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Article de méthode

Microdissection à plusieurs niveaux et profilage fonctionnel-structurel des branches artérielles rénales humaines

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DOI :

10.3791/68579

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5 septembre 2025

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1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole étape par étape pour l’isolement et l’évaluation fonctionnelle des branches artérielles rénales humaines, facilitant les études précliniques pour le développement pharmaceutique.

Résumé

La dysfonction vasculaire rénale joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de plusieurs affections cliniques, notamment l’insuffisance rénale aiguë, l’ischémie rénale et l’hypertension, ce qui pose des défis importants dans la prise en charge clinique et affecte négativement les résultats pour les patients. L’isolement et la caractérisation fonctionnelle des artères intrarénales sont cruciaux pour élucider les mécanismes sous-jacents à la dysfonction vasculaire rénale, en particulier en ce qui concerne les lésions rénales, et guider le développement thérapeutique ciblé. Malgré son importance clinique, les approches standardisées pour isoler et évaluer fonctionnellement les artères intrarénales humaines à différents niveaux de ramification restent sous-développées. Ce protocole fournit un cadre complet pour l’isolement systématique et l’évaluation multimodale des branches artérielles intrarénales, intégrant des évaluations fonctionnelles et structurelles dans des conditions physiologiques et pathologiques. La méthodologie comprend trois éléments clés : (1) l’identification anatomique précise et la microdissection des artères intrarénales des reins de donneurs, accompagnées d’une coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) pour confirmation structurelle ; (2) des procédures de normalisation rigoureuses en myographie filaire pour améliorer la reproductibilité et la fiabilité des mesures ; et (3) l’analyse quantitative des réponses vasomotrices à l’aide de techniques de myographie de fil de précision. La normalisation est basée sur la relation longueur-tension musculaire, où l’étirement incrémentiel des segments artériels établit une tension de repos optimale pour maximiser le chevauchement actine-myosine, provoquant ainsi des réponses contractiles maximales. En myographie à fil, des segments vasculaires isolés sont suspendus entre deux fils parallèles, ce qui permet une mesure précise de la tension vasculaire. En appliquant des protocoles de normalisation rigoureux, cette technique permet une quantification reproductible et fiable de la réactivité vasculaire dans diverses conditions physiopathologiques et interventions pharmacologiques.

Introduction

Le rein est un organe vital responsable du maintien de l’homéostasie humaine par l’élimination des déchets métaboliques, l’équilibre électrolytique et la régulation des fluides - des fonctions qui exigent un flux sanguin exceptionnellement élevé. Dans des conditions physiologiques, les reins reçoivent environ 25 % du volume sanguin total pompé par le cœur chaque minute (débit cardiaque), ce qui souligne leur rôle substantiel dans le flux sanguin systémique et l’importance cruciale de la perfusion rénale dans le maintien de l’équilibre physiologique global1. Le système artériel rénal régule précisément cette livraison sanguine massive pour maintenir le DFG tout en s’adaptant aux changements hémodynamiques systémiques. Par conséquent, l’altération de la perfusion rénale représente un mécanisme pathologique critique qui contribue à la réduction du débit de filtration glomérulaire (DFG) dans des conditions telles que l’insuffisance rénale aiguë et l’ischémie rénale. De plus, il survient fréquemment à la suite de troubles systémiques qui compromettent le flux sanguin rénal, notamment le choc, le dysfonctionnement cardiaque et la septicémie 2,3,4,5. L’artère rénale subit une ramification séquentielle à l’intérieur du rein, se divisant d’abord en artères interlobaires qui traversent les colonnes rénales entre les pyramides médullaires. En atteignant la jonction corticomédullaire, ces vaisseaux donnent naissance à des artères arquées, qui s’arquent le long de la frontière entre le cortex et la moelle. De ces vaisseaux curvilignes émergent des artères interlobulaires qui pénètrent radialement dans le parenchyme cortical, acheminant finalement le sang vers les capillaires glomérulaires via les artérioles afférentes pour perfuser les néphrons individuels 1,6,7. Les artères interlobaires, arquées et interlobulaires constituent le principal système vasculaire de résistance dans le rein, servant de régulateurs primaires de l’hémodynamique intrarénale et du contrôle de la pression 1,8. L’isolement et la caractérisation précis de ces vaisseaux sont cruciaux pour élucider les mécanismes fondamentaux régissant l’homéostasie de perfusion rénale9. De plus, leur réactivité vasculaire hétérogène dans diverses conditions physiopathologiques offre un cadre stratégique pour le développement de nouveaux agents vasodilatateurs ayant un potentiel rénal protecteur10,11.

À l’heure actuelle, les techniques d’imagerie clinique (p. ex., l’échographie) sont couramment utilisées pour surveiller les changements du débit sanguin rénal ; Cependant, les méthodologies expérimentales de la recherche fondamentale permettant d’évaluer directement la tension vasculaire rénale, un déterminant clé de la perfusion rénale, restent limitées 12,13,14,15. Le système de myographie filaire est une plate-forme expérimentale bien établie qui mesure les changements de tension dans de petits tissus biologiques in vitro, y compris les vaisseaux sanguins, la trachée 16,17,18, avec des diamètres allant de 50 μm à 10 mm 16,19,20. Bien que la myographie filaire ait été largement appliquée dans les études animales, les différences interespèces dans la structure et la fonction vasculaires limitent la mesure dans laquelle les vaisseaux des rongeurs peuvent représenter la physiologie vasculaire humaine21. Par conséquent, l’identification et l’isolement précis des artères intrarénales humaines à différents niveaux anatomiques (interlobaires, arqués et interlobulaires) sont essentiels pour permettre des investigations in vitro complètes de leurs propriétés physiologiques, ainsi que des altérations fonctionnelles liées à la maladie et des mécanismes de lésions pathologiques. Lorsqu’il est combiné à des interventions pharmacologiques utilisant divers composés vasoactifs, ce système permet l’évaluation dynamique et l’enregistrement quantitatif des réponses de vasoconstriction/vasodilatation dans des anneaux artériels isolés, fournissant un outil puissant pour étudier la réactivité vasculaire dans des conditions expérimentales contrôlées 19,22,23.

Ce protocole détaille une méthodologie complète pour la localisation anatomique précise et la microdissection des branches de l’artère interne humaine (artères interlobaires, arquées et interlobulaires), suivie d’une caractérisation fonctionnelle à l’aide d’un système de surveillance de la tension vasculaire in vitro pour évaluer leur réactivité différentielle aux médicaments vasoactifs, établissant ainsi des distinctions structurelles et fonctionnelles entre ces segments vasculaires. En combinant la localisation anatomique avec le profilage de réactivité pharmacologique et l’analyse histopathologique, nous établissons une plateforme ex vivo qui permet une évaluation complète des réponses vasculaires spécifiques à une région aux agents vasoactifs.

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Protocole

Le protocole et les exemples décrits ici ont été examinés et approuvés par le service d’urologie du premier hôpital de l’Université de Pékin (approbation n° 2023yan500-002) et réalisés conformément à la Déclaration d’Helsinki. Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit avant de participer.

1. Préparation de la solution

  1. Préparez une solution de Krebs-Ringer (Krebs) contenant 119,0 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, 25,0 mM de NaHCO3, 1,2 mM de KH2PO4 et 11,0 mM de D-glucose à pH 7,4.
  2. Préparez une solution saline à haute teneur en potassium (60K+) contenant 64,0 mM de NaCl, 60 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, 25,0 mM de NaHCO3, 1,2 mM de KH2PO4 et 11,0 mM de D-glucose à pH 7,4.

2. Préparation du réactif

REMARQUE : Stockez les médicaments conformément aux détails fournis dans la fiche de données de sécurité (FDS) immédiatement après les avoir reçus.

  1. Préparez la phényléphrine (Phe, 10-1 M en stock) en dissolvant 167,21 mg de phényléphrine dans 10 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver la solution mère à -80 °C, diluer à 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M comme concentration de travail le jour de l’utilisation.
  2. Préparez l’acétylcholine (ACh, 10-2 M en stock), en dissolvant 18,166 mg d’acétylcholine dans 10 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver la solution mère à -80 °C, diluer à 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M comme concentration de travail le jour de l’utilisation.

3. Prélèvement de tissu rénal et isolement de l’artère intrarénale

  1. Recruter des patients adultes diagnostiqués avec un carcinome à cellules rénales, tel que confirmé histologiquement par biopsie préopératoire à l’aiguille ou section congelée peropératoire.
    REMARQUE : Les patients programmés pour une néphrectomie radicale sont spécifiquement choisis parce que leurs échantillons chirurgicaux permettent d’accéder à des segments artériels intrarénaux intacts situés distalement par rapport aux marges tumorales. Ces segments peuvent être disséqués et isolés avec précision, ce qui permet une étude détaillée de la physiologie vasculaire rénale humaine sans interférence de tissus malins. La confirmation histologique garantit une identification précise du carcinome et une délimitation claire des limites tumorales, facilitant ainsi la sélection de segments artériels normaux et exempts de tumeurs pour les investigations expérimentales.
    1. Exclure les patients présentant des comorbidités significatives (hypertension, diabète sucré ou autres maladies systémiques) afin d’éviter les influences confondantes sur la fonction vasculaire, améliorant ainsi la fiabilité et la pertinence des évaluations physiologiques.
      REMARQUE : Les échantillons pour cette expérience ont été prélevés sur des patients devant subir une néphrectomie radicale au premier hôpital de l’Université de Pékin.
  2. Lors d’une néphrectomie radicale, prélevez des échantillons de rein humain fraîchement excisés et plongez-les immédiatement dans une solution de Krebs glacée pour préserver la viabilité des tissus. Seules les régions d’apparence macroscopiquement normale distales aux marges tumorales sont retenues pour la dissection artérielle (Figure 1A).
    REMARQUE : Pour une isolation optimale de l’artère intrarénale, les tissus sains adjacents doivent être prélevés sous forme de coin corticomédullaire de pleine épaisseur lors de la néphrectomie radicale, préservant ainsi l’arbre artériel complet du système vasculaire cortical au système vasculaire médullaire.
    1. Conservez immédiatement le tissu excisé dans 200 ml de solution froide de Krebs. Placez le contenant sur de la glace et transportez-le dans un sac isotherme jusqu’au laboratoire dans les 2 h suivant la collecte. S’assurer que le tissu reste complètement immergé tout au long du transport afin de préserver la viabilité et l’intégrité structurelle pour la dissection et l’analyse fonctionnelle ultérieures.
      REMARQUE : Pour maintenir la viabilité des tissus et la fonction physiologique, l’ensemble du processus d’isolement et de stockage ultérieur dans la solution de Krebs à 4 °C doit être terminé dans les 6 h 24,25,26,27. La solution doit être remplacée régulièrement pendant les procédures pour maintenir l’oxygénation et la viabilité des tissus, tout en facilitant l’élimination des composants sanguins de la lumière vasculaire.
  3. Identifiez visuellement le plan coronal en localisant le hile rénal et en alignant la coupe pour qu’elle passe à travers le bassinet du rein et le bord convexe latéral. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez le rein en deux le long du plan coronal pour produire deux moitiés symétriques. Cette approche expose l’architecture interne, y compris les pyramides et les colonnes rénales, facilitant l’identification précise et la dissection ultérieure des artères intrarénales (Figure 1A).
    REMARQUE : Afin de faciliter la séparation des artères rénales, une partie du bassinet du rein, des pyramides rénales et de la graisse sur la surface de la section transversale doit être retirée en premier pour exposer davantage de vaisseaux sanguins (Figure 1B). Attention à ne pas couper les vaisseaux sanguins.
  4. À l’aide d’un stéréomicroscope, séparez méticuleusement les artères interlobaires, arquées et interlobulaires à l’aide de ciseaux de micro-dissection et de pinces dans une boîte de culture à fond noir de 10 cm (figure 1C).
    REMARQUE : Dans le rein humain, l’artère interlobulaire traverse les pyramides rénales, présentant la paroi vasculaire la plus épaisse parmi les trois branches artérielles 1,8, avec un diamètre moyen d’environ 1-2 mm. À la jonction corticomédullaire, l’artère interlobaire passe à l’artère arquée, formant un arc semi-circulaire le long du bord corticomédullaire, avec un diamètre moyen d’environ 500 μm. Les vaisseaux sanguins se ramifient ensuite dans le cortex rénal, qui est l’artère interlobulaire, avec la paroi vasculaire la plus mince et le plus petit diamètre parmi les trois, environ 200 μm (Figure 1C). De plus, lors de la différenciation des trois branches vasculaires, la localisation anatomique fournit des informations plus critiques que les mesures de diamètre vasculaire absolu 1,8.
    1. Retirez délicatement les tissus et la graisse environnants des artères, en veillant à bien les nettoyer dans une boîte de culture à fond noir de 10 cm (figure 1B).
  5. Utilisez les artères rénales isolées (artères interlobulaires, arquées et interlobaires) pour les expériences suivantes :
    1. Préparez les segments artériels pour le traitement histologique en coupant soigneusement les tissus isolés à une longueur normalisée d’environ 3 mm, ce qui convient à l’enrobage de paraffine et à la coupe histologique. Fixer chaque échantillon dans 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à température ambiante pendant 1 h pour préserver la morphologie des tissus. Après la fixation, procéder avec des protocoles standard de déshydratation, de nettoyage et d’enrobage de paraffine pour la coloration ultérieure à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) conformément aux protocoles histologiques établis (Figure 2).
      REMARQUE : Pour d’éventuelles évaluations histologiques, les échantillons peuvent subir la coloration trichrome de Masson pour évaluer le dépôt de collagène ou la coloration Verhoeff-Van Gieson (EVG) pour la visualisation des fibres élastiques, selon les protocoles histologiques établis28,29.
    2. Pour les études de la fonction vasculaire, conserver les anneaux intrarénaux dans une solution de Krebs glacée jusqu’au test. Les anneaux artériels doivent être complètement immergés.
      REMARQUE : Pour les essais moléculaires subséquents tels que le western blot/qPCR, congeler immédiatement les échantillons frais dans de l’azote liquide après la dissection, puis les stocker à -80 °C conformément aux procédures précédemment publiées pour préserver l’intégrité de l’ARN et prévenir la dégradation des protéines30,31.

4. Montage de l’anneau artériel

  1. Identifiez les artères interlobaire, arquée et interlobulaire par leurs positions anatomiques distinctes (figure 1C) et leurs diamètres (figure 2), puis sectionnez-les soigneusement en anneaux d’environ 2 mm de long à l’aide de ciseaux de microdissection pour étudier la fonction vasculaire (figure 3A).
    REMARQUE : Conserver immédiatement chaque anneau artériel isolé séparément dans 5 mL de solution glacée de Krebs jusqu’à l’essai fonctionnel. Pour les tests fonctionnels, choisissez des anneaux vasculaires non ramifiés d’une longueur de 1,5 à 2,0 mm avec des coupes perpendiculaires nettes. Excluez les bagues de plus de 2,0 mm pour éviter les difficultés de montage ou les bagues de moins de 1,5 mm pour éviter les enregistrements de tension instable.
  2. Préparez tous les anneaux artériels (des artères interlobaires, arquées et interlobulaires séparément) comme mentionné à l’étape 4.1 et amenez les solutions de Krebs et de 60K+ à température ambiante. Allumez ensuite l’ordinateur connecté, puis le système de myographe filaire, en vous assurant que tous les composants sont correctement initialisés avant de procéder aux expériences.
  3. Avant de monter les anneaux artériels dans les chambres de myographe en fil, rincez chaque chambre deux fois avec 5 ml de solution Krebs pour assurer la propreté et éliminer les substances résiduelles, puis ajoutez 5 ml de solution Krebs dans chaque chambre.
    1. Chauffez la solution à 37 °C à l’aide du système de contrôle de température intégré au myographe. Simultanément, aérez en continu la solution avec du gaz (un mélange de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2) via une conduite de gaz connectée pour maintenir une oxygénation et un équilibre de pH appropriés pendant l’expérience.
  4. Préparez deux fils de guidage de 3 cm de long et d’un diamètre de 40 μm pour chaque anneau artériel et transférez soigneusement les anneaux artériels isolés dans une autre boîte de culture à fond noir de 10 cm contenant une solution de Krebs.
    REMARQUE : Différents diamètres de fils de guidage doivent être sélectionnés pour des vaisseaux sanguins de différents diamètres. Pour l’anneau artériel d’un diamètre d’environ 100 μm ou moins, un fil-guide de 15 μm est nécessaire ; si le diamètre est compris entre 100 μm et 200 μm, un fil-guide de 25 μm est utilisé ; Si le diamètre est supérieur à 200 μm, un fil de guidage de 40 μm peut être utilisé. Pour assurer la cohérence de l’expérience, il est recommandé d’utiliser le même diamètre pour tous les récipients du même type au sein d’une seule expérience. 19. Planche à billets
  5. Insérez avec précaution le premier fil-guide dans l’anneau artériel à l’intérieur de la boîte, pliez un côté du fil de guidage à 90°, puis transférez-le dans la chambre pour le fixer sur le porte-échantillon de type pince à l’aide des vis spécialisées fournies par l’instrument pour le serrage des vis dans le sens des aiguilles d’une montre (Figure 3B).
    REMARQUE : Le fil de guidage est inséré pour fournir un support structurel lors du transfert de l’anneau artériel lors de son montage sur le porte-échantillon, minimisant ainsi les dommages ou la distorsion induits par la manipulation.
  6. Avant de fixer l’anneau artériel sur le support, notez la longueur et la largeur du récipient. Placez l’anneau artériel entre les deux supports (Figure 3C) et lisez l’échelle micrométrique, où 1 échelle représente 10 μm. Soustrayez la valeur de l’échelle mesurée lorsque les supports se touchent à peine (Figure 3D) pour déterminer la longueur et la largeur de l’anneau artériel.
  7. Enfilez un autre fil-guide dans le vaisseau sanguin et fixez-le enfin de l’autre côté. Enroulez le fil de guidage dans le sens des aiguilles d’une montre autour des vis de fixation des deux côtés et assurez-vous qu’il est bien fixé à la surface du porte-échantillon.
    REMARQUE : Pendant tout le processus de fixation, il est nécessaire d’éviter de tirer sur le vaisseau sanguin ou de rayer la paroi interne du vaisseau sanguin avec le fil de guidage pour éviter d’endommager l’endothélium vasculaire. Le fil de guidage doit être enroulé autour de la vis de fixation en une seule couche sans se chevaucher. Les deux fils de guidage doivent être sur le même plan horizontal, parallèles l’un à l’autre, et ne pas se couper. De plus, après avoir fixé le fil de guidage, ajustez le porte-échantillon des deux côtés plus près ; cependant, ils doivent être proches l’un de l’autre sans se toucher, afin d’éviter la force, comme le montrent les figures 3E et 3F.
  8. Réinstallez la chambre dans le système de myographe filaire. Ensuite, couvrez le couvercle et ventilez le gaz. Connectez le capteur et ouvrez le logiciel d’acquisition de données pour les tests de tension vasculaire.

5. Normalisation spécifique au récipient pour une détermination optimale de la tension initiale

REMARQUE : L’établissement de conditions de référence stables, définies comme la tension de repos optimale pour une réactivité contractile maximale, est essentiel pour des mesures fonctionnelles reproductibles. Cependant, en raison de différences physiologiques interindividuelles inhérentes, les vaisseaux sanguins humains présentent une plus grande variabilité des propriétés mécaniques de base par rapport aux vaisseaux sanguins animaux 32,33,34,35,36. Ces facteurs, combinés à l’hétérogénéité vasculaire intrinsèque (par exemple, les disparités structurelles et fonctionnelles en termes de diamètre, d’épaisseur de paroi et de propriétés contractiles), conduisent collectivement à des variations significatives de la tension de base. Par conséquent, pour assurer la reproductibilité expérimentale, il est recommandé de normaliser chaque vaisseau sanguin individuellement. Le système de myographe à fil comprend un module de normalisation dédié, qui permet de déterminer avec précision la tension de base pour chaque vaisseau.

  1. Montez les anneaux artériels dans la chambre comme décrit aux étapes 4.1 à 4.8. Commencez l’enregistrement du graphique, mettez le canal à zéro (Figure 4A), laissez la stabilisation pendant au moins 30 min, puis remettez le canal à zéro avant de procéder à la normalisation.
  2. Sélectionnez Paramètres de normalisation dans le menu DMT (Figure 4B) et configurez les paramètres comme suit (Figure 4C) :
    1. Étalonnage de l’oculaire (mm/div) : 1 ; Pression cible (kPa) : 13,3 ; IC1/IC100 : 0,9 ; Temps moyen en ligne (secondes) : 3 ; Temps de retard (secondes) : 60.
      REMARQUE : IC1 désigne la circonférence interne du vaisseau à la production maximale de force active, tandis que IC100 représente la circonférence correspondant à une pression transmurale de 100 mmHg. Les artères rénales humaines présentent une variabilité substantielle entre les échantillons, nécessitant une normalisation, contrairement aux modèles animaux qui ont des propriétés vasculaires cohérentes pour la détermination expérimentale et la réutilisation des rapports IC1/IC100. En raison des variations importantes du diamètre du récipient, de l’épaisseur de la paroi et des propriétés mécaniques entre les échantillons humains, chaque récipient doit subir une normalisation indépendante pour établir ses caractéristiques de base uniques. Le rapport de 0,9 a donc été établi ici comme espace réservé pour l’initialisation du protocole et n’a pas été utilisé en pratique dans ce protocole.
  3. Sélectionnez le canal correspondant à l’artère cible et ouvrez l’écran de normalisation à partir du menu DMT (Figure 4C), remplissez-le avec les données appropriées :
    1. Points finaux des tissus : a1 doit être 0, a2 doit être la longueur du vaisseau (en mm) ; Diamètre du fil : 40 μm (entrer le diamètre du fil utilisé) ; Lecture du micromètre : la valeur de l’échelle du micromètre, cliquez sur Ajouter un point pour enregistrer le point.
  4. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur Ajouter un point pour enregistrer le premier point et lancer la procédure de normalisation.
  5. Appliquez un étirement passif, attendez 3 min, entrez la lecture du micromètre comme point suivant, puis ajoutez 5 mL de 60K+ pour provoquer une contraction du vaisseau médiée par le potassium (Figure 5).
  6. Attendez que la contraction atteigne un plateau. Ensuite, lavez 3 fois la solution 60K+ avec 5 mL de solution de Krebs et calculez les données de force active à partir de la trace en soustrayant la force passive à chaque étirement de la force activée par le potassium (Figure 5).
  7. Répétez les étapes 5.5 à 5.6 (étapes « Stretch-60K+ stimulation-Wash ») jusqu’à ce que la force active atteigne son maximum, puis déterminez la tension de base optimale à laquelle la production de force active du récipient est maximale (Figure 5).
  8. Équilibrez l’anneau artériel dans la chambre pendant 10 minutes avant de passer aux étapes suivantes de l’expérience.

6. Détection de la réactivité de l’anneau artériel rénal

  1. Assurez-vous que le volume de Krebs dans chaque chambre est de 5 ml avant le début de l’expérience.
  2. Pour évaluer la contraction dépendante de la concentration induite par la phényléphrine, appliquer le Phe cumulatif par incréments d’un demi-log (10-9 à 10-4 M)37.
  3. Commencez par la concentration de Phe la plus faible (10-9 M). Ajoutez 5 μL de stock Phe (10-6 M) dans la chambre contenant 5 mL de tampon Krebs, surveillez en permanence et attendez que la contraction se stabilise (2-3 min de tension inchangée), marquez le point, puis ajoutez la concentration suivante par incréments d’un demi-log. Répéter l’opération jusqu’à ce que la concentration finale atteigne (10-4 M), en maintenant une surveillance constante tout au long de l’opération (figure 6).
  4. Pour des tests de dépistage de drogues supplémentaires, laver la chambre avec 5 ml chauds de solution de Krebs au moins 5 fois jusqu’à ce que la tension revienne à la ligne de base et reste stable pendant au moins 10 min.
  5. Pour évaluer la vasodilatation dépendante de la concentration induite par l’acétylcholine, appliquer l’ACh cumulatif par incréments d’un demi-log (10-8 à 10-5,5 M).
    REMARQUE : Dans le système vasculaire normal, la réponse à l’acétylcholine (ACh) sert d’indicateur fonctionnel de l’intégrité endothéliale37,38. La réponse vasodilatatrice à l’ACh reflète la fonction endothéliale par le biais de la relaxation médiée par le NO dans les vaisseaux sains. Cependant, dans des conditions pathologiques, cette réponse peut être atténuée ou abolie en raison d’une biodisponibilité altérée de l’oxyde nitrique (NO) et/ou d’une altération des voies de signalisation des récepteurs.
  6. Pré-contracter des récipients avec 10-4 M Phe, ajouter 5 μL de stock Phe (10-1 M) dans la chambre contenant 5 mL de tampon Krebs, et incuber pendant 15 min. En commençant par la concentration d’ACh la plus faible, ajouter 5 μL de stock Ach (10-5 M) dans la chambre contenant 5 mL de tampon Krebs, surveiller en permanence et attendre la réponse de vasodilatation (confirmée par une détection de traces soutenue), marquer le point, puis passer à la concentration suivante. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les tests soient effectués (Figure 7).
  7. Terminez l’expérience en enregistrant le fichier et en retirant les anneaux artériels. Nettoyez soigneusement la chambre en l’incubant avec 10 ml de solution d’acide acétique à 8 % pendant 3 minutes, puis rincez 3 fois avec 10 ml d’eau. Ensuite, incubez dans 10 ml d’éthanol à 95 % pendant 3 minutes et rincez à nouveau avec 10 ml d’eau 3 fois. Enfin, éteignez à la fois le chauffage et le gaz, en vous assurant que tout le liquide est éliminé avant de couper le gaz.

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Résultats

Dans le rein humain, l’artère interlobaire passe entre les pyramides rénales le long de la veine correspondante. Caractérisée par une paroi vasculaire relativement épaisse et une enveloppe importante du tissu adipeux, cette artère nécessite une dissection particulièrement soigneuse. Le tissu adipeux environnant doit être retiré méticuleusement pour éviter l’application d’une force excessive pendant la procédure d’isolement (Figure 1C).

L’artère arquée est position...

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Discussion

La stabilité de la perfusion rénale sert à la fois de cible thérapeutique critique et de fenêtre sur la physiopathologie hémodynamique39,40. Nous présentons un protocole d’isolement hiérarchique et d’évaluation fonctionnelle des artères rénales humaines à partir d’échantillons de néphrectomie frais, comblant ainsi des lacunes importantes dans les méthodologies actuelles. Contrairement aux approches existantes limitées à des spéci...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les volontaires pour leur participation à cette étude, ainsi que le personnel chirurgical du département d’urologie du premier hôpital de l’Université de Pékin pour avoir fourni des tissus rénaux. Ce travail a été soutenu par la Fondation municipale des sciences naturelles de Pékin (F251013 à Y. Z., 7232096 à Y. L.) ; Fondation nationale des sciences de Chine (82325004, 92168114 à Y. Z., 82170422 à Y. L.) ; Programme national de R-D clé de la Chine (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 à Y. Z., 2021YFF0501404 à Y. L., 2023YFC2415500 à L. Y.) ; Projet de recherche du troisième hôpital de l’Université de Pékin dans le laboratoire clé d’État de l’homéostasie et du remodelage vasculaires (Université de Pékin ; 2024-VHR-SY-07 à Y.Z.) ; 2023 Commission municipale de la santé de Pékin Capital : Innovation, science et technologie médicales, réalisation, transformation du projet de programme d’excellence promotion (YC202301QX0162 à L. Y.) ; Financement national de la recherche clinique hospitalière de haut niveau (Réalisations scientifiques et technologiques, Transformation, Incubation, Fonds d’orientation, Projet du premier hôpital de l’Université de Pékin, 2024CX24 à L. Y.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure d’acétylcholineSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, AllemagneA6625
Plat de culture à fond noirDanish Myo Technology, Aarhus, Danemark300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChineA501330
D-glucoseSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChineA610219
Pince DumontDanish Myo Technology, Aarhus, Danemark300413
Ciseaux de dissection GeuderDanish Myo Technology, Aarhus, Danemark400431
Fil de guidageDanish Myo Technology, Aarhus, Danemark400447Diamètre 40 & micro ; m
KclSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChineA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChineA100781
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