
    2. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2. Effectuer le premier changement de milieu après 48 h en utilisant le milieu de culture EPR complet. Changez de milieu toutes les 48 h après le premier changement.
      REMARQUE : Pour maintenir autant que possible la polarité des cellules EPR, évitez de les passer autant que possible, car une sous-culture répétée peut entraîner une perte de différenciation et d’intégrité fonctionnelle.
  7. Suivi de la morphologie cellulaire
    1. Permettre aux cellules de former une monocouche avec une morphologie hexagonale caractéristique. Surveiller la morphologie à l’aide d’un microscope de culture cellulaire inversé.

2. Induction du modèle de dégénérescence RPE

  1. Synthèse et vérification de l’ARN Alu
    1. Synthétiser l’ARN Alu à l’aide d’un système de transcription in vitro .
      NOTE : La synthèse de l’ARN Alu utilisée dans notre étude a été basée sur le protocole décrit par le laboratoire Ambati6.
    2. Purifier l’ARN et confirmer sa qualité à l’aide d’un microspectrophotomètre.
  2. Transfection de l’ARN Alu
    REMARQUE : Nous avons désigné le jour de l’ensemencement primaire des cellules EPR comme le jour 0. Au jour 5, les cellules primaires adhérentes de l’EPR présentaient une morphologie uniforme et atteignaient plus de 50 % de confluence cellulaire, après quoi la transfection de l’ARN Alu a été effectuée à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides cationiques, conformément aux directives du fabricant.
    Deux groupes témoins ont été inclus pour valider les résultats : i) un témoin négatif (NC), dans lequel ni l’ARN Alu ni le réactif de transfection n’ont été ajoutés et un milieu à faible teneur sérique a été utilisé comme substitut ; ii) le contrôle des liposomes (LC), dans lequel l’ARN Alu a été omis mais la même quantité de réactif de transfection a été mélangée à un milieu à faible teneur sérique et appliquée sur les cellules, pour contrôler les effets associés à la lipofection. Les étapes suivantes décrivent la procédure de transfection de l’ARN Alu.
    1. Remplacer le milieu existant par 300 μL de milieu de culture EPR complet par puits (plaque de 48 puits) avant les procédures de transfection.
    2. Préparez des complexes de transfection avec de l’ARN Alu et un réactif à base de lipides cationiques dans un milieu à faible teneur en sérum.
      1. Préparez le mélange 1 avec 1,2 μL de réactif à base de lipides cationiques et 18,8 μL de milieu à faible teneur en sérum. Mélangez doucement (ne pas vortex) et incubez-le à température ambiante pendant 5 min.
      2. Préparez le mélange 2 avec 6 μL d’ARN Alu (100 μg/mL) et 14 μL de milieu à faible teneur sérique.
      3. Préparez les complexes de transfection en ajoutant 20 μL de Mix 2 goutte à goutte dans 20 μL de Mix 1.
        REMARQUE : L’ARN Alu a été transfecté à une concentration finale de 0,6 μg par puits en utilisant 1,2 μL de réactif à base de lipides cationiques par puits (1,2 μL de réactif : rapport ARN de 0,6 μg).
      4. Effleurez doucement pour mélanger. Ensuite, laissez-le à température ambiante pendant 20 min.
    3. Ajouter 40 μL/puits des complexes de transfection dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C/5 % CO2 pendant 48 h.
    4. Effectuez une qPCR, une immunocoloration et d’autres procédures expérimentales 48 h après la transfection.

3. Validation du modèle de dégénérescence

REMARQUE : Des expériences complètes de validation du modèle ont été effectuées le jour 7.

  1. Coloration par immunofluorescence pour l’évaluation de la polarité et de l’intégrité de la barrière
    1. Fixez des cellules EPR cultivées avec du formaldéhyde sans méthanol à 4 % pendant 20 min à température ambiante. Laver 3 x 10 min avec 1x PBS.
    2. Bloquer la liaison non spécifique avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 1 h.
    3. Incuber avec des anticorps primaires anti-ZO1 (dilution de 1:1 000 dans 3 % de BSA) et Phalloïdine 488 (dilution de 1:1 000 dans 3 % de BSA) pendant la nuit à 4 °C, en évitant la lumière.
    4. Lavez les cellules 3 x 10 min doucement avec du PBS.
    5. Incuber avec des anticorps secondaires (dilution 1:1 000 dans 3 % BSA) pendant 1 h à température ambiante.
    6. Lavez les échantillons 3 x 10 min avec 1x PBS.
    7. Contre-coloration avec du DAPI (dilution 1:1 000 dans du PBS) pendant 10 min.
    8. Lavez les échantillons pendant 3 x 10 min avec 1x PBS.
    9. Retirez délicatement la lamelle de la plaque à 24 puits et placez-la sur une lame de verre préchargée avec une goutte de support de montage. Capturez des images confocales à l’aide d’un objectif 40x/0,95.
  2. PCR quantitative (qPCR) pour la sénescence et les marqueurs inflammatoires
    REMARQUE : La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (gène de souris Gapdh) a été utilisée comme gène de référence interne pour la normalisation des valeurs de cycle seuil (Ct). Toutes les réactions de PCR quantitative (qPCR) comprenaient trois répétitions biologiques par groupe expérimental. Les séquences d’amorces sont fournies dans le tableau supplémentaire S1.
    1. Extraction de l’ARN
      1. Ajouter le tampon de lyse (kit d’ARN total) dans la plaque de culture (1 mL par 10 cm² de surface) et incuber à température ambiante pendant 5 min.
      2. Centrifugeuse à 13 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Transférez le surnageant dans un nouveau tube exempt de RNase.
        REMARQUE : Sautez cette étape si les échantillons sont exempts de débris (p. ex., lysat à cellules claires).
      3. Ajouter 200 μL de chloroforme au surnageant, agiter pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 3 min.
      4. Centrifugeuse à 13 400 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférez la phase aqueuse supérieure (~500 μL) dans un nouveau tube.
      5. Ajouter 0,5 volume d’éthanol à la phase aqueuse. Mélanger délicatement par pipetage.
      6. Chargez le mélange sur une colonne à membrane de silice (incluse dans le kit Total RNA). Centrifugeuse à 13 400 × g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
      7. Ajouter 500 μL de tampon d’élimination des protéines (kit d’ARN total) à la colonne. Centrifugeuse à 13 400 × g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
      8. Ajouter 500 μL de tampon de lavage (kit d’ARN total) dans la colonne. Centrifugeuse à 13 400 × g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
      9. Répétez l’étape précédente 3.2.
      10. Centrifuger la colonne vide à 13 400 × g pendant 2 min pour sécher la membrane.
      11. Eluter l’ARN en ajoutant 30 à 100 μL d’eau exempte de RNase à la membrane. Incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifugeuse à 13 400 × g pendant 2 min.
    2. Synthèse d’ADN complémentaire (ADNc)
      1. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nm et 280 nm.
        REMARQUE : Un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0 est considéré comme associé à une pureté acceptable de l’ARN.
      2. Préparez le mélange réactionnel dans un tube sans RNase : matrice d’ARN (500-1 000 ng) : X μL (en fonction de sa concentration), tampon de transcription inverse 5x : 4 μL, eau sans RNase : à 20 μL.
      3. Incuber le mélange réactionnel dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 37 °C pendant 15 min, 85 °C pendant 5 s et un maintien indéfini à 4 °C.
    3. qPCR
      1. Préparez le mélange maître qPCR pour chaque réaction (10 μL au total) : TB Green (inclus dans le Premix Taq) : 5 μL, colorant ROX (inclus dans le Premix Taq) : 0,2 μL, amorce directe (1 μM) : 0,2 μL, amorce inverse (1 μM) : 0,2 μL, eau sans RNase : 3,4 μL, matrice d’ADNc : 1 μL.
      2. Ajouter 10 μL du mélange maître dans chaque puits d’une plaque à 96 puits.
      3. Scellez la plaque avec un couvercle optique adhésif. Centrifuger à 300 × g pendant 1 min.
      4. Exécutez le programme suivant sur un système de PCR en temps réel : Étape 1 : 95 °C pendant 30 s ; Etape 2 : 40 cycles de : 95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 30 s ; Étape 3 : Analyse de la courbe de fusion.
      5. Calculez les niveaux d’expression relatifs des ARNm cibles à l’aide de la méthode 2−ΔΔCt 15.

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Résultats

Cellules RPE primaires de souris avant la transfection de l’ARN Alu
Au jour 0 (Figure 1), les cellules primaires de l’EPR de souris ont été isolées et présentaient la morphologie hexagonale caractéristique, typique des cellules EPR saines. Ces cellules maintenaient une monocouche bien organisée. Les cellules ont été cultivées pour permettre l’organisation structurelle initiale et la formation de jonctions serrées, comme en témoignent la forme hexagonale et les limites bie...

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Discussion

Notre objectif était d’établir un modèle reproductible et accessible de lésions de l’EPR qui permette l’imagerie à haute résolution et l’analyse mécaniste avec un minimum de contraintes de ressources. Cette approche a permis de visualiser clairement la perturbation structurelle induite par l’ARN Alu par rapport au groupe témoin, y compris la fragmentation des jonctions serrées apicales et la désorganisation du cytosquelette basal grâce à l’imagerie confocale Z-stack (pas de 0,5 μm). Deux...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été en partie soutenu par le Plan d’action pour l’innovation scientifique et technologique, le Projet spécial de recherche sur l’innovation médicale (23Y11901300), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82171076) et la Commission municipale de l’éducation de Shanghai (2023ZKZD18). Nous remercions le professeur L.Z pour le don aimable d’Alu RNA.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Série 1300 Classe II, enceinte de sécurité biologique de type A2Thermo Scientific
37 ° ; C/5 % CO2 incubateurThermo Scientific
4 % de paraformaldéhyde (PFA)ServicebioG1101-500ML
ARN Alu humainOffert par L.Z.
Anticorps secondaire anti-lapin, Alexa Fluor 568 (chèvre)Invitrogen Thermo ScientificN° A11011
Couvercle optique adhésif MicroAmp d’Applied BiosystemsThermo Fisher Scientific
Applied Biosystems MicroAmp Plaques de réaction optiques à 96 puitsThermo Fisher Scientific
Système de PCR en temps réel ViiA 7 d’Applied BiosystemsThermo Fisher ScientificSystème de PCR en temps réel pour l’analyse quantitative de l’expression génique
Albumine sérique bovine (BSA, fraction V)BeyotineST023-50g
Microscope de culture cellulaire inversée Carl Zeiss PrimovertZeissPour le suivi de la morphologie cellulaire
Centrifugeuse 5424 REppendorf
ChloroformeSigmaSéparation de phase dans l’extraction de l’ARN.
Microscope confocal à balayage laser (LSM900+Cell discover 7)ZeissImagerie à haute résolution de marqueurs d’immunofluorescence (p. ex., ZO-1 et F-actine).
Plaque à puits Costar 24/48/96Corning
LamelleThermo Fisher ScientificUtilisé sur plaque à 24 puits pour l’imagerie par immunofluorescence.
DAPIThermo62248
Bain sec numériqueMulab
DMEM/F12gibcoMilieux pour la croissance des cellules EPR  ;
Tamponné au phosphate de Dulbecco (D-PBS)PartagerBioSB-CR017
Comte' s Solution saline équilibrée (EBSS)gibcoSolution saline équilibrée utilisée pour la dilution de la papaïne et de la DNase I pendant l’isolement de l’EPR.
Éthanol (absolu)SigmaPrécipitation de l’ARN et lavage des colonnes.
Sérum fœtal bovin (FBS)SigmaPour des milieux de culture cellulaire EPR complets
forcepsPour la dissection
Lipofectamine 3000 (réactif de transfection à base de lipides cationiques)Thermo FisherL300015Transfecter l’ARN Alu dans les cellules EPR
matrigelCorning356234Matrice (dilution de 1,14 %) pour le revêtement des plaques afin de soutenir l’adhérence et la polarisation de l’EPR.
Formaldéhyde sans méthanolThermo ScientificFixateur alternatif (4 %) pour préserver les épitopes en immunofluorescence
MicropipetteEppendorf
Spectrophotomètre Nanodrop 2000Thermo ScientificMesure la concentration et la pureté de l’ARN
Microscope inversé fluorescent Nikon ECLIPSE Ti-SNikonImagerie par fluorescence d’échantillons colorés
Stéréomicroscope Olympus SZX16OlympePour la dissection des globes oculaires de souris et l’isolation RPE
Opti-MEMgibcomilieu à faible teneur sérique pour la préparation du complexe de transfection
Système de dissociation de la papaïneWorthingtonLK003150Pour l’enzyme de travail
Pénicilline-Streptomycine  ;gibcoPour des milieux de culture cellulaire EPR complets
Sel de sodium pentobarbitalSigmaAgent d’euthanasie
Phalloïdine 488°Abcam176753Pour l’évaluation de la polarité
Kit de réactifs PrimeScript RTTakaraRR037AKit de transcription inverse pour la synthèse de l’ADNc (préparation du modèle qPCR)
Kit d’ARN total RNAsimpleTIANGENDP419Pour l’extraction de l’ARN
TB Green  ; Premix Ex Taq  ; (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420APour la qPCR
ZO-1 Anticorps polyclonal de lapinProteintech21773Pour l’évaluation morphologique

Références

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