Article de méthode

Essai de perméabilité de la membrane des liposomes pour étudier les effets des groupes phosphate de phosphatidylinositol sur l’action membranotrope du venin PLA2

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DOI :

10.3791/68594

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26 septembre 2025

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une méthode rentable pour évaluer la perméabilité de la membrane liposomale avec une sensibilité et une résolution supérieures aux techniques conventionnelles. À l’aide d’une nouvelle réaction de substitution de ligand encapsulé, cette technique détecte les changements induits par la phospholipase A2 dans les membranes modèles. Facilement intégrée aux analyses standard, cette approche accessible améliore la résolution pour l’étude de la biophysique membranaire et des interactions avec les toxines.

Résumé

Nous avons mis au point un test nouveau, rentable et très sensible pour évaluer la perméabilité des membranes liposomales, basé sur des réactions de substitution de ligands impliquant des ligands encapsulés dans le volume interne des liposomes, que nous avons combiné avec un test d’activité hydrolytique (utilisant l’acylation de la coenzyme A) et une simulation de modélisation moléculaire pour déterminer si les phosphates du cycle inositol dans le phosphatidylinositol protègent les membranes contre les effets néfastes des enzymes exprimées de manière aberrante. L’expression aberrante des phospholipases A2 (PLA2) conduit à une démyélinisation des axones qui déclenche le développement de la sclérose en plaques et de la maladie d’Alzheimer. Pour imiter les effets du PLA₂ exprimé de manière aberrante, nous avons utilisé la sous-unité de base du venin de vipère PLA₂, HDP-2P. Le HDP-2P a été testé sur des liposomes de phosphatidylcholine (PC) enrichis en phosphatidylinositol, phosphatidylinositol-4-phosphate (PI-4-P) ou phosphatidylinositol-4,5-diphosphate (PI-4,5-P2). Alors que le HDP-2P a montré une activité hydrolytique minimale et une légère augmentation de la perméabilité dans les liposomes PC, l’enrichissement des liposomes PC avec de l’IP a amélioré à la fois l’hydrolyse et la perméabilité. Remarquablement, PI-4-P et PI-4,5-P₂ ont inhibé de façon spectaculaire l’activité hydrolytique de HDP-2P et ont complètement réduit la perméabilité. Des simulations de modélisation moléculaire ont révélé que les phosphates du cycle inositol du phosphatidylinositol bloquent stériquement l’accès des phospholipides au site actif de HDP-2P, empêchant ainsi l’hydrolyse. Les données in vitro et in silico suggèrent que les phosphatidylinositols phosphorylés sont associés à une activité réduite du PLA₂, indiquant un mécanisme potentiel pour atténuer l’activité excessive du PLA2 - probablement comme moyen de protéger les membranes cellulaires de la dégénérescence.

Introduction

Le phosphatidylinositol (PI) est un phospholipide anionique constitué d’un squelette d’acide phosphatidique lié à l’inositol, un cycle hexahydroxy à six carbones, via un groupe phosphate. L’inositol peut être converti de manière réversible en phosphoinositides par phosphorylation aux positions 2, 3, 4, 5 et 6 du carbone1. L’IP et les phosphoinositides se trouvent dans les membranes plasmiques et les organites de diverses cellules animales, végétales et micro-organismes. Soixante-dix ans après leur découverte par Mable et Lowell Hokin 2,3,4, l’IP et les phosphoinositides font toujours l’objet de recherches approfondies visant à comprendre leurs mécanismes moléculaires et leur pertinence pour la santé humaine 5,6,7.

En dehors du tissu cérébral, les phosphoinositides sont généralement présents à de faibles concentrations, représentant environ 0,5 à 1 % des lipides totaux dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Les données publiées indiquent qu’il est peu probable que l’IP joue un rôle structurel majeur dans des conditions physiologiques1. Cependant, au cours des états pathologiques, les niveaux de PI et de phosphoinositides augmentent, et ils se retournent vers le feuillet externe de la membrane plasmique, indiquant que ces phospholipides peuvent être liés à la résistance à la maladie1. Bien que l’on ait longtemps pensé que l’IP joue un rôle physiologique moins important que les phosphoinositides, de nouvelles preuves soulignent l’importance de PI-4-P et PI-4,5-P2 dans divers processus physiologiques1. Ces processus comprennent la signalisation intracellulaire, la transduction du signal intercellulaire 8,9,10, le trafic membranaire 11,12,13, la modulation de l’expression génique 1, ainsi que la prolifération cellulaire14 et la survie1. Malgré cela, les mécanismes moléculaires par lesquels l’IP et les phosphoinositides pilotent ces processus restent mal compris.

L’IP et les phosphoinositides sont abondants dans les cellules du tissu cérébral, où ils constituent environ 10 % du total des phospholipides, bien que leurs niveaux puissent augmenter transitoirement dans les premiers stades des maladies cérébrales, ce qui suggère que les phosphoinositides peuvent contrecarrer le développement de pathologies neurologiques1 telles que la sclérose en plaques et la maladie d’Alzheimer déclenchées par la démyélinisation axonale causée par l’activité aberrante du PLA2s 15, 16 et 17. Ces enzymes appartiennent aux différentes classes et groupes, y compris le groupe IIA, la phospholipase sécrétoire A2 (sPLA2)15. Des niveaux élevés de ce groupe d’enzymes se trouvent dans le liquide céphalo-rachidien des patients atteints de sclérose en plaques et d’Alzheimer, où ils contribuent à la dégradation des membranes de myéline, conduisant à la démyélinisation15. Il a également été rapporté que les sPLA2des venins de serpent inhibent la transmission au niveau des synapses neuromusculaires18,19, provoquant des troubles du système nerveux central et affectant négativement le système neuromusculaire périphérique20.

Dans cette étude, nous avons cherché à savoir si l’IP et les phosphoinositides peuvent protéger les membranes phospholipidiques modèles contre les effets des enzymes sPLA2 exprimées de manière aberrante. Les membranes modèles ont été constituées de phosphatidylcholine (PC), le phospholipide le plus abondant dans toutes les membranes cellulaires de mammifères21, enrichi d’un rapport molaire de 20 % de PI, PI-4-P ou PI-4,5-P2. Pour imiter les effets des enzymes sPLA2 exprimées de manière aberrante sur des membranes modèles, nous avons utilisé la sous-unité de base HDP-2P de l’enzyme neurotoxique PLA2 PLA 2 du groupe IIA du groupe IIA, dont l’activité hydrolytique a déjà été étudiée sur des membranes de myéline modèle23.

Pour ce travail, nous avons développé une nouvelle approche pour étudier les changements dans la perméabilité des membranes liposomiques affectées par HDP-2P. La nouvelle méthode est basée sur une réaction de substitution de ligand dans une solution de CuSO4 à l’extérieur des liposomes, impliquant un ligand NH3 piégé à l’intérieur des liposomes. Si la perméabilité membranaire induite par HDP-2P permet la fuite de NH3 des liposomes, l’ammoniac libéré substituera quantitativement quatre molécules d’eau dans des ions de cuivre hydratés via la réaction : [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l). Cet échange de ligands produit une augmentation caractéristique de la densité optique de la solution mesurable par spectrophotométrie (λ = 600 nm), servant de lecture quantitative des changements de perméabilité membranaire. Notre approche basée sur la substitution de ligands démontre une sensibilité supérieure pour l’évaluation de la perméabilité membranaire par rapport aux techniques conventionnelles telles que la RMN 1H 23,24,25,26,27,28 et les tests de transport d’ions29, tout en offrant l’avantage supplémentaire de ne pas nécessiter d’instrumentation coûteuse. Cette méthode simple et rentable, appliquée conjointement avec les mesures d’activité hydrolytique HDP-2P et la simulation in silico de la liaison de PI, PI-4-P et PI-4,5-P2 à la surface moléculaire de HDP-2P, nous a permis de conclure que les phosphates du cycle inositol dans PI abolissent les effets perturbateurs de HDP-2P sur les membranes PC enrichies en PI-4-P ou PI-4, 5-P2. Si cette découverte est confirmée par d’autres études, la capacité des phosphates du cycle inositol dans l’IP à protéger contre les effets nocifs des protéines cellulaires à action anormale, contribuant potentiellement à la stabilité de la membrane dans des conditions pathologiques impliquant une activité protéique aberrante, pourrait ouvrir la voie au développement de nouveaux produits pharmaceutiques pour le traitement de troubles neurologiques tels que la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaques.

Protocole

1. Simulation in silico de l’interaction HDP-2P avec PI et phosphoinositides à l’aide d’un logiciel de modélisation moléculaire

  1. Installation et préparation du logiciel
    1. Installez l’éditeur de dessin chimique référencé pour la construction de molécules de ligand, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S1A.
    2. Installez le logiciel de modélisation moléculaire pour l’amarrage moléculaire du ligand au récepteur.
    3. Installez les outils d’amarrage automatisés pour la préparation des ligands et des récepteurs.
    4. Comme le logiciel de simulation de modélisation moléculaire dépend de l’environnement Python, installez Python.
  2. Préparation du ligand
    1. Tout d’abord, utilisez l’éditeur de dessins chimiques pour construire les coordonnées atomiques des structures moléculaires de PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, cardiolipin et phosphatidylsérine.
      REMARQUE : L’exemple de protocole dans les étapes suivantes de la préparation du ligand décrit les étapes uniquement pour PI.
    2. Construisez la structure moléculaire de PI à l’aide de l’éditeur de dessin chimique, comme illustré dans le Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S1B et enregistrez le fichier au format PDB comme indiqué dans le Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S2.
    3. Ouvrez le fichier PDB dans le logiciel de l’outil d’ancrage automatisé, comme illustré dans le fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S3A.
    4. Ajoutez les atomes d’hydrogène comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S3B et sélectionnez soit les atomes polaires, soit tous les atomes d’hydrogène comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S4A.
      REMARQUE : Une fois l’amarrage PI terminé avec HDP-2P, sélectionnez uniquement les atomes d’hydrogène polaires pour simplifier la visualisation des liaisons polaires ou hydrogène.
    5. Définissez la molécule PI comme ligand pour le logiciel de l’outil d’amarrage automatisé, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S4B.
    6. Enregistrez le ligand en tant que fichier PDBQT comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S5A. Assurez-vous de faire en sorte que toutes les liaisons soient rotatives.
  3. Préparation du récepteur
    1. Télécharger le fichier PDB de la phospholipase A2 HDP-2 (code PDB 2I0U), composé de deux monomères, l’un est acide, enzymatiquement inactif, A, et l’autre est basique, enzymatiquement actif, E. Pour supprimer le monomère A inactif enzymatiquement, importez le fichier 2I0U dans le logiciel de modélisation moléculaire (Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S5B), sélectionnez tous les atomes du monomère A (Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S6A), puis allez dans Modifier et supprimer tous les atomes du monomère A (Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S6B). Conserver le monomère E, qui est maintenant désigné comme le récepteur, est actif enzymatiquement.
    2. Ouvrez le fichier PDB du récepteur HDP-2P dans le logiciel de l’outil d’ancrage automatisé, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S7.
    3. Retirez toutes les molécules d’eau comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S8A.
    4. Ajoutez les atomes d’hydrogène comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S8B. Veuillez noter qu’après l’achèvement de l’amarrage du HDP-2P avec PI, seuls les hydrogènes polaires doivent être sélectionnés pour simplifier la visualisation des liaisons polaires et hydrogène.
    5. Définissez le HDP-2P comme récepteur, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S9A, et enregistrez-le en tant que fichier PDBQT. Assurez-vous que le récepteur est réglé sans liaisons rotatives.
  4. Configuration des paramètres d’ancrage
    1. Ouvrez les fichiers PDBQT du ligand et du récepteur.
    2. Entrez dans l’interface de configuration de la boîte de grille, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S9B, et définissez la taille de la boîte de grille (taille x = 44,644 ; taille y = 74,939 ; taille z = 43,050) et le centre (centre x = 25,626 ; centre y = 9,582 ; centre z = 41,825), qui entourent entièrement toute la surface de la molécule réceptrice, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S10A.
    3. Fermez l’interface de configuration de la boîte de grille avec les paramètres actuels, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S10B et enregistrez les paramètres d’ancrage dans un fichier config.txt, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S11A.
  5. Exécution du logiciel d’amarrage moléculaire
    1. Lancez le logiciel d’amarrage moléculaire à l’aide du fichier config.txt, comme indiqué dans Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S11B.
    2. Exécuter le calcul d’amarrage (~30-90 min ; Dossier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S12).
    3. Consultez le fichier docking_log.txt pour vérifier les scores d’ancrage (affinité de liaison).
    4. Sélectionnez le résultat d’ancrage avec la conformation d’énergie la plus faible.
  6. Analyse des données d’amarrage
    1. Utilisez le logiciel de l’outil d’ancrage automatisé pour ouvrir le fichier PDBQT du résultat de l’ancrage.
    2. Analysez les sites de liaison ligand-récepteur, en vous concentrant sur le centre actif du récepteur et les interactions intermoléculaires, y compris les interactions ioniques, ioniques-polaires, polaires et de liaisons hydrogène. Faites un tableau pour l’IP et le phosphoinositide, qui interagissent avec le site actif du récepteur, afin de décrire les affinités du site de liaison en kcal/mol, les fractions chargées et polaires dans la tête polaire PI/phosphoinositide, et les résidus HDP-2P impliqués dans la liaison intermoléculaire, et les types de liaisons comme indiqué dans le tableau 1 et le tableau 2. Répétez l’amarrage 3x pour chaque paire récepteur-ligand pour vous assurer qu’il n’y a pas de déviation dans les sites de liaison, les affinités de liaison, les fractions chargées et polaires des résidus PI/phosphoinositide et HDP-2P, et le type de liaisons.

2. Activité hydrolytique de HDP-2P dans les liposomes PC enrichis en PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS ou CL surveillés à l’aide de la coenzyme A acylée avec des acides gras libres

REMARQUE : Le chloroforme, le méthanol, le NH3 et le CuSO4 sont dangereux. Utilisez toujours des gants en nitrile, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire. Manipulez tous les protocoles avec ces réactifs sous la hotte. Conservez le chloroforme dans une bouteille en verre ambré. Stockez le méthanol dans des armoires inflammables, à l’abri des oxydants. Gardez le méthanol à l’abri des flammes et des étincelles. Étiquetez tous les conteneurs de déchets pour ces réactifs et éliminez-les conformément aux réglementations locales en matière d’élimination des déchets dangereux.

  1. Préparez 100 mL de solution tampon pour l’hydrolyse des phospholipides catalysée par le HDP-2P en dissolvant 5,55 mg de CaCl2 dans un tampon Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4).
  2. Préparer 50 mL de solution mère d’EDTA 1,0 M en dissolvant 7,31 g d’EDTA dans de l’eau distillée désionisée (jjH20).
  3. Préparer une solution mère de HDP-2P de 0,54 mM dans un tampon Tris-HCl de 0,10 M (pH 7,4). La masse molaire du HDP-2P est de 13,827 kDa.
  4. Préparer les solutions mères suivantes de phospholipides à la concentration 10,0 M dans un mélange chloroforme/méthanol (2 à 1 en volume) : L-α-phosphatidylcholine (PC), cardiolipine cardiaque bovine (CL), L-α-phosphatidyl-L-sérine (PS), PI, PI-4-P et PI-4,5-P2. Les masses molaires de PC, CL, PS, PI, PI-4-P et PI-4,5-P2 sont respectivement de 768 Da, 1 466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da et 1 057 Da, comme décrit plus en détail ci-dessous.
  5. Préparez cinq échantillons de liposomes PC. Pour préparer un échantillon de liposomes PC, ajoutez 75 μL de solution mère de chloroforme/méthanol de PC dans un tube à essai en verre et séchez les lipides à 25 °C sous vide de 10 Pa pendant 1 h jusqu’à ce qu’un film lipidique se forme. Hydrater le film lipidique pendant 1 h avec 15 mL de solution tampon pour l’hydrolyse des phospholipides à 25 °C dans un thermostat. Ensuite, insérez le pistolet en titane d’un distributeur à ultrasons de 100-150 W dans la suspension lipidique du tube à essai en verre placé dans un bain de glace et sonisez la suspension à une fréquence de 22 kHz pendant 10 min, sans dépasser 50 % de la puissance maximale. Pour éliminer les particules de titane, centrifugez les liposomes à 200 × g (1 270 tr /min avec un rotor de 10 cm) pendant 10 min à température ambiante.
  6. Préparez des échantillons de liposomes PC enrichis en CL, PS, PI, PI-4-P ou PI-4,5-P2 à la PC et à d’autres molaires lipidiques de 4 à 1 en mélangeant des solutions mères de chloroforme/méthanolphospholipides - 60 μL de PC avec 15 μL de CL, PS, PI, PI-4-P ou PI-4,5-P2-dans un tube de verre. Ensuite, séchez les lipides dans un vide de 10 Pa ou pendant 3 h à température ambiante, hydratez le film lipidique dans une solution tampon pour l’hydrolyse des phospholipides et soniquez avec des ondes ultrasonores comme décrit ci-dessus.
    REMARQUE : Pour chaque type de liposomes, préparez cinq échantillons.
  7. Placer 1,0 mL de cinq échantillons de chaque type de liposomes décrit ci-dessus dans des tubes séparés et ajouter 10 μL de solution de coenzyme-A incolore du kit NEFA dans chaque tube, puis ajouter 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 ou 3,72 μL de solution mère HDP-2P de 0,54 mM dans des tubes séparés pour obtenir dans les échantillons de liposomes les rapports molaires HDP-2P/phospholipides de 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 et 0,004, respectivement.
  8. Immédiatement après l’ajout de HDP-2P aux liposomes, incuber des échantillons de liposomes pendant 15 minutes à 37 °C dans un thermostat, puis arrêter l’hydrolyse des phospholipides induite par HDP-2P en ajoutant 100 μL de solution mère d’EDTA. Après cela, faites tourbillonner les échantillons pendant 1 min.
  9. Quantifiez l’activité hydrolytique du HDP-2P en mesurant la densité optique d’échantillons liposomaux à 550 nm à l’aide d’un spectrophotomètre, ce qui permettrait de mesurer dans quelle mesure une solution incolore de coenzyme-A devient violette lorsqu’elle est acylée avec des acides gras libres.
  10. Répétez la procédure ci-dessus deux fois de plus afin que les valeurs moyennes de densité optique soient dérivées de trois essais indépendants.
    REMARQUE : Chaque point de données obtenu dans cet essai expérimental est la valeur moyenne de la densité optique. Idéalement, l’écart-type des points de données expérimentales devrait se situer à ±5 % de la moyenne.

3. Effets de HDP-2P sur la perméabilité des membranes liposomales PC enrichies en PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS ou CL mesurées par une réaction de substitution de ligand dans une solution de CuSO4 impliquant un ligand NH3 piégé à l’intérieur des liposomes

REMARQUE : Le chloroforme, le méthanol, le NH3 et le CuSO4 sont dangereux. Utilisez toujours des gants en nitrile, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire. Manipulez tous les protocoles avec ces réactifs sous la hotte. Conservez le chloroforme dans une bouteille en verre ambré. Stockez le méthanol dans des armoires inflammables, à l’abri des oxydants. Gardez le méthanol à l’abri des flammes ou des étincelles. Étiquetez tous les conteneurs de déchets pour ces réactifs et éliminez-les conformément aux réglementations locales en matière d’élimination des déchets dangereux.

  1. Préparer 20 mL de solutions mères à 0,03 M pour chacun des six phospholipides - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- dans du chloroforme/méthanol (volume de 2 à 1). Les masses moléculaires de PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 sont respectivement de 768, 1466, 792, 867, 962 et 1057 Da.
  2. Préparez 100 mL de tampon Tris-HCl 0,10 M (pH 7,4) avec une concentration finale de 0,05 M CuSO4.
  3. Préparez 4 mL de 1,5 × 10-3 M HDP-2P dans un tampon 0,05 M CuSO4, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4). La masse molaire du HDP-2P est de 13,827 kDa.
  4. Pour préparer 100 mL de solution de NH3 0,5 M, utilisez une solution de NH3 à 25 % (masse volumique 905 g/L30, égale à 13,30 M [905 g/L × 0,25 M ÷ 17,00 g/L = 13,30 M]). Ainsi, pour préparer 100 mL de NH3 0,5 M, utilisez 3,76 mL de solution NH3 à 25 % : (0,5 M × 1 000 mL ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 mL de solution NH3 à 25 %. Placer 3,76 mL de solution de NH3 à 25 % dans une fiole jaugée de 100 mL et porter le volume à 100 mL avec un tampon Tris-HCl de 0,10 M (pH 7,4).
  5. Pour préparer des liposomes avec NH3 dans le volume interne des liposomes, placez 12,5 mL de solution mère de phospholipides 0,03 M dans du chloroforme/méthanol dans un tube et des phospholipides secs dans un vide de 10 Pa ou pendant 3 h à température ambiante. Hydrater le film phospholipidique pendant 1 h avec 12,5 mL de 0,5 M NH3, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) à 25 °C dans un thermostat ; puis soniser la suspension lipidique à une fréquence de 22 kHz comme décrit à l’étape 2.5 pour produire des liposomes soniqués.
    REMARQUE : Dans la solution avec des liposomes soniqués, NH3 est situé à l’intérieur et à l’extérieur des liposomes.
  6. Pour éliminer le NH3 à l’extérieur des liposomes, dialysez les liposomes à l’aide d’une membrane de dialyse (coupure moléculaire 1,0 kDa) pendant 5 à température ambiante contre 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) à l’aide d’un agitateur magnétique.
    REMARQUE : Une dialyse de 5 h a été suffisante pour éliminer complètement le NH3, car l’ajout de 0,5 mL de liposomes dialysés à 0,5 mL de tampon Tris-HCl de 0,10 M, 0,05 M de CuSO4 a donné la même densité optique à 600 nm que celle des liposomes préparés sans NH3 et mélangés avec le même tampon.
  7. Après la dialyse, centrifuger les liposomes à 200 × g pendant 90 minutes comme décrit à l’étape 2.5 pour granuler les liposomes. Jetez le surnageant et remettez les liposomes en suspension avec 5,0 mL de Tris-HCl 0,10 M, un tampon CuSO4 0,05 M (pH 7,4), et divisez les liposomes remis en suspension en cinq échantillons de 1,0 mL chacun. Ajoutez à ces cinq échantillons de 1,0 ml séparément 60, 40, 20 et 0 μL de tampon Tris-HCl 0,10 M, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4), puis 0, 20, 40, 60, 80 μL de tampon stock HDP-2P pour ajuster dans les échantillons de liposomes les rapports molaires HDP-2P/phospholipides 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 et 0,004, respectivement.
  8. Incuber les échantillons de liposomes pendant 30 min dans un thermostat à 37 °C ; Ensuite, mesurez la densité optique des échantillons de liposomes à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Suivez les étapes décrites à la section 3 pour les six échantillons de liposomes et répétez l’opération 3 fois pour garantir des lectures triplées de la densité optique pour chaque point de données.
    REMARQUE : L’écart-type des points de données expérimentales doit toujours être inférieur à ±5 % de la moyenne.

Résultats

Simulation de modélisation moléculaire de l’interaction HDP-2P avec l’IP et les phosphoinositides
Le programme de modélisation moléculaire calcule les neuf meilleurs sites de liaison sur la surface moléculaire d’un récepteur (molécule plus grande), qui est ciblé par un ligand (molécule plus petite). Ces sites sont déterminés par la libération des neuf enthalpies les plus élevées, qui désignent les sites présentant les meilleures affinités de liaison. Les affinités de liaison sont exprimées sous forme de valeurs négatives, ce qui indique que la liaison intermoléculaire est un processus exothermique. Dans le cas de l’interaction de HDP-2P avec l’IP, la simulation a prédit quatre sites de liaison (#3, #6, #7 et #8) pour l’IP sur la surface moléculaire de l’HDP-2P dans le centre actif (Tableau 1). De plus, les cinq sites de liaison pour l’IP ont été trouvés en dehors du centre actif de HDP-2P. Les notations des fractions chargées et polaires dans la tête polaire de PI sont illustrées à la figure 1.

Le centre actif du HDP-2P se compose de cinq résidus d’acides aminés clés : Gly30, Gly32, His48, Asp49 et Lys69, qui facilitent l’alignement correct du substrat phospholipidique dans le centre actif pour assurer l’hydrolyse catalytique. Certaines structures arrimées représentatives montrent la liaison de PI à certains résidus d’acides aminés du centre actif, tandis que dans le site de liaison #6, PI s’engage avec les cinq résidus d’acides aminés clés du centre actif par des liaisons ioniques, ionopolaires et hydrogène (Tableau 1). La figure 2 illustre comment PI interagit avec les cinq résidus d’acides aminés clés dans le centre actif de HDP-2P dans le site de liaison #6.

La simulation d’amarrage de l’interaction entre HDP-2P et PI-4-P, qui contient un groupe phosphate à la position 4 du cycle inositol, a prédit uniquement le site de liaison #1 comme l’endroit où PI-4-P se lie au centre actif de HDP-2P. Plus précisément, dans ce site, PI-4-P interagit avec trois résidus d’acides aminés clés du centre actif - Gly30, Gly32 et Lys69 - via des liaisons ioniques, ionopolaires et hydrogène (Tableau 2). La figure 3 illustre l’interaction de PI-4-P avec le centre actif de HDP-2P. Dans les huit sites de liaison restants à la surface moléculaire de HDP-2P, PI-4-P se lie à des emplacements en dehors du centre actif.

Les simulations d’amarrage moléculaire des interactions HDP-2P avec PI-4,5-P₂ (contenant des groupes phosphate aux positions 4 et 5 du cycle inositol) n’ont révélé aucune liaison au centre actif de l’enzyme sur les neuf sites de liaison prédits. Au lieu de cela, PI-4,5-P₂ se lie constamment à une cavité en forme de rainure adjacente au centre actif (Figure 4), formant des liaisons ion-polaires et hydrogène avec les trois résidus HDP-2P, Trp31, Gly33 et Gln34).

Bien que la liaison de PI-4,5-P₂ à une cavité en forme de sillon près du centre actif du PLA2cellulaire ou du venin n’ait pas été documentée auparavant, des caractéristiques structurellement analogues sont bien établies dans les domaines de l’homologie31 (PH) et de l’homologie N-terminale32 (ENTH) de la pleckstrine (PH). Ces domaines de signalisation utilisent des architectures de sillons hydrophobes-polaires-cationiques similaires pour la reconnaissance spécifique de PI-4,5-P2 31,32, malgré leur nature non enzymatique. La présence d’un motif structurel comparable dans HDP-2P soulève des possibilités intrigantes de mimétisme évolutif ou d’évolution convergente pour faciliter la reconnaissance du domaine membranaire par HDP-2P. Si elle est vérifiée par d’autres méthodes, cette étude pourrait représenter le premier cas signalé d’un PLA2 à venin utilisant un tel mécanisme de reconnaissance du phosphoinositide.

Il est intéressant de noter que les simulations d’amarrage moléculaire de CL et PS interagissant avec HDP-2P ont prédit la liaison des deux phospholipides au centre actif de HDP-2P dans huit des neuf sites de liaison, tandis que le seul site de liaison de CL et PS à l’extérieur du centre actif n’était pas situé dans la cavité en forme de sillon (données non présentées). Il convient également de noter que, comme PI, le PC se lie au centre actif du HDP-2P dans quatre des neuf sites de liaison, et que le PI et le PC, comme CL et PS, ne se lient pas à la cavité en forme de rainure (données non présentées). Ces résultats suggèrent que les groupes phosphate sur le cycle inositol de PI ont une affinité de liaison élevée avec la cavité en forme de sillon située à côté du centre actif. Les analyses structurales ont identifié des cavités analogues en forme de sillon avec des taches de surface hydrophobes-polaires-cationiques près du centre catalytique dans les enzymes cellulaires33 et34 PLA2 du venin. La liaison des phosphoinositides à ces cavités peut induire des changements conformationnels physiologiquement significatifs, inhibant potentiellement l’activité enzymatique. Notamment, parmi les phosphoinositides, PI-4,5-P2 présente des caractéristiques de substrat particulièrement médiocres - les isoformes humaines du PLA2 (types cytosoliques, indépendants du calcium et sécrétés) montrent une activité hydrolytique minimale à indétectable envers PI-4,5-P235. Cela suggère que la liaison du phosphoinositide à ces caractéristiques structurelles conservées peut remplir une fonction physiologique distincte (par exemple, l’inhibition allostérique) plutôt que des fonctions catalytiques dans la superfamille du PLA2 , ce qui nécessite une vérification expérimentale future.

Activité hydrolytique de HDP-2P dans les liposomes PC enrichis en PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS ou CL surveillés à l’aide de la coenzyme A acylée avec des acides gras libres
L’activité hydrolytique de HDP-2P sur des échantillons liposomaux a été évaluée à l’aide d’une solution de coenzyme A. La solution de coenzyme A est incolore mais devient violette lors de l’acylation par les acides gras libres libérés lors de l’hydrolyse des phospholipides catalysée par HDP-2P. L’augmentation de la densité optique qui en résulte, correspondant à l’ampleur de l’acylation de la coenzyme A, a été mesurée par spectrophotométrie à 550 nm. Par conséquent, l’augmentation de la densité optique dans les échantillons liposomaux traités avec de la coenzyme A et du HDP-2P est directement proportionnelle à l’activité hydrolytique du HDP-2P.

La figure 5 présente les courbes d’activité hydrolytique en fonction du rapport molaire HDP-2P/phospholipides dans divers échantillons liposomaux. L’activité hydrolytique du HDP-2P est exprimée en unités arbitraires (u.a.) de densité optique (DO) mesurées à 550 nm. Nous n’avons pas construit de courbe d’étalonnage pour relier les valeurs de l’UA aux concentrations molaires d’acides gras libres, car nos essais expérimentaux ont montré que les acides gras dans les solvants organiques, lorsqu’ils sont ajoutés à des solutions aqueuses contenant de la coenzyme A et de l’acyl-coenzyme A synthétase, ne produisent aucun changement détectable de DO à 550 nm. Cela indique que ces acides gras forment des micelles plutôt que de se lier à la coenzyme A. En revanche, seuls les acides gras générés par la membrane (produits par l’activité du PLA2 ) se lient à la coenzyme A associée à la membrane, ce qui entraîne un changement mesurable de la DO La nature amphipathique de la coenzyme A - ayant à la fois des régions hydrophobes et hydrophiles à sa surface moléculaire - la localise préférentiellement à l’interface membrane-eau, ce qui facilite la liaison des acides gras produits par l’activité du PLA2 à la coenzyme A. Cependant, dans ces conditions d’essai, il n’est pas possible de déterminer la concentration molaire des acides gras. Pour cette raison, les chercheurs utilisant le dosage de la coenzyme A expriment l’activité hydrolytique du PLA2 en unités arbitraires de DO mesurées à 550 nm20.

La plus forte augmentation de la densité optique, correspondant à la plus grande activité hydrolytique de HDP-2P, a été observée dans les liposomes PC enrichis en CL ou PS. Ce résultat s’aligne bien avec le plus grand nombre de sites de liaison pour CL et PS au centre actif de HDP-2P. L’activité hydrolytique de HDP-2P dans les liposomes PC enrichis en PI était 3,0 et 2,5 fois plus faible que dans les liposomes enrichis en CL ou PS, respectivement, mais plus élevée que dans les liposomes PC purs. Cela suggère que l’affinité de liaison au centre actif de HDP-2P de PI est plus élevée que celle de PC, bien que les deux lipides aient le même nombre de sites de liaison au centre actif.

Cet écart apparent peut s’expliquer par des différences structurelles dans les groupes de tête polaire de PI et de PC. Alors que le PC est une molécule neutre, son groupe cationique triméthylammonium s’étend vers l’extérieur dans la solution, tandis que son groupe phosphate anionique est positionné plus près de la zone hydrophobe de la membrane. Cette distribution de charge dans le groupe de tête PC peut créer une répulsion électrostatique contre le HDP-2P de base, réduisant ainsi son affinité de liaison. En revanche, la nature acide de l’IP en fait une espèce lipidique plus attrayante pour l’interaction avec le HDP-2P de base, ce qui pourrait expliquer son activité hydrolytique plus élevée par rapport aux liposomes PC purs.

L’activité hydrolytique de HDP-2P dans les liposomes PC enrichis en PI-4-P, comme le montre la figure 5, suggère une hydrolyse catalytique minimale des phospholipides. Remarquablement, la courbe de densité optique obtenue à partir de liposomes PC enrichis en PI-4,5-P indique une abolition complète de l’activité hydrolytique par HDP-2P dans cet échantillon de liposomes. Ces résultats s’alignent bien avec les simulations d’amarrage, qui prédisent un site de liaison pour PI-4-P au centre actif de HDP-2P, tandis que PI-4,5-P2 ne montre aucune affinité de liaison au centre actif. Cela suggère que les groupes phosphate liés au cycle inositol entravent la liaison du phospholipide au centre actif de HDP-2P. Nous proposons que les groupes phosphate sur le cycle inositol s’étendent vers l’extérieur dans la solution, et en se liant à HDP-2P via des interactions ioniques et iono-polaires intermoléculaires, ils maintiennent HDP-2P à une distance de la surface de la membrane, protégeant ainsi la membrane de l’activité hydrolytique de HDP-2P. Cela est cohérent avec les découvertes récentes révélant que les enzymes PLA2 humaines cytosoliques, indépendantes du calcium et sécrétées ont montré une activité hydrolytique à peine détectable ou nulle vers les substrats PI-4-P et PI-4,5-P2 35.

Modifications de perméabilité induites par HDP-2P dans les membranes liposomales PC enrichies en PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS ou CL : Évaluation par réaction de substitution de ligand dans une solution de CuSO4 avec NH₃ encapsulé

L’impact de l’activité hydrolytique HDP-2P sur la perméabilité membranaire des liposomes PC enrichis en PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS ou CL a été étudié à l’aide d’une réaction de substitution de ligand dans un système d’ions complexes, où le ligand de substitution a été encapsulé dans le volume interne des liposomes. Cette méthode simple et fiable est basée sur le déplacement de quatre molécules d’eau agissant comme des ligands dans l’ion complexe [Cu(H2O)6]2+ par NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

Au cours du processus de substitution des molécules d’eau par NH3 dans l’ion complexe [Cu(H2O)6]2+, la couleur bleu pâle de [Cu(H2O)6]2+ passe à la couleur bleu foncé de [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. Dans un système où NH3 est encapsulé dans le volume interne des liposomes et où [Cu(H2O)6]2+ est présent dans la solution externe, ce changement de couleur -- contrôlé spectrophotométriquement -- indique une augmentation de la perméabilité de la membrane liposomale à NH3.

Pour établir un tel système, nous avons soniquisé une dispersion phospholipidique dans un tampon Tris-HCl contenant NH3, formant des liposomes sonicés avec NH₃ à l’intérieur et à l’extérieur des liposomes. Le NH3 externe a été éliminé par dialyse, après quoi la solution de CuSO4 a été ajoutée à l’échantillon de liposomes contenant du NH3 dans son volume interne. Nous avons ensuite traité les liposomes avec du HDP-2P et surveillé les changements de densité optique par spectrophotométrie.

Pour déterminer la longueur d’onde optimale pour mesurer les changements de densité optique, nous avons enregistré les spectres d’absorbance de [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ dans une solution CuSO4 0,025 M, NH3 0,100 M et [Cu(H2O)6]2+ dans une solution CuSO4 0,025 M, en utilisant la lumière visible dans la gamme de 500 nm à 900 nm. Comme le montre la figure 6, l’irradiation à 600 nm a produit une absorbance maximale pour le [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ et une absorbance minimale pour le [Cu(H2O)6]2+, ce qui nous a amenés à sélectionner 600 nm comme longueur d’onde optimale pour nos expériences de perméabilité membranaire.

La figure 7 montre que la perméabilité membranaire à NH₃ est la plus élevée dans les liposomes PC enrichis en CL et PS anioniques. Cette observation est cohérente avec nos données précédemment rapportées montrant que HDP-2P, un PLA2 du groupe IIA, interagit efficacement avec le phospholipide anionique palmitoyloléoyl-glycérophosphoglycérol, conduisant à l’hydrolyse du substrat - un effet non observé avec le phospholipide neutre palmitoyloléoylglycérophosphocholine36. En général, la plupart des enzymes PLA2 du groupe IIA présentent une activité hydrolytique significativement plus élevée envers les phospholipides anioniques 33,37,38. La perméabilité des liposomes PC+PI est inférieure à celle des liposomes PC+CL et PC+PS mais reste supérieure à celle des liposomes PC purs. Ces résultats concordent bien avec les résultats des simulations d’amarrage et des analyses d’activité hydrolytique HDP-2P. En d’autres termes, les échantillons lyposomaux qui présentent une faible perméabilité devraient être structurellement stables en raison de l’incapacité du HDP-2P à hydrolyser les phospholipides et en raison d’une plus faible affinité du HDP-2 à se lier au PI et aux phosphoinositides, comme prédit par les données d’amarrage moléculaire (Figure 2, Figure 3 et Figure 4). Par conséquent, l’activité hydrolytique enzymatique par HDP-2P (Figure 5) et la perméabilité membranaire, comme le montre la Figure 7, devraient être positivement corrélées.

Cependant, dans les liposomes PC+PI-4-P et PC+PI-4,5-P2 , la perméabilité n’a pas augmenté lors du traitement par HDP-2P. Bien que les résultats de perméabilité dans les liposomes PC+PI-4,5-P2 soient bien corrélés avec les simulations d’amarrage et les données d’activité hydrolytique HDP-2P pour les mêmes liposomes, l’absence d’augmentation de la perméabilité dans les liposomes PC+PI-4-P ne correspond pas entièrement aux résultats de l’activité hydrolytique, car un faible degré d’activité hydrolytique a été enregistré dans ces liposomes. Ces résultats suggèrent qu’une légère augmentation localisée de l’activité hydrolytique dans les liposomes PC+PI-4-P ne perturbe pas l’empilement bicouche des phospholipides à un degré qui modifierait la perméabilité de la membrane à NH3.

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Figure 1 : Notations des fractions chargées et polaires de la tête polaire du phosphatidylinositol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Interaction de PI avec le centre actif de HDP-2P prédite pour le site de liaison #6 par un logiciel d’amarrage moléculaire. PI est donné en représentation bâton et HDP-2P est donné en représentations linéaires (schéma à gauche) et en surface moléculaire (schéma à droite). Pour les représentations en bâton, l’émeraude représente le carbone, l’orange le phosphore, le rouge l’oxygène et le blanc l’hydrogène. Pour la surface moléculaire et les lignes, le vert représente le carbone, le bleu l’azote, le rouge l’oxygène, le blanc l’hydrogène et le jaune le soufre. Les lignes brisées jaunes identifient les liaisons intermoléculaires. Les flèches pointent vers les résidus d’acides aminés au centre actif. Abréviations : PI = Phosphatidylinositol ; HDP-2P = sous-unité de base de la phospholipase de venin de vipère. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Interaction de PI-4-P avec le centre actif de HDP-2P prédite pour le site de liaison #1 par un logiciel d’amarrage moléculaire. Le PI-4-P est donné en représentation en bâton et le HDP-2P est donné en lignes (schéma de gauche) et en surface moléculaire (schéma de droite). Pour les bâtonnets, l’émeraude représente le carbone, l’orange est le phosphore, le rouge est l’oxygène et le blanc est l’hydrogène. Pour la surface moléculaire et les lignes, le vert représente le carbone, le bleu l’azote, le rouge l’oxygène, le blanc l’hydrogène et le jaune le soufre. Les lignes brisées jaunes identifient les liaisons intermoléculaires. Les flèches pointent vers les résidus d’acides aminés au centre actif. Abréviations : PI-4-P = Phosphatidylinositol-4-phosphate ; HDP-2P = sous-unité de base de la phospholipase de venin de vipère. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Interaction de PI-4,5-P2 avec la surface moléculaire de HDP-2P prédite pour le site de liaison #6 par un logiciel d’amarrage moléculaire. PI-4,5-P2 se lie à une grotte en forme de rainure située sous le centre actif du HDP-2P. Les cinq résidus d’acides aminés clés au centre actif sont donnés dans la notation de trois lettres. PI-4,5-P2 est donné en représentation bâton et HDP-2P est donné en représentations linéaires (schéma à gauche) et en surface moléculaire (schéma à droite). Pour les bâtonnets, l’émeraude représente le carbone, l’orange est le phosphore, le rouge est l’oxygène et le blanc est l’hydrogène. Pour la surface moléculaire et les lignes, le vert représente le carbone, le bleu l’azote, le rouge l’oxygène, le blanc l’hydrogène et le jaune le soufre. Abréviations : PI-4,5-P2 = phosphatidylinositol-4,5-diphosphate ; HDP-2P = sous-unité de base de la phospholipase de venin de vipère. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Courbes d’activité hydrolytique à partir d’échantillons de liposomes à divers rapports molaires HDP-2P/phospholipides. Liposomes en PC+CL (vert foncé), PC+PS (orange), PC+PI (bleu foncé), PC+PI-4-P (bleu), PC+PI-4,5-P2 (vert) et PC (violet). Les valeurs de densité optique en unités arbitraires représentent les moyennes des lectures triples à 550 nm. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type des lectures en trois exemplaires. La signification statistique des différences de valeurs de densité optique entre les échantillons de liposomes a été évaluée à l’aide de l’ANOVA, toutes les valeurs p étant bien inférieures à 0,05. Abréviations : PC = phosphatidylcholine ; CL = cardiolipin cardiaque bovin ; PS = phosphatidylsérine ; PI = Phosphatidylinositol ; PI-4-P = Phosphatidylinositol-4-phosphate; PI-4,5-P2 = Phosphatidylinositol-4,5-diphosphate ; a.u. = unités arbitraires ; HDP-2P = sous-unité de base de la phospholipase de venin de vipère. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Spectres d’absorbance de solutions aqueuses de complexes de cuivre. Complexes de cuivre [Cu(H2O)6]2+ (ligne orange) et [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (ligne bleue), irradiés par la lumière visible dans la gamme de 500 nm à 900 nm. Le complexe de cuivre [Cu(H2O)6]2+ a été réalisé dans une solution de 0,025 M CuSO4 et le complexe de cuivre [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ a été réalisé dans une solution de 0,025 M CuSO4 contenant 0,100 M NH3. Les valeurs d’absorbance dans cette figure pour chaque point de données sont les moyennes des lectures d’absorbance effectuées en trois exemplaires. Les barres d’erreur représentent l’écart-type des lectures en trois exemplaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Courbes de perméabilité membranaire à partir d’échantillons de liposomes. Liposomes en PC+CL (violet), PC+PS (bleu), PC+PI (bleu foncé), PC+PI-4-P (vert foncé), PC+PI-4,5-P2 (orange) et PC (vert) à différents rapports molaires HDP-2P/phospholipides. Les valeurs de perméabilité de la membrane sont exprimées en valeurs de densité optique en unités arbitraires (a.u.) mesurées à 600 nm. Chaque point de données représente la moyenne des lectures en trois exemplaires. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type des lectures en trois exemplaires. La signification statistique des différences de valeurs de densité optique entre les échantillons de liposomes a été évaluée à l’aide de l’ANOVA, toutes les valeurs p étant bien inférieures à 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Énergies de liaison d’affinité prédites pour les complexes moléculaires candidats de HDP-2P avec PI. Des simulations de modélisation moléculaire ont été utilisées pour prédire les types de liaisons et les affinités de site de liaison, ainsi que les fractions chargées et polaires du groupe de tête de phosphatidylinositol et des résidus d’acides aminés HDP2P qui participent à leurs interactions intermoléculaires. Les groupes chargés et polaires du phosphatidylinositol sont mis en évidence à la figure 1. Notez que Pb dans NHpbδ+ désigne une liaison peptidique. Abréviations : PI = Phosphatidylinositol ; HDP-2P = sous-unité de base de la phospholipase de venin de vipère. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Énergies de liaison d’affinité prédites pour les complexes moléculaires candidats de HDP-2P avec PI-4-P. Des simulations de modélisation moléculaire ont été utilisées pour prédire les types de liaisons et d’affinités entre les sites de liaison, ainsi que les fractions chargées et polaires du groupe de tête du phosphatidyl-inositol-4-phosphate (PI-4-P) et des résidus d’acides aminés HDP2P qui participent à leurs interactions intermoléculaires. Notez que Pb dans NHpbδ+ désigne une liaison peptidique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Flux de travail d’amarrage moléculaire. Vue d’ensemble de la procédure d’amarrage moléculaire à l’aide d’AutoDock, y compris la construction des ligands, la préparation des récepteurs, la configuration de la boîte de grille et l’exécution de simulations d’amarrage pour prédire les interactions PI-HDP-2P. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette étude, nous avons cherché à savoir si les groupes phosphate liés de manière covalente au cycle inositol dans le phosphatidylinositol (PI) peuvent empêcher la dégradation des membranes phospholipidiques par l’enzyme phospholipase A2 (PLA2). Pour évaluer la progression de la dégradation membranaire des phospholipides causée par l’activité hydrolytique du PLA2, nous avons conçu une méthode simple mais très sensible et précise pour mesurer les changements de perméabilité membranaire, qui devraient augmenter à mesure que la dégradation structurelle progresse.

La méthode est basée sur une réaction de substitution de ligand impliquant le complexe hexaaquacuivre(II), [Cu(H2O)6]2+, en suspension dans l’environnement aqueux à l’extérieur des liposomes phospholipidiques, tandis que l’ammoniac (NH3) est encapsulé à l’intérieur des liposomes. L’ammoniac a une affinité plus élevée pour le Cu2+ que les molécules d’eau, mais le NH3 doit pénétrer à travers la membrane liposomale pour accéder à la phase aqueuse externe, où il substitue les molécules H2O dans [Cu(H2O)6]2+. Si l’intégrité structurelle de la membrane liposomale est compromise en raison de l’hydrolyse des phospholipides catalysés par le PLA2, une perméabilité accrue de la membrane à NH3 facilitera la substitution de ligands, conduisant à un changement de couleur du bleu pâle de [Cu(H2O)6]2+ au bleu foncé de [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. Nous avons suivi cette transformation quantitativement en utilisant la spectrophotométrie pour enregistrer le changement de densité optique à 600 nm.

Nous avons précédemment utilisé la RMN-1H avec du ferrocyanure d’ions paramagnétiques, [Fe(CN)6]3-, pour étudier les changements de perméabilité membranaire affectés par HDP-2P24 et par les cardiotoxines de venin de cobra 24,25,26,27,28,39. Nous avons également utilisé une gamme de sondes fluorescentes et phosphorescentes pour étudier les effets des cardiotoxines du venin de cobra sur la perméabilité des membranes liposomales 20,23,40. Cependant, le ferrocyanure et les sondes fluorescentes/phosphorescentes sont de grandes entités moléculaires non physiologiques qui pénètrent les membranes lipidiques lorsque l’intégrité de la membrane est considérablement endommagée. En revanche, notre nouveau test de substitution de ligand utilise NH₃ - un petit métabolite cellulaire naturel capable de pénétrer les membranes lipidiques lors de subtiles perturbations de l’emballage des lipides. Cette sensibilité accrue de notre nouvelle méthode de perméabilité membranaire est mise en évidence par sa capacité à détecter les changements de perméabilité membranaire à un rapport molaire HDP-2P/lipide de 0,001, contre 0,004 requis pour la détection ¹H-RMN/ferrocyanure23.

Dans la même étude, nous avons utilisé l’extinction de la phosphorescence de l’érythrosine par le ferrocène pour examiner les effets du HDP-2P sur l’échange lipidique intermembranaire, évalués par la variation du rapport entre la durée de vie de l’érythrosine dans les échantillons d’essai (τn) et celle de l’échantillon de contrôle (τ0)23. À un rapport HDP-2P/molaire lipidique de 0,004, la valeur τn/τ0 a diminué à 0,423, indiquant un état de fluidité membranaire perméable aux cations divalents24. Ainsi, notre test de substitution de ligand basé sur NH₃ détecte la perméabilité membranaire à un rapport molaire HDP-2P/lipide de 0,001, alors que les tests conventionnels (1H-NMR/ferrocyanure et trempe par sonde de phosphorescence) détectent la perméabilité membranaire uniquement à un rapport molaire de 0,004. Cela démontre que notre test basé sur NH3 est quatre fois plus sensible que les tests conventionnels.

La sensibilité exceptionnelle de notre test basé sur NH3 a permis d’obtenir des données de perméabilité étroitement corrélées aux mesures de l’activité hydrolytique, avec une seule divergence apparente : les liposomes PC+PI-4-P ont montré une hydrolyse insignifiante sans changements de perméabilité, ce qui suggère que la production locale minimale de lysophospholipides/acides gras n’affecte pas l’emballage lipidique global, ce qui n’influence pas l’intégrité structurelle et la perméabilité de la membrane. Ainsi, cette étude a démontré que la réaction de substitution de ligand dans un système ionique complexe, impliquant un ligand encapsulé dans le volume interne des liposomes, produisait des résultats qui s’alignaient parfaitement avec les données d’activité hydrolytique de HDP-2P. Ces résultats, à leur tour, étaient en fort accord avec les études in silico sur la liaison de l’IP et des phosphoinositides à la surface moléculaire de HDP-2P.

Dans l’ensemble, la simulation AutoDock de la présente étude a révélé que PI se lie au centre actif à quatre des neuf sites de liaison identifiés, tandis que PI-4-P se lie au centre actif à un seul des neuf sites prédits. L’activité hydrolytique de HDP-2P dans les liposomes PC+PI-4-P était environ 5 fois plus faible que dans les liposomes PC+PI. De plus, des études in silico n’ont prédit aucune liaison de PI-4,5-P2 au centre actif de HDP-2P. De manière constante, les tests d’activité du PLA2 et les expériences de réaction de substitution de ligand ont montré que le PI-4,5-P2 inhibait complètement l’hydrolyse des phospholipides et l’augmentation de la perméabilité membranaire, tandis que le PI-4-P présentait une activité hydrolytique moindre et non significative et empêchait entièrement les changements de perméabilité membranaire. Ces observations sont en bon accord avec les études d’activité in vitro des enzymes PLA2 humaines cytosoliques, indépendantes du calcium et sécrétées envers PI, PI-4-P et PI-4,5-P235. Ces études ont montré que seul le PLA2 cytosolique du groupe IVA présentait une activité catalytique relativement élevée envers PI et PI-4-P, tandis que son activité envers PI-4,5-P2 était à peine détectable. Toutes les autres enzymes PLA2 testées n’ont montré aucune activité vis-à-vis de PI-4,5-P235. Ce manque d’activité a été attribué aux groupes phosphate hautement hydrophiles sur le cycle inositol, qui interfèrent avec les interactions productives entre la surface de la membrane et les enzymes PLA2 35. Nous suggérons que l’extension vers l’extérieur des groupes phosphate sur le cycle inositol dans la solution et leur capacité à former des liaisons ion-polaires et hydrogène avec des résidus de la cavité sillonnaire de HDP-2P empêche probablement HDP-2P de s’approcher de la surface de la membrane suffisamment près pour exercer son activité hydrolytique, stabilisant ainsi la membrane et réduisant la dégradation des membranes phospholipidiques par HDP-2P qui peut être préjudiciable aux cellules en activant les voies de mort cellulaire. Ce mécanisme semble s’aligner avec le rôle protecteur potentiel des phosphoinositides dans les conditions pathologiques impliquant une activité enzymatique aberrante.

La forte corrélation entre les résultats obtenus à partir d’essais de perméabilité membranaire, de mesures d’activité hydrolytique et d’études d’amarrage moléculaire in silico met en évidence la fiabilité de la méthode de réaction de substitution de ligand. Cette approche, utilisant un ligand encapsulé dans des liposomes, s’avère être un outil précis et efficace pour évaluer les changements de perméabilité membranaire causés par des perturbations structurelles dans l’organisation bicouche stable des phospholipides. Bien que nous reconnaissions que les études d’amarrage moléculaire à l’aide d’AutoDock présentées dans cet article ne fournissent pas une compréhension approfondie de la façon dont les phospholipides peuvent interagir avec HDP-2P de manière dynamique et longitudinale, des études de dynamique moléculaire doivent être effectuées à l’avenir pour identifier des mécanismes moléculaires supplémentaires de la façon dont HDP-2 peut perméabiliser des bicouches phospholipidiques composées de divers phospholipides. Il est important de noter que la réalisation d’études de dynamique moléculaire nécessite des ressources de calcul élevées, telles que des ordinateurs et des grappes haute performance, qui ne sont pas disponibles dans de nombreux établissements universitaires disposant de ressources et de financements de recherche limités. Enfin, nous reconnaissons l’utilisation d’un récepteur rigide (HDP-2P) dans l’article sur les techniques actuelles et l’absence d’un environnement solvant/membrane. Cependant, nous tenons à souligner que l’exécution d’amarrages moléculaires de HDP-2P avec divers phospholipides à l’aide d’un récepteur rigide est l’approche conventionnelle pour effectuer des études d’amarrage initiales afin d’identifier un premier passage de structures candidates amarrées qui peuvent être suivies à l’avenir avec un récepteur flexible une fois que les résidus d’acides aminés critiques dans le côté catalytique qui se lient aux substrats sont identifiés pour se concentrer sur les régions moléculaires qui peuvent être rendues flexibles dans Suivre des études d’amarrage moléculaire et dans un environnement solvaté. Par conséquent, tirer parti des collaborations avec d’autres institutions qui disposent de plus de ressources peut être un moyen d’aider à corroborer certaines des conclusions initiales fournies par AutoDock et à identifier des mécanismes moléculaires supplémentaires des interactions substrat-enzyme.

En conclusion, les résultats de cette étude démontrent que la méthode de réaction de substitution de ligand, utilisant un ligand encapsulé dans des liposomes, peut être appliquée efficacement aux études de perméabilité membranaire dans divers processus médiés par membrane. Il s’agit notamment des interactions ligand-récepteur, des interactions lipides-protéines, des échanges intermembranaires, de la fusion et de la fission membranaires et des contractions neuromusculaires. De plus, cette approche présente un potentiel important pour l’étude des produits pharmaceutiques membranotropes. Dans le même temps, nous reconnaissons que si les nouvelles méthodes dans les membranes modèles sont inestimables pour disséquer des mécanismes spécifiques d’interactions membranaires, leurs simplifications inhérentes limitent leur capacité à reproduire pleinement la complexité structurale, compositionnelle et fonctionnelle des membranes biologiques in vivo. Il est donc essentiel d’interpréter les données des systèmes modèles avec prudence et de valider les résultats à l’aide de modèles cellulaires ou d’organismes dans la mesure du possible.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les études présentées dans cet article ont été soutenues par la bourse de démarrage de la Beijing Chaoyang KaiWen Academy (E.S.G.) et par le prix SEPA, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.). Les travaux relatifs à la préparation de HDP-2 ont été soutenus par une subvention de la Fondation russe pour la science n° 24-15-00280 (Y.N.U.). Les auteurs tiennent à remercier la Dre Maryam Barancheshmeh d’avoir rédigé le texte et développé la vidéo sur l’application de la simulation d’amarrage moléculaire, qui a été préparée à la suite de la publication de cet article de recherche.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
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Sous-unité de base HDP-2P du venin de vipère de V. nikolskii PLA2, HDP-2, pureté à 98,5 %   ;Institut de chimie bioorganique, MoscouHDP-2 isolé selon le potocol dans PMID :18083205. HDP-2P purifié à partir de HDP-2 par DEAE Sephadex A-50 & nbsp ;   ;
Cardiolipine (cœur, bovine) (sel sodique), >99 %MacklinC916138
Coenzyme A, FUJIFILM Wako s NEFA kit   ;Lexington, MA, États-Unis
Tubage de dialyse membrane cellulose limite de poids moléculaire 1,0 kDaSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Shanghai, Chine & nbsp ;
Thermostat de réservoir d’eau à commande numérique   ;YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Pékin, Chine & nbsp ;
Balance analytique électronique de haute précision FA2004  ;Shanghai Maiyi Ltd. Co., Chine
JingHua 752 spectrophotomètre UV-Visible   ;Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Shanghai, Chine
L-&alpha ;-phosphatidylcholine (œuf, poulet), &ge ; 95%MacklinL799415
L-&alpha ;-phosphatidylinositol (foie, bovin) (sel de sodium), &ge ; 99%MacklinL780292
L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (cerveau, porcin) (sel d’ammonium), &ge ; 99%MacklinL996223
L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4-phosphate (cerveau, porcin) (sel ammonium), 99 %MacklinL970250
L-&alpha ;-phosphatidylsérine (cerveau, porcin) (sel de sodium), >99 %MacklinL864755
Agitateur magnétique JB-3  ;Shanghai Leici JB-3
Mesure de pH PHS-3C  ;Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., Chine
Microcentrifugeuse TGL-16B & nbsp ;Shanghai 3 Anting Co., Shanghai, Chine
Distributeur ultrasonore Yt-JY96-IIN  ;Shanghai Yetuo Technology Co., Ltd., Chine
Pompe à vide TW-1MTingwei Co. Ltd., Wenling, Chine

Références

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Mots-clés

Perm abilit des liposomesphosphates de phosphatidylinositolactivit de la phospholipasemod lisation mol culairehydrolyse des liposomesliposomes de phosphatidylcholinegroupes phosphate d inositolprotection membranaire
Essai de perméabilité de la membrane des liposomes pour étudier les effets des groupes phosphate de phosphatidylinositol sur l’action membranotrope du venin PLA2
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