La conception et l’application d’un peptide inhibiteur pour la régulation négative rapide in vitro des niveaux de modifications post-traductionnelles à un site spécifique

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui décrit les spécifications de conception, les normes de contrôle de la qualité et le système de vérification fonctionnelle du TAT-PIP, un peptide inhibiteur de modification post-traductionnelle.

Résumé

Les protéines sont les principaux exécuteurs des activités de la vie et sont régulées aux niveaux transcriptionnel, translationnel et de modification post-traductionnelle (PTM). De plus, la PTM représente un mécanisme plus compliqué pour réguler les activités des protéines, car une protéine a généralement différents types de PTM et plusieurs sites pour une PTM spécifique. La transfection plasmidique ou le lentivirus et l’adénovirus pourraient être utilisés dans le dépistage initial du site PTM fonctionnellement important parmi tous les sites identifiés ; Cependant, ces méthodes sont toujours confrontées à des défis tels qu’une faible efficacité dans l’entrée des cellules et des tissus, des coûts longs et élevés, une réaction immunitaire potentielle, etc. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment développé et utilisé avec succès un type de peptide recombiné appelé TAT-PIP, PEPTIDE inhibiteur de PTM conjugué au TAT. Le TAT-PIP se compose d’un module TAT qui facilite l’entrée dans les cellules et les tissus et d’un module PIP qui régule spécifiquement à la baisse le PTM sur des sites ciblés par le biais d’une liaison compétitive. Ici, nous présentons un protocole qui décrit les spécifications de conception, les normes de contrôle de la qualité et le système de vérification fonctionnelle de TAT-PIP. Dans la section conception, nous décrivons la cohérence, la longueur optionnelle, la spécificité et la conservation de TAT-PIP. Ensuite, nous introduisons les exigences de test de qualité de TAT-PIP, qui garantissent son efficacité et sa sécurité. Dans l’application de la partie TAT-PIP, nous avons introduit le test de gradient de concentration de TAT-PIP, le processus d’incubation des cellules testées et la détection phénotypique ultérieure. En résumé, nous décrivons une méthode efficace pour cribler les sites PTM en abattant sélectivement un site spécifique et en observant le phénotype résultant pour déduire sa fonction. En raison de son faible coût de synthèse et de son efficacité élevée, cette méthode surmonte les limites des technologies existantes, telles que la transfection plasmidique.

Introduction

Les protéines sont les principaux exécuteurs des activités de la vie, et leurs processus de régulation biologique impliquent deux aspects fondamentaux de la régulation de l’expression génique : la transcription des gènes et la traduction de l’ARNm. Cependant, au cours des dernières décennies, la modification post-traductionnelle (PTM) est devenue un autre mécanisme indispensable pour réguler les fonctions cellulaires¹. La phosphorylation, la PTM la plus connue des chercheurs, joue un rôle particulièrement important dans les fonctions physiologiques. Par exemple, après que la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) est phosphorylée par la kinase MEK aux sites Thr202 et Tyr204, sa conformation change, exposant le site actif, qui active les protéines cibles en aval, telles que les facteurs^{de transcription 2}. En revanche, lorsque le Ser9 N-terminal de GSK-3β est phosphorylé par la kinase Akt/PKB, sa poche de liaison au substrat est bloquée, entraînant une perte d’activité de la kinase³. L’ubiquitination est une autre PTM importante qui régule divers processus cellulaires par la fixation covalente des molécules d’ubiquitine aux protéines du substrat. L’ubiquitine contient 7 résidus de lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) et une méthionine N-terminale (M1). La liaison des chaînes d’ubiquitine à différents sites confère des destins différents aux protéines du substrat. La fonction principale de l’ubiquitination liée à K48 est de marquer les protéines du substrat pour la dégradation par le protéasome⁴. À l’inverse, la fonction principale de l’ubiquitination liée à K63 est d’engager la transduction non dégradative du signal, telle que la réparation des dommages à l’ADN, les réponses inflammatoires et l’endocytose⁵. Au cours des dernières années, avec les progrès rapides des technologies protéomiques, un nombre croissant de nouvelles PTM ont été découvertes. Au-delà de l’acétylation classique, de nouvelles acylations telles que la propionylation, la crotonylation et la glutarylation ont été identifiées⁶. Dans le domaine des modifications des histones, la lactosylation des histones interfère avec la modification de l’ARN m⁶A et l’homéostasie du microenvironnement immunitaire⁷. Dans le domaine des modifications non-histones, la réduction de la crotonylation de l’ATP5O est un facteur néfaste majeur dans la régulation négative du métabolisme des phospholipides⁸.

La réalisation de recherches sur la PTM nécessite de faire progresser systématiquement l’analyse du protéome⁹ de la PTM. Ce domaine englobe deux grandes directions de recherche : l’analyse des profils PTM au niveau de l’ensemble du protéome et l’identification complète des sites PTM d’une protéine spécifique. Bien que la spectrométrie de masse moderne puisse identifier efficacement divers types de PTM et les sites spécifiques, le criblage et la validation des sites fonctionnels clés restent un défi scientifique fondamental qui limite les progrès de la recherche. L’établissement de stratégies efficaces d’examen préalable des sites est la première étape vers la résolution du rôle des principaux sites réglementaires. Les méthodes traditionnelles consistent à construire des plasmides mutants pour des sites spécifiques (mutations inactivantes, mutations activatrices), à les introduire dans des cellules cibles par des techniques de transfection in vitro et à évaluer systématiquement les changements dans les indicateurs phénotypiques tels que la prolifération cellulaire, l’apoptose et le stress oxydatif. Cependant, cette stratégie se heurte à des obstacles techniques importants dans les modèles cellulaires transcriptionnellement silencieux comme les ovocytes et les systèmes de culture de tissus primaires. Bien que le système de transduction lentivirale ou adénovirale puisse résoudre partiellement le problème de l’efficacité de la transfection, son application se heurte à un double défi : des coûts économiques élevés et une faible efficacité de pénétration des modèles de tissus in vitro de particules virales. Alors que la stratégie de construction de souris mutantes est extrêmement durable et coûteuse. Dans l’ensemble, il est urgent d’élaborer des stratégies économiques et efficaces pour l’examen initial des sites PTM d’importance fonctionnelle.

Au cours des dernières années, notre équipe a développé et utilisé avec succès une technique de régulation descendante rapide du PTM appelée TAT-PIP, PEPTIDE inhibiteur de PTM conjugué au TAT, basée sur l’inhibition compétitive des polypeptides. Son principal avantage est son universalité et sa grande efficacité pour effectuer un criblage préliminaire de sites PTM fonctionnellement importants, ce qui constitue une base cruciale pour des analyses approfondies des mécanismes moléculaires des principaux sites PTM. Cette étude élucide systématiquement le cadre principal et le processus de mise en œuvre de TAT-PIP, et démontre son efficacité à réguler le niveau de PTM à un site spécifique à l’aide de données expérimentales représentatives.

Protocole

1. Conception de la séquence TAT-PIP

REMARQUE : Le TAT-PIP se compose de deux parties de peptides (Figure 1) : La partie N-terminale est TAT, CYGRKKRRQRRR, qui reste inchangée pour chaque TAT-PIP et peut aider à pénétrer efficacement dans les cellules cultivées in vitro ou les tissus in vivo ; la partie C-terminale est une séquence polypeptidique autour du site PTM spécifique (Figure 1, généralement de la lysine dans le symbole « K », en rouge surligné) d’une protéine objet. La longueur du PIP est d’environ 10 à 15 résidus AA (si elle est longue, le coût augmente ; si elle est plus courte, la spécificité diminue considérablement).

1. Optimisez la séquence de PIP grâce à l’analyse Blast (Figure 2).
   1. Connectez-vous à https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, cliquez sur la recherche de séquences de protéines.
   2. Copiez la séquence de protéines cible dans la fenêtre d’entrée de la séquence de requête .
   3. Dans Choisir la recherche, sélectionnez l’option Bases de données standard . Sélectionnez l’option blastp (protein-protein BLAST) dans la sélection du programme. Enfin, cliquez sur le bouton BLAST (Figure 2B).
   4. Sélectionnez des segments peptidiques avec une spécificité maximale comme PIP candidats.
2. Effectuez une comparaison d’homologie entre les humains et les souris pour le PIP final.
   1. Connectez-vous à https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, cliquez sur la recherche de séquences de protéines.
   2. Copiez les séquences de la protéine des espèces humaines et souris et collez-les dans la boîte de séquence d’entrée.
   3. Cliquez sur le bouton Soumettre pour obtenir les résultats.
   4. Sélectionnez un PIP avec une homologie de 100 % entre l’homme et la souris (Figure 2C).
3. Déterminer la composition du TAT-PIP, qui se compose du TAT N-terminal et du PIP C-terminal.

2. Synthèse et vérification de la qualité du TAT-PIP

1. Choisissez une entreprise ayant une vaste expérience des projets pour garantir une pureté peptidique d’au moins 98 % grâce à la spectrométrie de masse, en évitant les impuretés qui pourraient avoir un impact sur les expériences ultérieures.
   REMARQUE : Le niveau d’endotoxine du polypeptide doit être de ≤10 et il doit être exempt d’agents pathogènes.

3. L’application du TAT-PIP

1. Utilisez de l’eau ultra-pure exempte d’agents pathogènes pour dissoudre le TAT-PIP afin d’atteindre une concentration de base de 10 mg/mL. Distribuez le bouillon dans de petits tubes pour éviter les cycles répétés de gel-dégel, qui provoqueront une dénaturation partielle.
   REMARQUE : L’ajout de 1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) aidera à protéger la structure du TAT-PIP.
2. Traiter les cellules avec TAT-PIP.
   1. Cultiver des cellules embryonnaires humaines de rein 293T dans le milieu modifié Eagle’s de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO₂).
      REMARQUE : Après l’ensemencement, les cellules ont été cultivées pendant environ 12 h, et le traitement TAT-PIP a été effectué lorsque la confluence a atteint environ 70 %.
   2. Diluer le TAT dissous à 1 mg/mL à l’aide de PBS, puis l’ajouter directement au milieu de culture cellulaire à la dose appropriée (concentration finale recommandée du milieu de culture : 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL) pendant 24 h.
   3. Lavez les cellules avec le milieu de culture d’origine 3 fois.
   4. Effectuer une analyse par transfert Western pour vérifier l’étendue de la régulation négative de la PTM.
      REMARQUE : D’après l’expérience et les résultats expérimentaux subséquents, la concentration finale optimale de TAT-PIP est de 0,1 mg/mL.

4. Transfert Western

1. Préparer des échantillons de protéines cellulaires.
   1. Lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois, ajoutez 200 μL de tampon de lyse de dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) (avec ajout d’un inhibiteur de la protéase de fluorure de phénylméthylsulfonyle [PMSF]) dans la pastille cellulaire, et incubez pendant 5 minutes pour une lyse préliminaire, grattez-les avec un grattoir cellulaire.
   2. Sonicer le mélange à l’aide d’un broyeur à ultrasons à 12 % d’intensité d’énergie pendant 5 s.
   3. Réfrigérer le lysat cellulaire sur de la glace pendant 30 min et le centrifuger à 13400 g à 4 °C pendant 10 min.
   4. Transférez le surnageant contenant des protéines dans un tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 mL. Ajouter 1/4 de volume de tampon d’échantillon 5x au surnageant (concentration finale 1x).
   5. Agitez le mélange, chauffez-le à 95 °C pendant 5 min dans un thermostat sec et réfrigérez sur de la glace pendant 2 min.
   6. Mesurez la concentration totale de protéines à l’aide d’un test Bradford sur un Nanodrop.
2. Effectuer une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE).
   1. Utilisez un gel résolvant à 12 % et un gel empilable à 4 % pour le SDS-PAGE.
   2. Pipeter les échantillons de protéines dans les puits en fonction du volume spécifié.
   3. Allumez l’appareil d’électrophorèse et faites-le fonctionner d’abord à 80 V, 300 mA pendant 30 min pour aligner les bandes à l’interface entre les gels d’empilement et de résolution. Ensuite, exécutez à 120 V, 300 mA pendant 45 min pour résoudre les protéines.
   4. Transférez les protéines du gel vers la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide d’un appareil de transfert rapide.
3. Effectuez le blocage, l’incubation d’anticorps et la visualisation.
   1. Bloquer la membrane PVDF dans du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween 20 (TBST) et incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
   2. Incuber la membrane avec l’anticorps primaire dilué à 1:1000 dans du lait écrémé à 5 %/PBST pendant une nuit à 4 °C sur un rotateur.
   3. Lavez la membrane trois fois avec du TBST (10 min chacune).
   4. Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire dilué à 1:1000 dans du lait écrémé à 5 %/TBST à RT pendant 1 h.
   5. Lavez la membrane trois fois avec du TBST (10 min chacune).
   6. Exposez la membrane dans une série chronologique (5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s) pour obtenir l’image optimale sous un dispositif de chimiluminescence électrogénérée (ECL).

5. Validation fonctionnelle de TAT-PIP dans des cellules cultivées in vitro

1. Détecter les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) cellulaires.
   1. Plaque 293T cellules à une densité optimale de 1 x 10⁵ cellules/puits dans une plaque de culture 24 puits.
   2. Traitez les cellules avec l’histone 3 lysine 116 (0,1 mg/mL) (0,1 mg/mL) conjuguée au TAT, puis lavez les cellules avec du PBS.
   3. Incuber les cellules avec 10 μM de diacétate de dichloro-dihydro-fluorescéine (DCFH-DA) dans du DMEM sans sérum à 37 °C dans l’obscurité pendant 20 min.
   4. Capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée et mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide de la fonction Mesurer d’ImageJ.
      REMARQUE : Le jeu de filtres FITC a été utilisé, avec un filtre d’émission de 465-495 nm, un miroir dichroïque 505A et un deuxième filtre d’émission de 512-550 nm.
2. Essai de prolifération cellulaire
   1. Ensemencez 293T cellules à une densité optimale de 1 x 10⁵ cellules par puits dans une plaque de culture de 24 puits.
   2. Ajouter 10 μL de réactif CCK-8 dans chaque puits.
   3. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 h.
   4. Enregistrez l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques et soustrayez le signal de fond des puits vides (milieu + CCK-8).
   5. Normalisez les données pour calculer la viabilité cellulaire.
3. Détection des niveaux d’ATP cellulaire
   1. Lyser les cellules avec un tampon de lyse. Centrifuger le lysat à 12 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Prélever le surnageant pour une analyse ultérieure.
   2. Diluez la solution étalon d’ATP avec le tampon de lyse pour créer un gradient de concentration de 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM et 5 μM.
   3. Ajouter 20 μL de solution de détection d’ATP dans chaque puits contenant soit le surnageant cellulaire, soit l’étalon ATP.
   4. Mesurez immédiatement le signal luminescent à l’aide d’un lecteur de microplaques.
      1. Cliquez sur Disposition de plaque, sélectionnez le modèle de plaque correspondant dans Modifier le modèle de plaque pour configurer les échantillons (normes et échantillons).
      2. Cliquez ensuite sur Protocole sur la gauche, choisissez le bouton Chimiluminescence , puis cliquez sur Démarrer pour lancer la détection.
   5. Générez une courbe standard à partir des signaux luminescents des étalons ATP et utilisez-la pour quantifier la concentration d’ATP dans le surnageant de cellule.

Résultats

Cette étude décrit une stratégie qui utilise TAT-PIP pour réguler à la baisse le niveau de PTM d’une protéine cible à un site spécifique en fonction de l’inhibition compétitive. Dans un exemple typique, le TAT-PIP est ici renommé spécifiquement THCIP. Il comprend deux modules fonctionnels : (1), le peptide pénétrant les cellules N-terminales TAT (CYGRKKRRQRRR), qui permet au THCIP de pénétrer dans les cellules ; (2) la séquence C-terminale autour de K116 de H3, AIHAKRVTIMPKD, qui entre spécifiquement en compétition avec ...

Discussion

Dans ce protocole, les étapes suivantes sont essentielles. Tout d’abord, la conception TAT-PIP tient compte de la spécificité du peptide. Deuxièmement, optimiser l’application et la concentration finale ; La concentration optimisée doit être soigneusement testée pour obtenir un renversement efficace et rapide. Troisièmement, pour vérifier l’effet du TAT-PIP, il est recommandé de réaliser plusieurs expériences plutôt que de s’appuyer sur une seule expérience pour confirmer ses effets supp...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d’imagerie multifonctionnel automatique	Tanon	4600	Le posemètre identifie et visualise les bandes protéiques cibles en détectant les signaux de fluorescence ou de chimiluminescence sur la membrane après le traitement de développement.
Kit de comptage cellulaire-8	GLPBIO	GK10001	Basée sur la corrélation entre la viabilité métabolique cellulaire et le nombre de cellules, cette méthode évalue la capacité de prolifération des cellules en mesurant la capacité de réduction des cellules en réactifs CCK-8
s Aigle modifié' (DMEM)	Gibco	11995065	Dulbecco (DMEM) est un milieu basal largement utilisé pour soutenir la croissance d’un large éventail de cellules de mammifères.
Substrat chimiluminescent ECL	Biosharp	BL520B	ECL génèrent des signaux lumineux par des réactions de chimiluminescence qui permettent la détection de protéines ou d’acides nucléiques spécifiques.
Appareil d’électrophorèse	Tanon	EPS600	Le rôle principal de l’appareil d’électrophorèse est de séparer et d’analyser les macromolécules biologiques &zwnj ;
Kit de dosage ATP amélioré	Beyotime	S0027	Le kit peut détecter efficacement le niveau d’ATP des échantillons Sérum
fœtal bovin (FBS)	Gibco	16000-044	sérum fœtal bovin (FBS) fournit des nutriments essentiels et des facteurs de croissance pour le maintien et la croissance cellulaires.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	L’appareil est très efficace et il est capable de réaliser rapidement le transfert de protéines du gel de polyacrylamide à la membrane PVDF en 15 minutes
Microscope à fluorescence inversée Olympus	Corporation	IX73	La microscopie à fluorescence utilise la lumière ultraviolette comme source de lumière pour irradier l’objet examiné afin de lui faire émettre une fluorescence, puis d’observer la forme et l’emplacement de l’objet sous le microscope.
Spectrophotomètre UV-Vis microvolume NanoDrop2000	Thermo Scientific	2000	NanoDrop a été utilisé pour déterminer la concentration de l’ADN ou de l’ARN
de la membrane PVDF	BioRAD	1620177	Ce type de membrane PVDF présente une excellente résistance chimique et une capacité de liaison élevée aux protéines
.
TAT-conjugater H3K16 Peptide inhibiteur de crotonylation	Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD	CN218107533U	Il peut spécifiquement entrer en compétition avec l’endogène H3 pour être crotonylé à K16  ;
TBST	Biosharp	BL602A	TBST peut nettoyer les substances non pertinentes sur la membrane, réduire les erreurs expérimentales et garantir la précision des résultats expérimentaux &zwnj ;
Broyeur à ultrasons	LICHEN	LC-AUD-150P	Les principales fonctions de l’appareil comprennent la fragmentation cellulaire, la dispersion des particules et l’émulsification
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	peuvent réaliser une analyse quantitative à haut débit d’échantillons biologiques en détectant les signaux optiques (tels que l’absorbance, la fluorescence ou la luminescence) des échantillons dans les microplaques