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Article de méthode

Fonction artérielle rénale et histopathologie liées au plasma et aux métabolites fécaux chez les patients atteints d’insuffisance cardiaque

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DOI :

10.3791/68583

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9 septembre 2025

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1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour le développement d’une plateforme multimodale permettant d’élucider la dysfonction vasculaire rénale induite par les métabolites cardiaques dans le syndrome cardiorénal.

Résumé

Le microbiote intestinal et ses co-métabolites hôte-microbe associés sont de plus en plus reconnus comme des régulateurs clés de l’équilibre métabolique systémique et de l’axe cardiorénal, en particulier dans le contexte du syndrome cardiorénal. Bien que les preuves cliniques indiquent que la dysfonction cardiaque peut initier ou exacerber des altérations pathologiques rénales, les principales molécules de signalisation métabolique médiant l’axe cardiorénal et leurs mécanismes sous-jacents restent insaisissables. Cette étude établit une nouvelle plateforme de recherche systématique intégrant les signatures cardiométaboliques à l’analyse de la fonction vasculaire rénale, comprenant : (1) l’isolement et l’extraction de métabolites plasmatiques/fécaux de patients atteints d’insuffisance cardiaque ; (2) Techniques d’isolement vasculaire rénal ex vivo et de culture primaire ; (3) Un cadre d’évaluation multimodal des interactions métaboliques cardiorénales, intégrant des tests fonctionnels vasculaires, des tests biochimiques moléculaires pour les marqueurs de lésions vasculaires rénales et des analyses histopathologiques. Par rapport aux témoins sains, les métabolites des patients atteints d’insuffisance cardiaque ont altéré la fonction vasculaire rénale et induit des réponses inflammatoires, mettant en évidence leur potentiel en tant que biomarqueurs fonctionnels du syndrome cardiorénal. Cette étude ne se concentre pas sur un métabolite spécifique ; Par conséquent, il sera nécessaire d’identifier et de valider davantage les types spécifiques de métabolites qui exercent des effets pathogènes dans les études futures utilisant des techniques analytiques telles que la LC-MS/MS et la RMN. L’application de cette plateforme a révélé que les métabolites associés aux maladies cardiaques altèrent la fonction vasculaire rénale et l’homéostasie. Ces résultats fournissent un aperçu mécaniste des moteurs métaboliques des interactions cardiorénales et offrent un outil translationnel pour identifier de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques.

Introduction

Le syndrome cardiorénal (SRC) est une affection pathologique complexe caractérisée par des lésions bidirectionnelles entre le cœur et les reins. L’interdépendance complexe entre ces deux organes a été décrite pour la première fois par Robert Bright en 1836, qui a systématiquement documenté des changements structurels significatifs dans le cœur associés à une maladie rénale avancée1. La prévalence du SRC est fortement liée à la coexistence des maladies cardiovasculaires (MCV) et des maladies rénales chroniques (IRC). Des études indiquent qu’environ 30 % des patients atteints d’insuffisance cardiaque souffrent également d’IRC, tandis que 44 à 51 % des décès chez les patients atteints d’IRC sont directement attribués à des événements cardiovasculaires2.

La gestion de CRS présente plusieurs défis importants. Tout d’abord, les soins cliniques restent fragmentés, avec un manque de coordination interdisciplinaire et de mécanismes d’alerte précoce, ce qui entraîne souvent des interventions retardées lors de la phase3 de décompensation. Deuxièmement, les stratégies de traitement actuelles sont confrontées à un dilemme paradoxal. Les thérapies conventionnelles, telles que les diurétiques et les inhibiteurs du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS), peuvent soulager les symptômes de l’insuffisance cardiaque4 ; cependant, leur utilisation prolongée ou à forte dose peut activer le SRAA et le système nerveux sympathique (SNS), exacerbant l’hypoxie rénale et la fibrose, contribuant finalement à la résistance aux diurétiques et à l’aggravation de la fonction rénale5. De même, bien que les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (IECA) et les antagonistes des récepteurs de l’angiotensine (ARA) puissent atténuer les lésions cardiorénales, leur utilisation clinique est souvent limitée en raison de préoccupations concernant une créatinine sérique élevée ou une hyperkaliémie, avec seulement 30 à 40 % des patients capables de tolérer un traitement à long terme6.

Compte tenu de ces défis, il est urgent d’identifier des biomarqueurs précoces efficaces et de mieux comprendre la pathogenèse du SRC afin de faciliter la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, les limites actuelles dans l’identification de médiateurs exploitables de la diaphonie cardiorénale - en particulier les métabolites spécifiques à la maladie qui lient directement la dysfonction cardiaque aux lésions vasculaires rénales - entravent les progrès dans la résolution de ces besoins cliniques non satisfaits. De nouvelles preuves suggèrent que les métabolites associés aux maladies cardiaques peuvent servir à la fois de biomarqueurs diagnostiques et de moteurs mécanistes du SRC en reprogrammant l’homéostasie vasculaire rénale, mais leurs rôles spatio-temporels dans l’initiation ou l’amplification des lésions rénales restent mal caractérisés 7,8,9. Des études récentes ont démontré que les métabolites endogènes tels que les céramides peuvent aggraver activement l’inflammation et le remodelage vasculaires, en particulier dans des conditions cardiorénales, soulignant la pertinence plus large de la détection des métabolites dans la pathologie vasculaire10.

Parmi les compartiments rénaux touchés par le SRC, le système vasculaire est de plus en plus reconnu comme une cible primaire et précoce des blessures. Le dysfonctionnement endothélial dans la microcirculation rénale - marqué par une biodisponibilité altérée de l’oxyde nitrique, un stress oxydatif et une expression élevée de médiateurs pro-inflammatoires et pro-thrombotiques - contribue à la raréfaction microvasculaire, à l’augmentation de la perméabilité vasculaire et à l’hypoxie régionale11. En parallèle, les cellules musculaires lisses vasculaires (CMSV), qui sont essentielles à la régulation du tonus artériel et de la conformité, sont également vulnérables à la dérégulation métabolique dans le SRC. De plus en plus de preuves indiquent que les métabolites associés à la maladie peuvent perturber la contractilité des CMVS, favoriser un remodelage inadapté et contribuer à l’augmentation de la rigidité vasculaire et à l’altération de la perfusion rénale. Malgré leur rôle fondamental, les mécanismes de dysfonctionnement vasculaire induits par les muscles lisses restent sous-explorés dans les modèles CRS actuels 8,12. Ces changements physiopathologiques exacerbent non seulement les lésions rénales, mais favorisent également l’activation neurohormonale inadaptée et les perturbations hémodynamiques systémiques, altérant davantage la fonction cardiaque et perpétuant la progression du SRC13. Ainsi, le ciblage des lésions vasculaires rénales offre une fenêtre informative mécaniste sur la pathogenèse précoce du SRC et fournit une orientation rationnelle pour l’étude des interactions métaboliques cœur-rein.

Pour combler ces lacunes, notre étude privilégie l’identification systématique et la validation fonctionnelle des métabolites associés à l’insuffisance cardiaque en tant que régulateurs centraux de la progression du SRC. Ce travail comble le fossé critique entre la découverte de biomarqueurs observationnels et la recherche sur la pathogenèse mécaniste en délimitant comment ces métabolites induisent un dysfonctionnement vasculaire rénal, activent des cascades inflammatoires et compromettent les mécanismes de réparation tissulaire. Les modèles traditionnels utilisés pour étudier le SRC - y compris les modèles animaux, les cultures cellulaires in vitro et les organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) - ont chacun des limites14. Les modèles animaux souffrent de différences interespèces qui limitent la pertinence clinique. Les cultures in vitro manquent d’intégration au niveau des organes, tandis que les organoïdes dérivés des iPSC, bien que capables de modéliser les interactions entre les cellules épithéliales tubulaires des cardiomyocytes, restent fonctionnellement immatures et sont limités aux premiers stades de développement15. De plus, les systèmes organoïdes vasculaires actuels sont principalement constitués de monocouches endothéliales ou de microvaisseaux primitifs, dépourvus de la couche musculaire lisse contractile et des lectures fonctionnelles nécessaires pour évaluer les réponses au niveau des vaisseaux aux lésions métaboliques16.

En revanche, notre plateforme utilise des métabolites cardiaques d’origine humaine et une vasculature rénale humaine ex vivo , permettant des artères rénales humaines ex vivo physiologiquement pertinentes et structurellement intactes, permettant une analyse physiologiquement pertinente et mécaniste informative des interactions métaboliques cardiorénales à l’interface vasculaire. Cela offre un avantage unique dans la modélisation de la communication métabolique inter-organes qui sous-tend la progression du syndrome cardiorénal. Notre plateforme de recherche cardiorénale intégrée pionnière met en synergie trois innovations fondamentales : le profilage métabolomique des métabolites plasmatiques/fécaux dérivés de l’insuffisance cardiaque, les systèmes d’isolement/culture rénovasculaire ex vivo et l’évaluation fonctionnelle-moléculaire-histopathologique multimodale. Chaque composant de cette plateforme a été optimisé pour sa reproductibilité et sa pertinence translationnelle, y compris l’utilisation de 200 μL de plasma ou de 0,1 g de matières fécales par échantillon, l’incubation de segments d’artère rénale humaine de 2 mm à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant une période allant jusqu’à 24 h, et la détection quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (qRT-PCR) basée sur la détection de marqueurs de lésions vasculaires. Ce système déchiffre non seulement le potentiel diagnostique des signatures des métabolites, mais relie également directement leurs contributions causales à la pathologie du SRC, permettant l’identification de cibles thérapeutiques par le biais d’une cartographie au niveau moléculaire de la dérégulation métabolique inter-organes. En faisant le lien entre la découverte mécaniste et l’application clinique, ce paradigme à double orientation fait passer la prise en charge du SRC du contrôle réactif des symptômes à des interventions proactives axées sur les biomarqueurs.

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Protocole

Les protocoles expérimentaux et les méthodologies de cas utilisés dans cette étude ont été approuvés éthiquement par le service d’urologie du premier hôpital de l’Université de Pékin (Code d’éthique : 2023yan500-002) et de l’Hôpital universitaire de médecine de l’Union de Pékin (approbation n° I-23PJ585), dans le strict respect des principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki. Pour cette étude, nous avons recruté des patients hommes ou femmes hospitalisés au Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) à partir de juillet 2019, diagnostiqués avec une insuffisance cardiaque (IC) par au moins deux cardiologues expérimentés. Au total, quatre patients atteints d’IC (HF1-HF4) ont été inclus pour l’extraction du plasma et des métabolites fécaux. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les sujets avant leur inclusion dans la recherche. L’appareil expérimental et les réactifs sont présentés dans la Table des matériaux.

1. Traitement du plasma et des échantillons fécaux - extraction des métabolites polaires

  1. Prélèvement d’échantillons
    1. Prélever tous les échantillons de plasma et de matières fécales dans des tubes de prélèvement stériles et prérefroidis et les congeler immédiatement dans de l’azote liquide après la collecte. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’au traitement.
    2. Pour assurer la stabilité des métabolites, traitez tous les échantillons en un seul cycle de congélation-décongélation et ne laissez pas l’intervalle de temps entre le prélèvement et l’extraction de l’échantillon dépasser 2 semaines.
      REMARQUE : Ces mesures ont été prises pour minimiser la dégradation des métabolites et assurer la reproductibilité dans les analyses métabolomiques en aval.
    3. Extraire les métabolites des échantillons fécaux et plasmatiques en suivant les étapes 1.3 ou 1.4 du protocole, respectivement.
  2. Population étudiée
    1. Prenez des mesures de base de la tension artérielle et enregistrez les antécédents médicamenteux de tous les participants.
    2. Prélever des échantillons de patients avant toute détérioration clinique aiguë, à l’exclusion des personnes présentant des comorbidités métaboliques majeures (p. ex., diabète, hypertension primaire) afin de minimiser les facteurs de confusion dans l’analyse métabolomique (tableau supplémentaire S1).
    3. Obtenir des informations cliniques pour chaque sujet à l’aide de procédures standard.
  3. Extraction plasma
    1. Centrifuger le sérum brut à 14 000 × g pendant 10 min (4-8 °C). Recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.
    2. Ajoutez du méthanol réfrigéré (-80 °C) de qualité HPLC pour atteindre une concentration de méthanol de 80 % (v/v). Mélanger délicatement par inversion et incuber à -80 °C pendant 6 à 8 h.
    3. Centrifuger à 14 000 × g pendant 10 min (4-8 °C). Transférez le surnageant méthanolique dans des tubes frais pour le profilage métabolomique.
      REMARQUE : Placez les échantillons de plasma après le prélèvement dans un congélateur à -80 °C dans les 2 h et minimisez les cycles de gel-dégel pour assurer la stabilité des métabolites.
  4. Extraction fécale
    1. Ajouter 500 μL de méthanol de qualité HPLC (prérefroidi à -80 °C) à des échantillons fécaux frais ou congelés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Homogénéiser à l’aide d’un micropilon ou d’un homogénéisateur tissulaire sur de la glace sèche pendant 1 à 2 min, suivi d’un vortex (1 min à 4-8 °C) et d’une incubation à -80 °C pendant 4 h.
    2. Centrifuger à 14 000 × g pendant 10 min (4-8 °C) à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée. Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL ; Conserver à -80 °C jusqu’à l’étape 1.4.4.
    3. Remettez le granulé en suspension avec 400 μL de méthanol HPLC pré-refroidi (-80 °C). Agiter abondamment (1 min à 4-8 °C) et incuber à -80 °C pendant 30 min.
    4. Centrifugation répétée (14 000 × g, 10 min, 4-8 °C). Combinez les surnageants des deux phases d’extraction.
    5. Effectuer une centrifugation finale par clarification (14 000 × g, 10 min, 4-8 °C). Transférez le surnageant purifié dans des tubes stériles de 1,5 mL pour l’analyse en aval.
      REMARQUE : Placez les échantillons fécaux après le prélèvement dans un congélateur à -80 °C dans les 2 h et minimisez les cycles de congélation-décongélation pour assurer la stabilité des métabolites.

2. Isolement de l’artère rénale

  1. Sélection des participants et prélèvement de tissus
    1. Dépistage du carcinome rénal chez les patients subissant une néphrectomie radicale. N’incluez que les personnes âgées de ≥ 18 ans sans comorbidités métaboliques (p. ex., hypertension primaire, diabète sucré). Lors de l’opération, prélever un parenchyme rénal histologiquement normal situé à au moins 3 cm des bords de la tumeur.
    2. Immerger immédiatement les échantillons récoltés dans un tampon oxygéné Krebs-Henseleit (4 °C, pH 7,4 ; composition en mM : 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 25,0 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,0 glucose). Terminez les procédures d’isolement dans les 6 heures suivant l’intervention.
  2. Préparation des tissus rénaux
    1. Effectuer une coupe coronale dans un tampon de Krebs à 4 °C pour obtenir des échantillons héminéphriques contenant des structures hilaires intactes. Effectuer une microdissection à l’aide d’un système stéréomicroscopique (grossissement de 40x) pour exposer les branches des artères arquées rénales et identifier les artères arquées.
  3. Dissection microvasculaire
    1. Isolez précisément les segments artériels grâce à l’ablation séquentielle du tissu adventice périvasculaire à l’aide de ciseaux microcornéens.
    2. Préserver les segments artériels d’un diamètre d’environ 500 μm.
    3. Minimisez les contraintes de cisaillement endothéliales grâce à une manipulation sans tension à l’aide de micro-pinces. Réaliser la dissection dans des conditions d’hypothermie (4 °C) avec un tampon Krebs renouvelé toutes les 15 min pour préserver le pH physiologique et l’homéostasie ionique.
      REMARQUE : La quantification explicite des dimensions artérielles et de la composition du tampon, un flux de travail thermiquement régulé de l’approvisionnement (4 °C) au traitement (4 °C) et une dissection microvasculaire complète dans les 6 heures suivant le prélèvement de l’échantillon garantissent une viabilité tissulaire et une intégrité fonctionnelle optimales.

3. Incubation de l’artère rénale avec métabolites de lésions cardiaques

  1. Préparation du tissu vasculaire : Disséquez les artères rénales par voie microchirurgicale dans des conditions stériles et retirez méticuleusement le tissu conjonctif périvasculaire adhérent à l’aide d’une pince ophtalmique fine. Sectionnez les artères rénales isolées en segments de 2 mm à l’aide de microciseaux stériles pour une culture organotypique ultérieure.
  2. Décontamination antibiotique : Laver les segments vasculaires pendant 3 x 5 minutes avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) complétée par un cocktail triple antibiotique/antimycosique pour minimiser la contamination microbienne et assurer la stérilité avant l’exposition aux métabolites.
  3. Regroupement expérimental : Attribuez au hasard des segments vasculaires à quatre cohortes expérimentales et transférez-les sur des plaques de culture à 24 puits contenant 500 μL de milieu Eagle modifié de Dulbecco par puits.
  4. Intervention métabolite
    1. Ajouter les métabolites des groupes suivants : 1) Métabolites sains témoins dérivés du plasma (HC-P) ; 2) Métabolites dérivés du plasma des patients atteints d’insuffisance cardiaque (HF-P) ; 3) Métabolites sains dérivés de matières fécales témoins (HC-F) ; 4) Métabolites dérivés des matières fécales des patients atteints d’insuffisance cardiaque (HF-F).
    2. Reconstituer les extraits de métabolites dans du méthanol (qualité HPLC) et administrer 10 μL de chaque extrait dans le puits correspondant de la plaque de culture à 24 puits, qui contient 500 μL de milieu Eagle modifié de Dulbecco et des segments de l’artère rénale (concentration finale du solvant de 2 % (v/v)). Ajouter des volumes équivalents de véhicule (mélange méthanol/PBS) dans les puits de contrôle.
  5. Conditions de culture : Incuber les assemblages de plaques dans des conditions de culture cellulaire standard (37 °C, 5 % CO2, 95 % d’humidité) pendant 24 h à l’aide d’un incubateur humidifié.

4. Dosage de l’anneau artériel rénal

  1. Suspension et fixation de l’anneau artériel rénal
    1. Préparation du fil : Enfilez deux fils parallèles en acier inoxydable de 2 cm (pré-équilibrés en Krebs, 95 % O2/5 % CO2) à travers la lumière artérielle sous microscopie optique, en assurant une saillie égale du fil aux deux extrémités.
    2. Monture Myograph : Allumez le système de chauffage et le gaz pour maintenir la température physiologique et l’oxygénation. Fixez les fils horizontalement dans un bain de fil myographe à température contrôlée (Krebs, 95 % O2/5 % CO2). Ajustez les boutons à vis pour maintenir la relaxation naturelle du récipient.
  2. Détermination de la tension initiale optimale avec normalisation spécifique au vaisseau
    REMARQUE : La tension au repos a été ajustée à l’aide d’une procédure de normalisation afin de normaliser les conditions de base, d’optimiser la réactivité du navire et d’assurer la reproductibilité. Équilibrez pendant 30 min avant de procéder à la normalisation.
    1. Sélectionnez les paramètres de normalisation dans le menu DMT , à l’aide des paramètres suivants : étalonnage de l’oculaire : 1 mm/div ; pression cible : 13,3 kPa ; Rapport IC1/IC100 : 0,9 °C ; moyenne en ligne : 3 s ; temps de retard : 60 s.
      REMARQUE : Des informations supplémentaires sur l’historique et la configuration du système sont fournies dans le document17 référencé.
    2. Pour normaliser un navire, sélectionnez le canal qui vous intéresse et remplissez l’écran de normalisation avec des données. Réglez les points finaux des tissus en fonction de la lecture du micromètre et d’un diamètre de fil de 40 μm.
    3. Appliquez l’étirement passif et attendez 3 min. Administrez 60K+ pour induire une contraction médiée par le potassium et attendez que la contraction atteigne un plateau. Rincer la préparation 3 x 5 min avec la solution Krebs pour laver le 60K+. Calculez la force active en soustrayant la force passive à chaque niveau d’étirement de la force induite par le potassium enregistrée sur la trace.
    4. Répétez l’étape 4.2.3 jusqu’à ce que la force active maximale soit atteinte. Définir la tension de repos optimale comme le niveau produisant une tension active maximale dans chaque artère, avec des réponses maximales à un K+ élevé utilisé comme contractions de référence.
    5. Équilibrez l’anneau artériel pendant 10 minutes avant de poursuivre les expériences.
      REMARQUE : En raison de l’importante variabilité interindividuelle des grades, des épaisseurs et des origines des vaisseaux, normalisez chaque vaisseau sanguin individuellement pour assurer la reproductibilité. Utilisez le module de normalisation du système de myographe de fil pour déterminer la tension de base appropriée en fonction du diamètre passif et des propriétés mécaniques de chaque récipient. Appliquez la procédure de manière cohérente sur tous les échantillons avant les tests fonctionnels.
  3. Détection de la réactivité des anneaux artériels rénaux
    1. Pour étudier les effets de différents métabolites sur la contractilité vasculaire, effectuez des tests de fonction de contraction vasculaire en utilisant des artères rénales incubées avec du plasma extrait et des métabolites fécaux de volontaires sains et de patients atteints d’IC pendant 12 h. Pour plus de détails, reportez-vous à la section 3.
    2. Utilisez 60K+ pour provoquer une contraction médiée par le potassium. Assurez-vous que chaque chambre contient 5 ml de solution Krebs.
    3. Pour déterminer les contractions dépendantes de la concentration induites par la phényléphrine (Phe) dans les anneaux artériels, ajoutez Phe par incréments d’un demi-log de 10-9 à 10-4 M. Commencez par la concentration de Phe la plus faible, introduisez-la dans la chambre et attendez une contraction régulière.
    4. Marquez l’endroit où une contraction régulière est atteinte (c’est-à-dire notez la valeur de tension au plateau), puis passez à la concentration suivante. Répétez l’opération jusqu’à ce que la concentration finale ait été ajoutée avec succès.
    5. Une fois l’expérience terminée, enregistrez le fichier de données et retirez les anneaux artériels. Nettoyez bien la chambre avec une solution d’acide acétique à 8 %, puis incubez pendant 3 min.
    6. Éteignez le système de chauffage et le gaz, en vous assurant que tout le liquide a été éliminé avant d’éteindre le gaz.

5. Examen histopathologique de l’artère rénale : coloration à l’hématoxyline-éosine

REMARQUE : Éliminez les réactifs dangereux et les déchets biologiques conformément aux protocoles de biosécurité et d’hygiène chimique de l’établissement. Plus précisément, le xylène et le paraformaldéhyde doivent être collectés dans des contenants de déchets chimiques étiquetés et scellables et stockés dans une hotte désignée avant d’être éliminés par des manipulateurs de déchets dangereux certifiés. L’acide acétique utilisé pour le nettoyage de la chambre myographe doit être neutralisé et éliminé conformément aux procédures standard d’élimination des déchets acides. Ne déchargez aucun de ces réactifs dans les éviers du laboratoire.

  1. Lavez les artères dans du PBS froid et fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4 % (pH 7,4) pendant la nuit. Couper des coupes en série à 4 μm et procéder à l’histologie.
  2. Incuber des sections de tissus montées sur des lames de verre dans un séchoir à lames à 60 °C pendant 1 h, puis transférer immédiatement au xylène. Immerger les sections dans du xylène (3 x 5 min).
  3. Soumettre les sections à une hydratation graduée à l’éthanol : 100 % d’éthanol (2 x 5 min), 95 % d’éthanol (1 x 5 min), 90 % d’éthanol (1 x 5 min), 80 % d’éthanol (1 x 5 min), 70 % d’éthanol (1 x 5 min), rincer à l’eau ultrapure (1 x 5 min).
  4. Colorer avec de l’hématoxyline (0,5 % p/v) pendant 5 min ; Puis rincer à l’eau courante.
  5. Différencier avec de l’alcool acide à 1 % (HCl-éthanol) pendant 5 à 10 s et rincer à l’eau courante.
  6. Bleuissez les sections dans de l’eau ammoniacale à 0,6 % et rincez à l’eau courante.
  7. Immerger les sections dans une solution d’éosine (1 % p/v) pendant 2 min.
  8. Déshydratez et éclaircissez les sections dans de l’éthanol à 95 % (2 x 5 min), de l’éthanol à 100 % (2 x 5 min) et du xylène (2 x 5 min).
  9. Sécher brièvement à l’air libre jusqu’à ce que la transparence optique soit obtenue, monter dans un support de montage, couvrir avec des lamelles et sceller les lamelles avec un support de montage neutre.
  10. Effectuer l’imagerie en fond clair et l’évaluation histomorphométrique.

6. Détection de biomarqueurs moléculaires associés à des lésions rénales

  1. Extraction de l’ARNm de l’artère rénale
    1. Ajouter le tissu vasculaire cryoconservé dans de l’azote liquide à 1 mL de réactif d’extraction d’ARN et transférer dans un homogénéisateur de tissus prérefroidi pour une homogénéisation complète.
    2. Ajouter 250 μL de chloroforme pour 100 μL de réactif d’extraction, agiter vigoureusement pendant 30 s et incuber pendant 10 min à 25 °C.
    3. Centrifuger à 12 000 × g (10 min, 4 °C) et transférer la phase aqueuse dans un tube frais.
    4. Ajouter 500 μL d’isopropanol à la phase aqueuse, mélanger par inversion et incuber pendant 20 min à 25 °C.
    5. Centrifuger à 12 000 × g (10 min, 4 °C) et jeter le surnageant.
    6. Lavez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 75 % (2 x 5 min), séchez la pastille d’ARN à l’air libre et mettez-la en suspension dans du DEPC-H2O (0,1 % v/v).
      REMARQUE : Vérifiez la pureté de l’ARN (OD260/OD280 = 1,9-2,0) et confirmez l’intégrité des bandes d’ARNr 28S/18S.
  2. Synthèse de l’ADNc
    1. Mélangez 2 μg d’ARNm + 1 μL d’amorce oligo(dT), ajustez à 8 μL avec DEPC-H2O (0,1 % v/v), chauffez à 70 °C pendant 5 min et refroidissez sur de la glace pendant 5 min.
    2. Préparez le mélange maître de transcription inverse dans 10 μL de 2 mélanges de réaction TS, 1 μL de mélange d’enzymes RT/RI et 1 μL de dissolvant d’ADNg. Ajouter les 12 μL de mélange maître aux 8 μL de mélange ARN/amorce de l’étape 6.2.1 pour obtenir un volume de réaction total de 20 μL.
    3. Chauffez le mélange à partir de l’étape 6.2.2. à 42 °C pendant 60 min et terminer le processus en chauffant à 85 °C pendant 5 min.
    4. Diluez les 20 μL de la réaction de transcription inverse en ajoutant 80 μL de H2O sans nucléases, ce qui donne un volume final de 100 μL (dilution 4x). Utilisez l’ADNc dilué comme matrice pour la PCR quantitative.
  3. Analyse PCR quantitative
    1. Configurez la réaction en mélangeant 2,0 μL de matrice d’ADNc, 0,5 μL d’amorce directe (10 μM), 0,5 μL d’amorce inverse (10 μM), 10 μL de mélange maître SYBR Green (2x) et 7 μL de ddH2O.
    2. Effectuer la PCR en utilisant les paramètres suivants : dénaturation initiale : 95 °C/3 min ; 40 cycles : 95 °C/30 s ; Tm-5 °C/30 s ; 72 °C/30 s ; courbe de fusion : 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
    3. Analysez l’expression des gènes par la méthode 2-ΔΔct. Les séquences d’amorces sont présentées dans le tableau supplémentaire S2.

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Résultats

La cohorte était composée de deux femmes et de deux garçons, âgés de 46 à 73 ans (âge moyen : 64,0 ans). Les mesures de base de la pression artérielle ont montré une pression artérielle systolique allant de 109 à 168 mmHg et une pression diastolique de 68 à 115 mmHg. Tous les patients atteints d’IC avaient des antécédents médicamenteux enregistrés, y compris des agents cardioprotecteurs courants tels que les bêta-bloquants, les statines et les antiplaquettaires, avec des variations individuelles dans les inhibiteurs du s...

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Discussion

Des recherches récentes en CRS ont identifié la reprogrammation métabolique comme un mécanisme pathologique clé, avec des métabolites régulant l’homéostasie vasculaire rénale 7,8,9. Bien que les VSMC jouent un rôle essentiel dans la régulation du tonus vasculaire et de l’observance dans le SRC, notre étude fournit des preuves directes que les métabolites associés aux lésions cardiaques altèrent ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key R&D Program of China (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 à Y. Z., 2021YFF0501404 à Y. L.), de la National Natural Science Foundation of China (82325004 et 92168114 à Y. Z., 82300286 à J. Z., 92168113 à E. D., 82170422 à Y. L.), Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (No. HH22KYZX0047 à E. D), China Postdoctoral Science Foundation (BX20220023, 2022M720288 à J. Z.), Natural Science Foundation of Beijing (7252157 à J. Z.). Fondation municipale des sciences naturelles de Pékin (7232096 à Y. L.), projet de recherche du troisième hôpital de l’Université de Pékin dans le laboratoire clé d’État de l’homéostasie et du remodelage vasculaires (Université de Pékin ; 2024-VHR-SY-07 à Y.Z.). La figure 1 a été créée avec Biorender.com avec des licences approuvées.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM à haute teneur en glucoseGibcoN° de catalogue : 06-1055-57-1-ACS
PBSSolarbioN° de catalogue : P1010
Pénicilline-Streptomycine-amphotéricine BThermo Fisher ScientificCat# 15240062
PhényléphrineMCERéf.#HY-B0769
Système de transcription inversePromegaN° de catalogue : A5001
Système stéréomicroscopiqueLeicaM80
SYBR Green master mixThermo Fisher ScientificCat# 4309155
Système de mesure de la tension vasculaireDMT620 millions d’habitants

Références

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