Rôle potentiel de l’axe de signalisation PGE 2-EP4-Ca2+ dans l’arthrose post-traumatique

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour décrire systématiquement les méthodes d’établissement et d’évaluation des modèles d’arthrose chez le rat, par comparaison, fournissant des preuves scientifiques de la pathogenèse différente entre l’arthrose induite par des lésions mécaniques aiguës et l’arthrose chronique induite par des facteurs métaboliques/environnementaux. Le modèle ACLT est l’objectif principal, mettant l’accent sur les changements dans la voie de signalisation du dysfonctionnement mitochondrial EP4-Ca²⁺.

Résumé

L’arthrose post-traumatique (AOTP) est une maladie articulaire dégénérative déclenchée par un traumatisme ou un stress mécanique intense, entraînant une dégénérescence du cartilage articulaire et une déficience fonctionnelle. La prostaglandine E2 (PGE₂) contribue de manière significative à la dégradation du cartilage après une lésion mécanique en activant son récepteur, le récepteur 4 de la prostaglandine E (EP4), sur les membranes chondrocytaires. L’homéostasie du cartilage articulaire repose principalement sur l’équilibre dynamique entre la dégradation et la réparation du cartilage, un processus finement régulé par les chondrocytes. Il a été démontré que la voie de signalisation Ca²⁺/Calmodulin-dependent Protein Kinase II (CAMKII) joue un rôle essentiel dans la médiation de la restauration de la fonction des chondrocytes. Dans cette étude, nous avons observé une augmentation de l’expression de l’EP4, du récepteur de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3R) et du CaMKII phosphorylé dans les chondrocytes stimulés par l’interleukine-1 bêta (IL-1β), suggérant un lien possible entre la signalisation EP4 et la dérégulation calcique. Cependant, les preuves directes confirmant l’implication de l’axe EP4-Ca²⁺/CaMKII dans la PTOA font encore défaut. D’autres investigations utilisant des interventions génétiques ou pharmacologiques sont nécessaires pour clarifier ce mécanisme potentiel. Ces résultats fournissent une base préliminaire pour explorer l’homéostasie calcique et la signalisation EP4 comme cibles pour le traitement par PATOA.

Introduction

Bien que l’activité physique soit largement promue pour ses bienfaits pour la santé, elle reste une cause majeure de blessures musculo-squelettiques des membres inférieurs, ce qui peut entraîner divers résultats indésirables¹. Parmi ceux-ci, la PTOA est devenue un fardeau croissant pour les adolescents et les jeunes adultes qui subissent des blessures articulaires à l’âge de² ans. De manière alarmante, environ 48 à 52 % des personnes qui subissent des blessures articulaires liées au sport développent une PTOA dans les 11 à 17 ans ^3,4. L’articulation du genou, l’une des articulations les plus fréquemment blessées dans les sports et les activités récréatives des jeunes, est particulièrement vulnérable dans la progression d’une blessure articulaire à une PTOA. Une étude prospective a révélé que les personnes souffrant de blessures au genou ont un risque 10 fois plus élevé de développer une arthrose du genou confirmée par radiographie 12 à 20 ans après la blessure par rapport aux personnes non blessées⁵. De plus, chez les jeunes adultes, les évaluations radiographiques ont montré que les joueuses de football atteintes de lésions de transsection du ligament croisé antérieur (LCA) ont un risque de 51 % de développer une PTOA dans les 12 ans, tandis que les joueurs masculins ont un risque de 41 % dans les 14 ans⁵. Ces résultats mettent en évidence l’impact négatif à long terme des blessures articulaires liées au sport sur la santé musculo-squelettique. Par conséquent, il est crucial de comprendre les mécanismes pathologiques irréversibles sous-jacents au développement de la PTOA pour identifier des stratégies d’intervention appropriées visant à atténuer la progression de la maladie.

La dérégulation précoce de l’homéostasie Ca²⁺ est l’un des indicateurs clés de l’initiation de la PTOA⁶. Ca²⁺ se lie à la calmoduline (CaM) pour former un complexe Ca²⁺/CaM qui peut interagir avec CaMKII, soulageant sa conformation auto-inhibitrice et régulant l’activité kinase⁷. Chez l’OA humain et murin, l’expression de CaMKII phosphorylé (la forme activée de CaMKII) est augmentée, tandis que l’utilisation d’inhibiteurs de CaMKII bloque cette élévation des niveaux de phosphorylation, conduisant à la destruction du cartilage articulaire⁸, démontrant le rôle régulateur important de Ca²⁺/CaMKII dans la médiation de l’homéostasie du cartilage OA. Normalement, ces changements sont influencés de manière cruciale par l’activation des mécanismes inflammatoires dans le développement de la PTOA. Des niveaux élevés de PGE₂, en tant que médiateur pro-inflammatoire clé de la douleur, influencent la progression de l’arthrose en activant le récepteur EP4. Plus précisément, l’inactivation conditionnelle de l’EP4 dans le cartilage articulaire améliore la formation du cartilage et le métabolisme anabolique, tout en inhibant l’hypertrophie des chondrocytes et le catabolisme, favorisant ainsi la régénération d’un cartilage articulaire stable et mature au lieu du fibrocartilage et soulageant les douleurs articulaires⁹. Compte tenu du rôle crucial de la voie de signalisation Ca²⁺/CaMKII dans la physiologie des chondrocytes et de l’implication reconnue du récepteur EP4 dans la progression de l’arthrose, cette étude visait à explorer si l’activation d’EP4 est associée à des modifications de la signalisation calcique et à un dysfonctionnement mitochondrial au cours du développement de la PTOA. Bien que la relation causale entre EP4 et la dérégulation de Ca²⁺ reste à déterminer, les données disponibles suggèrent un possible lien mécaniste qui justifie une enquête plus approfondie.

Cette étude se concentre sur les mécanismes potentiels liant l’activation du récepteur EP4 à la signalisation Ca²⁺ et le dysfonctionnement mitochondrial au cours du développement de la PTOA. Par rapport aux méthodes de diagnostic traditionnelles, telles que les techniques d’imagerie qui détectent la progression de la PTOA, et aux approches thérapeutiques actuelles, telles que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) pour le soulagement des symptômes, notre approche vise à révéler des perturbations précoces de la signalisation intracellulaire dans la pathogenèse de la PTOA. Cette connaissance mécaniste permet de mieux comprendre l’apparition et la progression de la maladie, offrant de nouvelles voies pour un diagnostic précoce et des interventions ciblées. Par conséquent, cette étude a établi un modèle de rat PTOA induit par la section du ligament croisé antérieur (ACLT) pour imiter les lésions mécaniques couramment observées chez les athlètes ayant un contrôle moteur altéré lors d’une activité physique aiguë ou chronique. Ce modèle sert de représentation optimale des lésions articulaires mécaniques post-traumatiques, offrant une plate-forme reproductible pour étudier à la fois les changements histopathologiques et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Un régime riche en graisses et un groupe d’exposition à un environnement humide (FD) sert de contrôle positif, visant à simuler les facteurs de risque métaboliques et environnementaux associés à l’arthrose chronique. Le premier modélise les lésions aiguës causées par un traumatisme mécanique, tandis que le second représente un modèle de maladie naturelle induite par des troubles métaboliques et des facteurs environnementaux, bien que la pathogenèse finale dans ce groupe puisse ne pas suivre l’axe mitochondrial EP4-Ca².

Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital provincial de médecine chinoise du Guangdong (numéro d’approbation éthique : 2024014-2). L’étude a été menée conformément à la réglementation sur l’utilisation éthique des animaux de laboratoire stipulée par le Conseil d’État de la République populaire de Chine.

1. Animaux

1. Utiliser des rats SPF consanguins de Sprague-Dawley (SD) pour réduire les effets confusionnels potentiels associés au cycle œstral. Sélectionnez un total de neuf rats SD mâles, âgés de 4 semaines et pesant entre 90 g et 100 g, pour cette expérience.
   REMARQUE : Ces rats proviennent d’un fournisseur d’animaux de laboratoire agréé en Chine (numéro de certificat : 20240410Aazz0619000774).
2. Maintenir tous les animaux dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques (FPS). Maintenir un environnement contrôlé à une température de 24 ± 2 °C avec une humidité moyenne de 60 ± 1 % et un cycle lumière/obscurité de 12 heures.
3. Assurez-vous que les rats ont un accès libre à de l’eau acidifiée et à un régime alimentaire standard pour rongeurs.

2. Construction et intervention de modèles animaux

1. Acclimatez les rats pendant une période de 2 semaines au centre d’alimentation. Répartissez au hasard les rats en trois groupes à l’âge de 6 semaines : groupe témoin, groupe PTOA et groupe FD, avec trois rats dans chaque groupe.
2. Maintenez le groupe de contrôle dans des conditions standard.
3. Anesthésier le groupe PTOA avec de l’isoflurane (4 % pour l’induction et 1 % à 2 % pour l’entretien).
4. Exposer chirurgicalement les articulations bilatérales du genou via une incision cutanée longitudinale en utilisant une approche parapatellaire médiale.
5. Effectuez l’ACLT à l’aide d’un scalpel et confirmez la transsection complète en effectuant un test positif au tiroir antérieur.
   REMARQUE : Une transsection bilatérale du LCA a été effectuée pour assurer la cohérence du modèle et réduire la variabilité individuelle. La moyenne des données des deux genoux a été calculée pour obtenir une valeur par animal à analyser.
6. Transférez périodiquement les rats des groupes FD dans une chambre climatisée, située dans la même installation. Soumettez ces rats à un régime riche en graisses.
   REMARQUE : Le régime riche en graisses contenait 20 % de saccharose, 15 % de saindoux, 1,2 % de cholestérol, 0,2 % de cholate de sodium, 10 % de caséine, 0,6 % d’hydrogénophosphate de calcium, 0,4 % de poudre de calcaire, 0,4 % de prémélange et 52,2 % d’aliment de base. Le profil nutritionnel de l’aliment témoin était le suivant : 19 % de protéines, 31 % de matières grasses et 50 % de glucides, avec un rapport calorique de 17 % de protéines, 37 % de matières grasses et 46 % de glucides.
7. Maintenir les conditions environnementales à l’intérieur de la chambre climatique à une température de 24 ± 2 °C, un taux d’humidité de 90 ± 4 % et un cycle d’éclairage quotidien de 12 heures.
   REMARQUE : En raison du risque accru de croissance bactérienne dans un environnement à une température et une humidité aussi élevées, stérilisez l’eau potable et les aliments et réapprovisionnez-les quotidiennement pour minimiser la contamination. La durée totale de l’intervention expérimentale était de 12 semaines.

3. Analyse de la marche (empreintes de pas)

1. Effectuer une analyse de l’empreinte 12 semaines après le début du traitement chez les rats modèles, en utilisant la méthode décrite précédemment¹⁰.
2. Enduisez les surfaces ventrales des pattes arrière des rats avec de l’encre rouge, et ils ont été autorisés à marcher le long d’un chemin de 100 cm de long et 8 cm de large, recouvert de papier blanc.
3. Pour encourager les rats à bouger, placez une chambre sombre à la fin du chemin pour encourager le mouvement vers l’avant.
4. Prenez trois mesures séquentielles pour obtenir des valeurs moyennes pour chaque paramètre, y compris l’amplitude de la foulée et la longueur du pas, qui ont été utilisées pour évaluer l’irrégularité.
5. Déterminez l’amplitude de foulée (cm) en mesurant la distance parcourue par la même patte arrière entre deux pas successifs.
6. Définissez la longueur du pas (cm) comme la distance horizontale entre les pattes arrière gauche et droite.
7. Mesurez l’angle de la patte (°) comme l’angle entre le deuxième orteil et le calcanéum, par rapport à une ligne horizontale¹¹.
8. Mesurez la longueur de foulée, la longueur de pas et l’angle de la patte directement sur les images d’empreintes numérisées à l’aide du logiciel Image-Pro Plus (version 6.0), à l’aide de ses outils intégrés de mesure de distance et d’angle.
   REMARQUE : Ces paramètres de marche sont cruciaux pour identifier les déficiences fonctionnelles subtiles dans les premiers stades de l’arthrose. Les patients peuvent présenter une réduction de la foulée et de la longueur des pas pour protéger les articulations douloureuses, tandis que l’augmentation de l’angle des orteils et l’asymétrie de la marche se produisent souvent comme réponses compensatoires à l’instabilité articulaire induite par la douleur.

4. Mesure du diamètre du joint

1. Mesurez le diamètre du joint à l’aide d’un micromètre en spirale calibré (mm) après modélisation dans chaque groupe.
   REMARQUE : Au fur et à mesure que l’arthrose progresse, les patients présentent généralement un gonflement et une douleur articulaires. Un degré plus élevé de gonflement peut indiquer un stade plus grave de la maladie.

5. Mesure de la force de préhension

1. Mesurez la force de préhension des membres postérieurs à l’aide d’un appareil de mesure de la force de préhension numérique équipé d’une grille de traction, d’un appareil de mesure de la force équipé d’une grille de traction (90 mm × 90 mm).
   1. Tenez doucement le rat par la queue et la peau à l’arrière du cou.
   2. Abaissez l’animal jusqu’à ce que ses membres postérieurs saisissent fermement la grille, puis tirez-le régulièrement horizontalement le long de l’axe du capteur de force jusqu’à ce qu’il relâche sa prise.
   3. Répétez le test trois fois par animal. Enregistrez la valeur la plus élevée comme force de préhension maximale.
      REMARQUE : Lors de l’essai de force de préhension des membres postérieurs, immobilisez les membres antérieurs en les collant sur une surface en carton pour éviter l’engagement accidentel des membres antérieurs avec la grille de traction. La diminution de la force de préhension est indicative d’une diminution de la fonction musculaire et de déficits moteurs potentiels liés à la douleur associés à la progression de l’arthrose.

6. Isolement et culture de chondrocytes primaires

1. Isolez les chondrocytes primaires de rats Sprague-Dawley mâles âgés de 6 semaines.
2. Disséquez les têtes fémorales et les plateaux tibiaux pour recueillir environ 100 à 150 mg de tissu cartilagineux.
3. Lavez le mouchoir deux fois avec du PBS contenant 1 % de pénicilline-streptomycine.
4. Digérer le cartilage dans 5 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % à 3 °C pendant 30 min.
5. Coupez le cartilage en³ morceaux de 1 à 2 mm et digérez davantage dans 10 ml de collagénase II à 0,2 % à 37 °C pendant 4 h sur un agitateur à température constante.
6. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm, centrifuger à 300 × g pendant 5 min et jeter le surnageant.
7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu DMEM/F12 complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine.
8. Incuber les cellules à 3 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂.

7. Traitement cellulaire

1. Comptez les chondrocytes isolés à l’aide d’un hémocytomètre.
2. Ensemencer les chondrocytes dans des plaques à 6 puits à une densité de 2 × 10^{à 5} cellules par puits dans 0,1 mL de milieu de culture complet (DMEM/F12 complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine).
3. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 24 h pour permettre l’adhérence.
4. Pour établir un modèle PTOA inflammatoire in vitro , traitez les chondrocytes adhérents avec de l’IL-1β (10 ng/mL) pendant 48 h une fois que la confluence cellulaire atteint environ 80 %.
5. Pour le témoin positif au DF, dissoudre l’acide palmitique (PA, n° CAS 57-11-4) dans du chloroforme à une dilution de 1:1000 pour préparer une solution mère de 500 μM.
   1. Lorsque la confluence cellulaire atteint environ 80 %, ajouter 1 μL de la solution mère de PA par 1 mL de milieu de culture pour atteindre une concentration finale de PA de 500 nM. Traitez les chondrocytes avec cette solution pendant 48 h.
6. Ajouter 1 μL de chloroforme (témoin véhicule) par 1 mL de milieu de culture pour contrôler les cellules sans PA.

8. Prélèvement de l’échantillon, décalcification et préparation de l’enrobage

1. Euthanasier les animaux 12 semaines après l’intervention par inhalation d’une surdose d’isoflurane (≥5 %) dans une chambre scellée pendant au moins 5 min, et confirmer l’arrêt complet de la respiration et du rythme cardiaque.
   REMARQUE : Cette méthode a été approuvée par le Comité d’éthique animale et est conforme aux lignes directrices nationales pour l’euthanasie sans cruauté des animaux de laboratoire.
2. Prélever les deux articulations du genou de trois rats par groupe (n = 3, total = 6 genoux) pour une évaluation histologique.
3. Fixer les échantillons dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à un rapport tissu/volume fixateur supérieur à 1:20 pendant plus de 48 h sur un agitateur à °C.
4. Rincez les mouchoirs à l’eau courante du robinet pendant 1 à 2 h pour éliminer le fixateur résiduel.
5. Détartrer les tissus dans une solution d’EDTA 0,5 M (pH 7,4, ~15 %) à un rapport tissu/solution de 1:20 pendant 21 jours à 3 °C, et remplacer par une solution fraîche tous les 3 jours.
6. Évaluez l’achèvement de la décalcification en sondant l’os avec une aiguille pour l’adoucir.
7. Lavez les mouchoirs décalcifiés sous l’eau courante du robinet pendant 2 h et placez-les dans des cassettes d’enrobage.
8. Déshydrater les échantillons à l’aide d’une série d’éthanol gradué : 75 % d’éthanol pendant 2 h (ou toute la nuit), 80 % d’éthanol pendant 2 h, 95 % d’éthanol pendant 0,5 h et deux fois d’éthanol absolu pendant 60 min. Immerger ensuite dans du xylène :éthanol 1:1 pendant 20 min.
9. Tissus clairs dans le xylène deux fois (10 min et 60 min).
10. Infiltrez les tissus avec de la paraffine dans l’ordre suivant : xylène :paraffine (1:1) pendant 15 min, paraffine douce à 52-5 °C pendant 1 h (deux fois), puis paraffine dure à 56-5 °C pendant 30 min.
11. Enrobez les tissus à l’aide d’un système d’enrobage de paraffine (par exemple, Leica, réglé à 6 °C) et transférez les blocs sur une plaque froide à -2 °C pendant 2 h.
12. Sectionner les blocs de paraffine de manière sagittaire à l’aide d’un microtome.
13. Faites flotter les rubans dans un bain-marie à 4 °C et montez-les sur des lames en verre propres.
14. Faites sécher à l’air les sections montées et faites-les cuire au four à 60 °C pendant 2 h pour éliminer les résidus de paraffine.
15. Déparaffiniser les sections en les immergeant séquentiellement dans du xylène (10 min), du xylène frais (10 min), de l’éthanol absolu (5 min), de l’éthanol absolu frais (5 min), de l’éthanol à 90 % (5 min) et de l’éthanol à 75 % (5 min), puis rincer à l’eau du robinet avant de colorer.

9. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)

1. Des coupes de tissus déparaffinés et réhydratés ont été immergées dans une solution de coloration à l’hématoxyline à 0,5 % pendant 3 à 5 minutes à température ambiante (RT ; ~2 °C), suivies d’un rinçage abondant à l’eau courante du robinet.
2. Traitez brièvement les sections avec une solution de différenciation de l’hématoxyline pendant 2 à 5 s et rincez à l’eau courante du robinet.
3. Effectuer le bleuissement en immergeant les sections dans une solution de bleuissement à l’hématoxyline pendant 2 à 5 s, suivi d’un rinçage.
4. Déshydrater les sections à l’éthanol à 85 % et à 95 % pendant 5 min chacune, puis colorer à l’éosine Y à 0,05 % (alcoolique) pendant 5 min.
5. Déshydrater deux fois dans de l’éthanol absolu (5 min chacun), puis éclaircir dans du xylène (5 min), suivi du xylène frais (5 min).
6. Montez les sections avec du baume neutre et recouvrez avec une lamelle.
   REMARQUE : Dans le cartilage bien conservé, l’hématoxyline colore les noyaux en bleu et l’éosine colore la matrice en rose. Le cartilage endommagé présente une perte de chondrocytes, une fibrillation et une matrice désorganisée.

10. Safranin O - coloration vert rapide (SOFG)

1. Colorer des sections avec une solution Fast Green à 2 % pendant 1 à 5 minutes à RT. Laver à l’eau courante du robinet jusqu’à ce que le cartilage devienne incolore.
2. Différencier brièvement les sections dans de l’acide chlorhydrique à 1 % pendant 10 à 15 s, puis rincer abondamment à l’eau courante.
3. Colorer des sections avec une solution de safranine O à 0,2 % pendant 5 à 10 s, puis se déshydrater rapidement par quatre changements d’éthanol absolu (3 à 5 s chacun).
4. Des sections claires au xylène (5 min), suivies de xylène frais (5 min).
5. Montez les diapositives avec du baume neutre et recouvrez avec une lamelle.
   REMARQUE : La safranine O colore les protéoglycanes du cartilage en rouge, tandis que le Fast Green colore les tissus osseux/fibreux en vert. La perte de rouge indique l’épuisement et la dégénérescence des protéoglycanes.
6. Évaluez les changements histologiques à l’aide du système de notation OARSI (Osteoarthritis Research Society International). Mesurer la largeur de l’espace articulaire et l’épaisseur du cartilage pour évaluer la dégénérescence structurelle. Capturez des images au microscope optique (par exemple, ECLIPSE Ti2-E) à 4× (barre d’échelle = 50 μm) et 20x (barre d’échelle = 10 μm).
   REMARQUE : Utilisez le logiciel d’imagerie du système pour la capture d’images et ImageJ (v1.48v) pour l’analyse. Calibrez les images via Analyser > régler l’échelle avec un micromètre. Pour chaque articulation, quantifiez cinq champs aléatoires de trois sections sagittales à l’aide d’une analyse à l’aveugle par trois observateurs indépendants.

11. Micro-μ CT

1. Disséquez les articulations du genou du rat 12 semaines après l’intervention et fixez-les immédiatement avec du paraformaldéhyde à 4 % à RT pendant 24 h pour préserver la morphologie des tissus.
2. Rincez les échantillons fixés avec du PBS et stockez-les dans de l’éthanol à 70 % jusqu’au balayage.
3. Montez chaque échantillon d’articulation du genou sur un porte-échantillon dédié avant le balayage. Alignez l’articulation le long de son axe long pour minimiser les artefacts de mouvement.
4. Effectuez un balayage micro-CT à l’aide d’un système micro-CT avec les paramètres de balayage suivants : tension des rayons X 70 kV, courant 100 μA et puissance 7 W.
5. Acquérez quatre images par projection et empilez-les pour améliorer la qualité de l’image, avec une taille de pas de rotation de 0,72°, effectuant une rotation complète de 360°.
6. Réglez la taille du voxel résultant (épaisseur de la tranche) à 15 μm, fournissant des images haute résolution adaptées à l’analyse de l’os trabéculaire.
7. Définir la région d’intérêt (ROI) entre la plaque de croissance tibiale proximale et le plateau tibial, en se concentrant sur l’os sous-chondral du fémur et du tibia.
8. Reconstruisez les données de numérisation brutes en images en coupe transversale à l’aide d’un logiciel de reconstruction.
9. Importer les piles d’images reconstruites dans un logiciel approprié pour l’analyse morphométrique quantitative.
10. Évaluer les paramètres clés, notamment la fraction volumique osseuse (BV/TV, %), la densité minérale osseuse (DMO, g/cm³) et la séparation trabéculaire (Tb.Sp, mm).
11. Pour une visualisation qualitative et tridimensionnelle, utilisez un logiciel de visualisation 3D pour générer des rendus volumétriques de la microarchitecture osseuse.
12. Effectuer une évaluation visuelle pour confirmer l’intégrité structurale et les changements morphologiques observés dans les données quantitatives.
    REMARQUE : Tous les traitements et analyses d’images ont été effectués par des opérateurs en aveugle pour garantir des résultats impartiaux.

12. Élisa

1. Anesthésier les rats 12 semaines après l’intervention. Exposez et disséquez soigneusement l’aorte abdominale pour prélever des échantillons de sang.
2. Laissez le sang prélevé coaguler à la RT pendant 30 min, puis centrifugez-le à 755 × g (équivalent à 3000 tr/min, à l’aide d’une centrifugeuse avec un rayon de rotor de 7,5 cm) à °C pendant 15 min.
3. Séparez et stockez le sérum pour une mesure ultérieure des niveaux de PGE₂ à l’aide d’un kit ELISA disponible dans le commerce.
4. En parallèle, ensemencez les chondrocytes primaires et cultivez-les pendant 24 h, suivis d’un traitement à l’IL-1β et au PA pendant 48 h, selon le protocole de traitement cellulaire établi. Après l’intervention, collecter et analyser les surnageants de culture pour la concentration en PGE₂ à l’aide du même kit ELISA.

13. RT-PCR quantitative

1. Extrayez l’ARN total d’échantillons cellulaires à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN commercial (TRIzol).
2. Synthétisez l’ADNc à l’aide d’un kit de transcription inverse (avec un dissolvant d’ADNg) et stockez l’ADNc résultant à -8 °C pour une analyse ultérieure.
3. Effectuez une PCR quantitative à l’aide de SYBR Green et calculez les niveaux d’expression relatifs à l’aide de la méthode 2−ΔΔCt.
   REMARQUE : Les séquences d’amorces utilisées étaient les suivantes : β-actine en avant : ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC ; β-actine inverse : CTGACCCATACCCACCATCAC ; EP4 à l’avant : GGCACATTGTTGGTAAGCCC ; EP4 avant : GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG ; COX-2 en avant : GATGACGAGCGACTGTTCCA ; Revers de la COX-2 : TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Analyse par transfert Western

1. Lyser les cellules avec le tampon RIPA sur de la glace pendant 30 min.
2. Séparer les échantillons de protéines par SDS-PAGE pendant 90 min, puis les transférer sur des membranes de nitrocellulose pendant 2 h.
3. Bloquez les membranes avec 5 % de BSA et lavez-les avec une solution tamponnée au phosphate.
4. Effectuer un immunotransfert à l’aide d’anticorps spécifiques.
   REMARQUE : Les anticorps et leurs dilutions respectives étaient les suivants : anti-MMP9 (1:1000), anti-collagène II (1:1000), anti-COX2 (1:1000), anti-CaMKII (1:1000), anti-p-CaMKII (1:1000), anti-IP3R (1:1000), anti-Cyt-C (1:1000) et anti-β-actine (1:2000).
5. Après une nuit d’incubation avec des anticorps primaires, laver les membranes avec du TBST et incuber pendant 1 h avec des anticorps secondaires : souris-HRP (1:2000) ou lapin-HRP (1:2000) dans l’obscurité.
6. Après un autre lavage avec TBST, effectuer la détection des protéines à l’aide d’un kit de chimiluminescence amélioré.
7. Analysez les données avec le logiciel ImageJ (version 1.48v).

15. Coloration par immunofluorescence

1. Cultivez des chondrocytes sur des lamelles dans des plaques de 12 puits jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 80 %.
2. Après un traitement avec de l’IL-1β et du PA pendant 48 h, ou aucun traitement en tant que contrôle, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 15 min à RT.
3. Perméabiliser les cellules avec du PBS contenant 0,2 % de Triton X-100 pendant 15 min.
4. Lavez les cellules trois fois avec du PBS (5 min chacune), puis incubez-les avec de l’anticorps primaire (anti-IP3R, dilution 1:200) dans un tampon de dilution d’anticorps à °C pendant la nuit.
5. Exposer les cellules à une dilution de 1:500 d’anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine pendant 1 h.
6. Contre-colorer les cellules avec une solution de DAPI de 5 μg/mL pendant 10 min.
   REMARQUE : Les images de fluorescence ont été acquises à l’aide d’un objectif 40x (barre d’échelle = 2 μm). Toutes les images ont été traitées avec le logiciel ZEN et quantifiées avec ImageJ (version 1.48v), en suivant des procédures d’étalonnage cohérentes.

16. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de GraphPad Prism (version 8.0.2).
2. Avant d’appliquer des tests paramétriques, évaluez les données pour la distribution normale à l’aide du test de Shapiro-Wilk et l’homogénéité de la variance à l’aide des tests de Brown-Forsythe et Bartlett.
3. Utilisez l’ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de Tukey pour les comparaisons entre plusieurs groupes, et appliquez un test t de Student bilatéral non apparié pour les comparaisons à deux groupes.
4. Considérez une valeur P inférieure à 0,05 comme statistiquement significative.
5. Présentez toutes les données sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET) provenant d’au moins trois expériences indépendantes.

Résultats

La PTOA induite par l’ACLT présente une destruction prématurée du cartilage et des déficits comportementaux par rapport à la KOA chronique induite par la DF (Figure 2 et Figure 3)
Le rétrécissement de l’espace articulaire et la dégénérescence du cartilage sont les principaux résultats de l’arthrose. Des études antérieures ont révélé que le surpoids et les facteurs environnementaux (p. ex., le climat humide) p...

Discussion

Par rapport à l’arthrose chronique induite par des facteurs environnementaux et alimentaires, le traumatisme articulaire induit par l’ACLT entraîne une progression plus rapide de la maladie. Nos résultats, basés sur des évaluations comportementales comprenant l’enflure des articulations, la force de préhension des membres postérieurs et l’analyse de la démarche, ont révélé des différences significatives entre le groupe témoin, le groupe PTOA et le groupe témoin positif induites par des f...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,2 % de collagénase II	Sigma-Aldrich, États-Unis	N° CAS : 9001-12-1	Isolement et culture de chondrocytes primaires
0,2 % Triton X-100	Beyotime, Chine	ST795	Immunofluorescence
0,25 % trypsine-EDTA	Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.	AR1071	Décalcification
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco, États-Unis	25200072	Isolement et culture de chondrocytes primaires
Solution fixatrice de paraformaldéhyde à 4 %	Biyuntian, Chine	Réf. P0099-3L	Fixation tissulaire
Anticorps anti-CaMKII	Huabio, Chine	ET1608-47 (en anglais)	Transfert Western (1:1000)
Anticorps anti-collagène II	Abcam, Royaume-Uni	AB34712	Transfert Western (1:1000)
Anticorps anti-COX2	Abcam, Royaume-Uni	AB179800	Transfert Western (1:1000)
Anticorps anti-Cyt-C	Selleck, Chine	Réf. F2534	Transfert Western (1:1000)
Anticorps anti-IP3R (B-2)	Santa Cruz, États-Unis	SC-377518	Transfert Western (1:1000)
Anticorps anti-MMP9	Abcam, Royaume-Uni	AB76003	Transfert Western (1:1000)
Anticorps anti-p-CaMKII	Selleck, Chine	F0342	Transfert Western (1:1000)
Anticorps anti-&bêta-actine	Technologie de signalisation cellulaire (CST), États-Unis	8H10D10	Transfert Western (1:2000)
Solution de blocage BSA	Sigma Aldrich, États-Unis	N/A	5 % BSA pour le blocage par transfert Western
Centrifugeuse (5424 R)	Eppendorf, Allemagne	N/A	755 & fois ; g vitesse de centrifugation
Chloroforme	Sigma Aldrich, États-Unis	N/A	Solvant pour PA
Chambre climatisée (RXZ-158A)	Fabricant national, Chine	N/A	Modèle d’environnement humide
Kit de transcription inverse couleur	Invitrogen, Suzhou, Chine	N/A	Synthèse de l’ADNc
CTAn logiciel  ;	Bruker	Versions 1.9 et 4.1	Pour l’analyse morphométrique quantitative
Logiciel CTVol  ;	Bruker	version 2.0	Pour une visualisation qualitative et tridimensionnelle
Solution de coloration DAPI	Beyotime, Chine	N/A	Coloration nucléaire (5 µ ; g/mL)
Indicateur numérique de la force de préhension	Puxin Instrument	N/A	Mesure de la force de préhension des membres postérieurs
DMEM/F12 Moyen	Corning, États-Unis	N/A	Milieu de culture cellulaire
EDTA (Acide éthylènediaminetétraacétique)	Aladin	N/A	Décalcification des tissus osseux
Kit ELISA pour PGE2	Elabscience, Wuhan, Chine	Réf2E-EL-0034	Détection ELISA
Kit de chimiluminescence améliorée	Millipore, États-Unis	WBKLS0500	Détection par transfert Western
Éthanol	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Numéro d’identification commerciale : 64-17-5	Déshydratation tissulaire
Sérum fœtal bovin (FBS)	Corning, États-Unis	N/A	Concentration de 10 % pour la culture
IgG anti-lapin de chèvre étiquetés FITC	Beyotime, Chine	Trousse P0179	Immunofluorescence (1:500)
Prisme GraphPad	GraphPad Software, États-Unis	Édition 8.0.2	Analyse des données
L’hématoxyline et l’éosine (H& E) Kit de coloration	Servicebio, Wuhan	G1005	Histologie
IL-1 et bêta ;	PeproTech, États-Unis	400-01B	10 ng/mL pour le modèle de cellule PTOA
ImageJ	NIH, États-Unis	Version 1.48v	Analyse d’images
Logiciel Image-Pro Plus	Cybernétique des médias	Version 6.0	Analyse quantitative de la marche à partir d’empreintes de pas numérisées
L’isoflurane	Shanghai Yaji Biologique	YS1412C	Anesthésie pour la chirurgie animale
Centre d’intégration Leica	Microsystèmes Leica	EG1160	Enrobage de paraffine
Leica Microtome	Microsystèmes Leica	RM2235	Section des tissus inclus dans la paraffine
Bain-marie Leica	Microsystèmes Leica	HI1210	Sections de paraffine flottantes
Microscope optique (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Japon	N/A	Observation histologique
Scanner Micro-CT (ZKKS-MCT-Sharp)	Fabricant national, Chine	N/A	Imagerie osseuse
Souris - Anticorps secondaire HRP	Technologie de signalisation cellulaire (CST), États-Unis	7076	dilution 1:2000
Logiciel d’imagerie NIS-Elements	Nikon	N/A	Capture et analyse d’images microscopiques
Logiciel NRecon	Bruker, Allemagne	Version 1.6	Reconstruction par tomodensitométrie
Acide palmitique (PA)	Sigma Aldrich, États-Unis	Réf. P0500	500 et micro ; Crosse M pour modèle de cellule FD
Cire de paraffine pour sectionnement, grade pathologique, point de fusion 52-54 ° ; C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500g	Utilisé pour l’enrobage de paraffine pendant le traitement des tissus
Cire de paraffine pour sectionnement, grade pathologique, point de fusion 56-58 ° ; C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500g	Utilisé pour l’enrobage final de cire dure dans la coupe de tissus
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	Lavage cellulaire et rinçage des tissus
Pénicilline-streptomycine	Corning, États-Unis	N/A	1 % pour la culture cellulaire
Membrane PVDF (0,45 & micro ; m)	Millipore, États-Unis	IPVH00010	Membrane Western blot
Anticorps secondaire Rabbit-HRP	Technologie de signalisation cellulaire (CST), États-Unis	7074	dilution 1:2000
Encre rouge	HÉROS	HÉROS 204	Suivi de l’empreinte dans l’analyse de la marche
Tampon de lyse RIPA	Keygen, Chine	N/A	Extraction des protéines
Safranin O&ndash ; Kit de coloration verte rapide	Servicebio, Wuhan	G1053	Coloration histologique
Micromètre en spirale (pied à coulisse)	Huangshan, Chine	N/A	Mesure de la largeur du joint
Logiciel d’analyse de l’os sous-chondral (CTAn)	Bruker, Allemagne	Versions 1.9 et 4.1	Analyse morphométrique
SYBR Green PCR Master Mix	AG Scientific, Chine	N/A	Analyse qPCR
Réactifs Western blot (tampon RIPA, composants de gel SDS-PAGE, tampon de chargement, TBST, etc.)	Beyotime Biotechnology (Chine)	N/A (utilisé comme entrée de groupe)	Tous les réactifs de routine utilisés pour les procédures de transfert Western
Xylène	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	NCS : 1330-20-7	Nettoyage des tissus