Article de méthode

Hybridation in situ de l’ARN avec immunofluorescence séquentielle des protéines dans un essai en tandem

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DOI :

10.3791/68615

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10 octobre 2025

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1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole détaille l’hybridation in situ de l’ARN avec immunofluorescence séquentielle des protéines dans les tissus sur une plateforme automatisée pour caractériser les omiques multiples spatiales ciblées au niveau cellulaire.

Résumé

La fonctionnalité des cellules au sein d’un hôte ne dépend pas de signaux isolés. Au lieu de cela, tous les composants, des plus petites molécules d’ARN aux plus grandes protéines, doivent fonctionner en harmonie et en coordination au sein du corps humain. En tant que tel, l’importance des approches qui intègrent des investigations spatiales au niveau cellulaire dans plusieurs omiques est primordiale pour comprendre les interactions cellule-cellule et la progression de la maladie. La dissection du protéome et du transcriptome dans le même test spatial nous aide à comprendre non seulement ce qu’une cellule est chargée d’effectuer (ARN), mais aussi comment elle exécute ces instructions dans le contexte de la niche microenvironnementale dans laquelle elle se trouve (protéine). Ce manuscrit se concentre sur l’intégration de l’immunofluorescence séquentielle (SeqIF) avec l’hybridation in situ de l’ARN (ISH) avec un système microfluidique sur tissu pour l’étude de protéines et d’ARN à haut débit dans un contexte spatial (seqRNA-ISH+seqIF) qui permettra d’ajouter jusqu’à 12 cibles d’ARN et 24 protéines en une seule fois, avec des cibles protéiques supplémentaires pouvant être ajoutées via courses séquentielles. Cette méthode fournit une plate-forme multiomique ciblée séquentielle qui ne nécessite pas de prise en compte de la compatibilité des fluorophores et une optimisation poussée pour un plexage plus élevé. Cela permet de comprendre quels messages la cellule amorce ou envoie dans son microenvironnement. Cette approche ciblée permet de valider les méthodes de transcriptome entier tout en examinant les interactions entre l’ARN et les protéines de manière plus précise.

Introduction

Le fonctionnement complexe des cellules du corps humain repose sur une interaction complexe de signaux, allant de petites molécules d’ARN à de grandes protéines, tous travaillant en coordination1. Cette interaction souligne l’importance des approches intégratives qui examinent les interactions spatiales au niveau cellulaire à travers diverses couches omiques 2,3. De telles méthodologies sont essentielles pour comprendre la complexité des interactions cellule-cellule et de la progression de la maladie. De nombreuses méthodes traditionnelles, telles que la cytométrie en flux4 et le séquençage unicellulaire5, les isolats cellulaires sont utilisés pour étudier des échantillons désagrégés afin d’identifier les rapports globaux des phénotypes présents dans un échantillon spécifique. Cependant, l’isolement des cellules pour l’analyse peut induire une activation ou des changements phénotypiques qui peuvent ne pas refléter avec précision leur biologie et leur fonction natives in situ6. Les méthodes avancées en biologie spatiale offrent de nouvelles stratégies pour étudier les cellules et leur microenvironnement sans compromettre le contexte de l’architecture tissulaire et les relations spatiales avec les cellules voisines à travers plusieurs types moléculaires 2,7.

L’intégration des analyses du transcriptome et du protéome au sein d’un même test spatial, sans isoler les cellules individuelles, offre une vue complète de la fonction cellulaire8. Cette méthode s’appuie sur les méthodes d’hybridation par fluorescence insitu (FISH) d’ARN à molécule unique, mais n’inclut pas les digestions par protéinase qui compliquent les interrogations séquentielles des protéines8. La flexibilité de l’approche à utiliser sur une seule section offre une résolution spatiale plus élevée et moins de traitement d’image pour intégrer et aligner les sections. Cette approche permet de mieux comprendre à la fois les instructions reçues par une cellule (ARN) et leur exécution (protéine) au sein de sa niche microenvironnementale spécifique. En combinant ces couches d’informations, les chercheurs peuvent obtenir des informations plus approfondies sur le comportement et la communication cellulaires.

Bien qu’il existe des méthodes manuelles, les progrès récents des technologies omiques spatiales ont permis des analyses plus complexes avec un plus grand nombre de marqueurs protéomiques examinés à l’aide du multiplexage manuel9. Ces approches ont inclus des progrès dans les tests de protéines et d’ARN-ISH 10,11,12,13,14, et des méthodologies automatisées qui nécessitent des anticorps conjugués spécifiques au système 15,16,17, l’imagerie par cytométrie de masse (IMC)18,19,20 et d’autres méthodologies de protéomique séquentielle fluorescente automatisée qui utilisent des antiboedies primaires et secondaires prêts à l’emploi 2,21,22. Ces technologies ont facilité soit la protéomique, soit la transcriptomique et la protéomique combinées à l’aide d’approches ciblées, et visualisent généralement ces deux technologies : l’ARN via des sondes et les protéines via des anticorps basés sur des conjugués similaires, permettant de co-détecter simultanément ou séquentiellement l’ARN et la protéine à l’aide de la même méthodologie ou des mêmes instruments. En fournissant une vue complète de l’activité cellulaire, ces types d’approches visent à améliorer notre compréhension de la communication cellulaire entre les cellules et leur microenvironnement. Il s’agit d’un outil précieux pour déchiffrer les complexités de l’interaction cellulaire, révélant potentiellement de nouvelles informations sur les processus physiologiques normaux et les mécanismes des maladies.

Ce protocole fournit des conseils pour l’intégration de l’hybridation in situ de l’ARN (ISH) avec immunofluorescence séquentielle (SeqIF) avec un système microfluidique sur tissu. Il s’agit d’un outil à haut débit pour l’étude de l’ARN et des protéines dans leur contexte spatial natif. Cette méthode (seqRNA-ISH+seqIF) permettra d’utiliser jusqu’à 12 cibles d’ARN et 24 cibles protéiques en une seule fois, avec des cibles protéiques supplémentaires pouvant être ajoutées via des exécutions séquentielles. Bien que ce protocole se concentre sur un système microfluidique spécifique, la manipulation des tissus, l’assurance qualité de l’ARN et la sélection et le titrage des anticorps peuvent être adaptés à d’autres méthodologies. Cependant, cette méthode utilise la récupération de l’antigène à pH 9,0 pour une récupération efficace et sans protéase de l’épitope, améliorant la stabilité de la protéomique tout en fournissant une transcriptomique ciblée, contrairement à l’ARN-ISH traditionnel à pH 6,0 avec de la protéase pour augmenter l’accessibilité de la sonde d’ARN, mais ne parvient pas à préserver le protéome8. La méthode seqRNA-ISH+seqIF est illustrée visuellement à la figure 1, démontrant l’amplification de l’ARN FISH suivie d’un clivage avant d’utiliser une méthode d’appariement d’anticorps primaires-secondaires qui utilise une élimination chimique douce des primaires et secondaires. La nature séquentielle du seqIF et de la détection permet de surmonter de nombreuses limitations liées à la compatibilité avec les fluorophores en utilisant des méthodologies séquentielles23. Cela réduit le besoin d’optimisation extensive nécessaire à la coloration simultanée dans les méthodologies de haut plex qui nécessitent une compensation pour le chevauchement spectral23.

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Protocole

Ce protocole utilise des coupes de tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) prélevées chez des patientes atteintes d’un carcinome séreux de l’ovaire de haut grade naïfs de traitement qui ont subi une chirurgie cytoréductrice primaire. Toutes les données cliniques ont été obtenues à partir du dépôt du cancer de l’ovaire du Département d’oncologie gynécologique et de médecine de la reproduction, selon des protocoles approuvés par le conseil d’examen institutionnel de l’Université du Texas MD Anderson. Le consentement éclairé écrit des patients a été obtenu par le personnel de la réception, et les études ont été menées conformément aux directives éthiques reconnues.

REMARQUE : Tous les réactifs, sauf indication contraire, sont dilués dans de l’eau désionisée sans nucléase.

1. Corrigez et intégrez des échantillons

REMARQUE : Le choix de la durée de fixation et de fixation impacte fortement la performance des dosages, et en général les dosages spatiaux sont le plus souvent réalisés avec FFPE car il préserve l’architecture pathologique. Ce protocole décrit l’utilisation des tissus FFPE, en tant que tel, le protocole suivant est suggéré pour les échantillons de tissus FFPE. Cependant, la qualité de l’ARN est affectée par les processus de fixation, tout comme les épitopes des protéines, mais dans une moindre mesure. Ces méthodes de fixation, la fixation incomplète et la dégradation de l’échantillon peuvent augmenter la liaison non spécifique dans la protéomique à base d’anticorps. Troisièmement, la fluorescence constitutive est généralement éteinte pendant le traitement FFPE, mais certains fluorophores persistent modérément et nécessitent des tests pour s’assurer qu’ils sont éteints.

  1. Sectionnez le tissu sur une épaisseur de ≤ 5 mm pour assurer une fixation uniforme et éviter les barrières de diffusion induites par les graisses. Fixez immédiatement les sections dans du formol tamponné à 10 % de phosphate (pH 7,0) à 4 °C pendant 24 h pour optimiser l’ARN et la protéine24.
  2. Traitez les tissus fixés dans un processeur de tissus ou traitez-les manuellement en suivant les étapes suivantes
    1. Coupes de tissus déshydratés dans de l’éthanol de qualité moléculaire dans de l’eau sans nucléases (70 %, 75 %, 95 % 2x, 100 % 3x pendant 1 h chacune).
    2. Ensuite, plongez le tissu dans le xylène 2 fois pendant 1 h chacune à température ambiante (~23 °C).
  3. Réchauffez la cire de paraffine à 60 °C. Immergez la boîte de mouchoirs dans de la cire de paraffine 2 fois pendant 1 heure chacune.
  4. Placez le tissu gonflé et orientez les tissus dans le moule, remplissez-le de cire de paraffine fraîche et laissez refroidir rapidement à 4 °C25.
    REMARQUE : Les meilleurs résultats pour l’ARN seront obtenus en complétant toutes les étapes dans les 48 heures.

2. Évaluation de la qualité de l’ARN

  1. Utilisez trois sections série, en exécutant les trois diapositives en parallèle ou en exécutant des diapositives de contrôle avant le panneau ciblé pour vous assurer que le blocage est suffisant. Les sondes de contrôle positif appariées ciblent les gènes d’entretien pour évaluer la qualité des tissus et l’intégrité spatiale à travers le tissu, qui peuvent être affectés par des différences de persévérance. Les témoins couramment utilisés comprennent UBC (un gène à forte expression), PPIB (expression modérée) et POLR2A (faible expression)26. Utilisez des ensembles de sondes de contrôle négatif, telles que Dab1 (un ARN de bactérie du sol) sur chaque canal de détection. En option, incluez toutes les sondes de contrôle positif et négatif sur le même échantillon à côté des sondes cibles. Dans cette configuration, placez les commandes négatives Dab1 dans les canaux T2 à T4, attribuez des commandes positives de l’expression la plus basse à l’expression la plus élevée à T1, T5 et T9, et assurez-vous que les sondes cibles occupent les canaux restants.
    FACULTATIF : De plus, pour les échantillons dont la qualité de l’ARN est inconnue, il peut être utile de déterminer une valeur de distribution de 200 (score DV200). Des scores DV200 supérieurs à 30 sont fortement recommandés, avec des échantillons de qualité supérieure de 50 ou plus préférés27. Ce score est une indication de la qualité de l’ARN, et une meilleure qualité de l’échantillon augmente la probabilité que l’ARN-ISH fonctionne efficacement27.

3. Précautions et préparations de l’ARN

REMARQUE : Il est préférable de décontaminer la zone des RNases et de l’essuyer, puis de vaporiser la zone de travail avec de l’éthanol à 70 % avant le traitement, en plus d’utiliser une zone exempte de RNases, portez toujours des gants propres, une blouse de laboratoire et un masque pour minimiser l’introduction de RNases par la peau ou l’haleine. N’utilisez que de l’eau et des consommables sans RNase et évitez de mettre la main dans les sacs de ravitaillement. Ces précautions, ainsi que le fait de garder les tissus/lames au frais et au sec, sont essentielles pour maintenir l’intégrité de l’ARN pendant les expériences.

  1. Coupez les sections sur des lames de verre chargées positivement avec un microtome et placez la région d’intérêt au centre de la lame, qui se coordonne avec la zone d’imagerie (varie selon le système ; ici, elle est d’environ 12,5 mm x 12,5 mm).
    REMARQUE : Gardez à l’esprit que l’épaisseur idéale pour chaque section est comprise entre 4 et 6 μm pour les tissus FFPE.
  2. Cuire les lames FFPE dans un four sec sans RNAse, tissu vers le haut, à 60 °C pendant au moins 1 h et jusqu’à la nuit pour les tissus adipeux ou les tissus qui sont autrement sujets au détachement.
  3. Prétraitement OPTIONNEL
    REMARQUE : Bien que le prétraitement soit facultatif, certaines étapes sont également facultatives, comme indiqué ci-dessous.
    1. Préparez du peroxyde d’hydrogène à 3 % : Dans un tube conique de 50 ml, ajoutez 5 ml de peroxyde d’hydrogène à 30 % à 45 ml de 1 x PBS. Conservez le peroxyde d’hydrogène restant à température ambiante (~23 °C), le couvercle fixé avec un parafilm, jusqu’à trois mois.
      REMARQUE : Le peroxyde d’hydrogène est un oxydant puissant. Tenir à l’écart des matériaux combustibles, des sources de chaleur et des métaux. À utiliser dans une zone de hotte chimique avec de l’équipement de protection individuelle (EPI, p. ex., lunettes de protection, gants et blouse de laboratoire). Évitez tout contact avec la peau, les yeux et l’inhalation. Rincer la peau à l’eau pendant 15 minutes si elle est exposée. Demandez de l’aide médicale en cas d’ingestion ou d’inhalation. Des concentrations plus élevées peuvent causer de graves brûlures et peuvent s’enflammer ou exploser avec des matières organiques ou certains métaux. Ajoutez toujours du peroxyde d’hydrogène à l’eau pour éviter les réactions violentes.
    2. Préparez du formaldéhyde à 3,7 % : Dans une hotte chimique, ajoutez 1 ml de formaldéhyde à 16 % pour 3,3 ml de 1 x PBS. Conservez le formaldéhyde enveloppé de parafilm jusqu’à trois mois.
      REMARQUE : Le formaldéhyde peut causer de graves lésions oculaires, une irritation respiratoire et est soupçonné de causer le cancer. Une exposition prolongée ou répétée peut entraîner une sensibilisation cutanée et des réactions allergiques. Utiliser uniquement dans une hotte chimique et porter l’EPI approprié (gants, lunettes de protection/écran facial, masque, blouse de laboratoire, etc.). Évitez le contact avec la peau, le contact oculaire et l’inhalation. Tenir à l’écart des sources de chaleur et des flammes nues. Éliminez le paraformaldéhyde et les matériaux contaminés comme déchets dangereux et ne préparez que la quantité nécessaire pour une utilisation immédiate si possible.
    3. Déparaffiniser en lavant la lame de tissu en la plaçant dans des tubes coniques de 50 mL contenant les éléments suivants : Xylène (40 mL) pour 3 lavages à 5 min chacun dans une hotte chimique.
      FACULTATIF : Au lieu du xylène, un agent de clarification histologique non base de xylène peut être utilisé, mais il laissera potentiellement des résidus de paraffine et affectera la qualité de l’image. Il s’agit de placer les tranches dans des tubes coniques de 50 mL contenant les éléments suivants : Agent nettoyant histologique sans base de xylène (40 mL) pour deux lavages de 15 min chacun. Les sections de blocs fabriqués avec de la cire d’abeille peuvent être difficiles à dépiaffiner avec du non-xylène. Pour les mélanges de cire/paraffine inconnus, il est recommandé d’utiliser le xylène avec les précautions de sécurité appropriées. Le xylène est une substance dangereuse et inflammable, et une exposition prolongée peut causer des dommages au système nerveux central, au foie et aux reins. Utiliser uniquement dans une hotte chimique et porter un EPI (par exemple, des gants, des masques et des blouses de laboratoire). Éliminer le xylène et les matières contaminées comme des déchets dangereux. En cas d’exposition, consultez immédiatement un médecin.
    4. Réhydratez-vous en lavant la lame de mouchoir en la plaçant dans un tube conique de 50 mL contenant les éléments suivants : 100 % d’éthanol (40 mL) pendant 2 lavages de 3 min chacun ; 95 % d’éthanol (40 mL) pour 2 lavages de 3 min chacun ; 70 % d’éthanol (40 mL) pour 2 lavages de 3 min chacun ; 50 % d’éthanol (40 mL), pour 2 lavages à 3 min chacun ; 30 % d’éthanol (40 mL) pour 2 lavages de 3 min chacun ; 1x lavage PBS (40 ml) pour 1 lavage à 2 min.
    5. La peroxydase bloque les tissus en les plaçant dans une chambre d’humidité à température ambiante (~23 °C) et en couvrant les tissus avec environ 100 à 200 μL de peroxyde d’hydrogène à 3 %, pour 1 lavage à 10 min, puis lavage des mouchoirs avec 1 lavage PBS (40 mL), pour 2 lavages à 2 min chacun.
      REMARQUE : Le blocage de la peroxydase est facultatif et éteint les enzymes peroxydases résiduelles dans les tissus pour réduire les colorations non spécifiques et peut réduire l’autofluorescence des tissus. Ceci est particulièrement important pour les tissus à forte autofluorescence, tels que la moelle osseuse, les reins, le foie, les poumons, l’intestin et le cerveau, où de forts signaux de fond peuvent interférer avec l’imagerie dans les bandes d’émission TRITC et FITC 28,29,30,31,32.
    6. Effectuez la fixation du formaldéhyde en plaçant le tissu dans une chambre d’humidité à température ambiante et en couvrant le tissu avec environ 100 à 200 μL de formaldéhyde à 3,7 %, pour 1 lavage à 10 min, puis lavez le mouchoir avec 1 lavage PBS (40 ml), pour 2 lavages à 2 min chacun.
      REMARQUE : Cette étape est facultative mais recommandée pour les tissus riches en graisse ou d’autres tissus qui ont des problèmes d’adhérence aux lames de verre.

4. Récupération d’antigènes

REMARQUE : La méthode de déparaffinage et de récupération d’antigène recommandée et décrite ici diffère de la méthode recommandée pour seqRNA-ISH+seqIF par le fabricant, qui utilise un dispositif de récupération d’antigène à chaleur contrôlée de grande capacité.

  1. Récupération d’antigènes induite par la chaleur (HEIR) à l’aide d’un micro-ondes
    1. À l’aide d’un four à micro-ondes à température contrôlée, ajoutez suffisamment de solution tampon HEIR pH 9,0 disponible dans le commerce (environ 250 ml) pour couvrir les lames dans le support de lames sous le thermomètre, le cas échéant.
      REMARQUE : La récupération de l’antigène pour l’ARN se fait généralement à un pH de 6,0, mais les méthodologies suivantes sont pour un pH de 9,0 pour une plus grande efficacité de la liaison des anticorps.
  2. Insérez les lames dans la solution tampon dans le micro-ondes et contrebalancez les chambres vides, le cas échéant, avec de l’eau distillée deux fois. Chauffe les lames au micro-ondes pendant 15 min à 107 °C (le temps total est généralement de 30 min pour que le tampon HEIR atteigne la température).
  3. Refroidissez les lames en les plaçant sous une hotte chimique à température ambiante pendant environ 20 min.
  4. Laver les lames en 1x PBS dans un tube conique de 50 mL (40 mL), pour 1 lavage pendant 2 min.
  5. Stockez les lames dans une enveloppe à vis ou un tube conique de 50 ml rempli de 1x PBS (ou d’un tampon multicoloration commercial) et procédez immédiatement, ou stockez-les à 4 °C jusqu’à 7 jours, mais idéalement moins de 72 h avant de procéder avec seqRNA-ISH+seqIF.

5. Préparez des solutions mères

  1. Préparer un tampon d’imagerie d’ARN 40x
    1. Préparez 40 tampons d’imagerie d’ARN en combinant 400 mg de tampon d’imagerie d’ARN en poudre et 25 ml d’eau déminéralisée sans nucléase
    2. Agiter la solution résultante jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute, puis aliquote dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (1 mL par tube)
    3. Congeler et conserver à -20 °C jusqu’à trois mois, en évitant les cycles de congélation-décongélation.
  2. Préparez 20 tampons salin-citrate de sodium (SSC)
    1. Dissoudre 157,3 g de chlorure de sodium (NaCl) et 88,2 g de citrate de sodium (Na3, C, 6H, 5O7) dans 800 mL d’eau déminéralisée sans nucléases.
    2. Mesurez le pH et titrez jusqu’à pH 7,0 goutte à goutte avec de l’acide chlorhydrique (HCl) 1 M.
    3. Autoclave pour stériliser.
      REMARQUE : Stérile 20x SSC peut également être acheté auprès de différentes sociétés. Après ouverture, conserver à température ambiante à 4 °C.
    4. Préparez 4 tampons SSC en combinant 1 mL de 20 souches souches avec 4 mL d’eau désionisée sans nucléases

6. ARN-ISH séquentiel + immunofluorescence séquentielle

REMARQUE : Toutes les étapes décrites dans le présent document sont adaptées du protocole du fabricant pour le seqRNA-ISH+seqIF décrit dans la table des matériaux, de sorte que la plupart des réactifs sont identifiés comme des réactifs commerciaux compatibles avec le système. Ces réactifs sont identifiés et/ou fournis par le fabricant et conçus pour être compatibles avec le système. Des modifications sont possibles et décrites dans la discussion, mais peuvent nécessiter des tests supplémentaires et un lavage fluidique pour éviter l’accumulation. Le logiciel calculera le volume total de réactifs nécessaires une fois que le panel et le protocole auront été conçus et saisis. Cependant, les modifications recommandées sont présentées. Le volume total variera toujours en fonction du nombre de cycles et d’objectifs utilisés par protocole. Cependant, les dilutions d’anticorps et d’ARN-ISH ne seront pas calculées par le système à moins que chaque combinaison individuelle ne soit saisie comme un élément unique dans la base de données. Pour ce protocole, 400 μL de cocktail d’anticorps sont nécessaires par lame d’échantillon.

  1. Préparation du système
    1. Avant seqRNA-ISH+seqIF, rincez soigneusement toutes les microfluidiques avec de l’eau sans nucléases.
    2. Vaporiser à l’extérieur du système avec une solution de décontamination à base d’ARNase, suivie d’éthanol à 70 %.
  2. Préparer les réactifs généraux
    1. Tampon de lavage : 50 ml de tampon multicoloration commercial compatible avec le système 20x + 950 ml d’eau déminéralisée sans nucléase
    2. Eau : 100 mL d’eau déminéralisée sans nucléases.
    3. Éthanol : 100 mL d’éthanol à 70 %.
    4. Tampon d’imagerie : 16 ml de solution d’imagerie commerciale compatible avec le système 10x + 140 ml d’eau désionisée sans nucléase + 4 ml de stock d’imagerie commercial compatible avec le système.
    5. Tampon d’élution : 152 de compatible système, commercial, Solution d’élution 1 + 8 de compatible système, commercial, Solution d’élution 2
    6. Tampon de trempe : 130 mL d’eau désionisée sans nucléases + 14 mL de solution de trempe compatible avec le système, commercial, Solution de trempe 2.
  3. Préparation des réactifs de coloration pour le protocole RNA-ISH
    REMARQUE : Cette étape peut être terminée la veille et stockée à 4 °C dans l’obscurité. Bien que les recommandations du fabricant indiquent que les sondes regroupées peuvent être utilisées jusqu’à un an, il n’est pas recommandé de regrouper les sondes plus d’une semaine à l’avance en raison de problèmes de contamination. Pour les sondes, il est préférable de tapoter ou de pipeter doucement de haut en bas pour mélanger et de les centrifuger doucement pour les faire tourner avant utilisation.
    1. Solution de perméabilisation sans protéinase compatible avec le système de charge à 500 μL par lame dans un tube de microcentrifugation compatible avec le système.
    2. Amplificateurs RNA-ISH en pool basés sur le cycle (tableau 1) pour un total de 500 μL par lame pour chacun des éléments suivants dans un tube de microcentrifugation compatible avec le système : i) arbres de queue ZZ pour les queues T1 à T4, ii) arbres de queue ZZ pour les queues T5 à T8, iii) arbres de queue ZZ pour les queues T9 à T 12.
    3. Fluorophores spécifiques à l’arbre de queue de piscine, adaptés à l’amplificateur, pour un total de 500 μL par lame pour chacune des éléments suivants dans un tube de microcentrifugation compatible avec le système : i) Fluorophore pour les arbres T1 à T4, ii) Fluorophore pour les arbres T5 à T8, iii) Fluorophore pour T9 à T 12.
      REMARQUE : Cette étape est sensible à la lumière
    4. Préparer 1 mL d’une dilution 1:200 de DAPI commercial (concentration stocke de 1 mg/mL) dans un tampon multicoloration commercial fabriqué avec de l’eau désionisée sans nucléase par lame
      REMARQUE : La procédure a été effectuée conformément au fabricant, qui inclut le DAPI dans le cadre des réactifs standard. Si vous utilisez des formulations personnalisées de DAPI diluées dans du N,N-diméthylformamide (DMF), les dilutions peuvent varier et des tests de titrage devront être effectués. Cependant, il est recommandé d’utiliser une concentration d’environ 1:1000-1:2000 d’une concentration d’origine de 1 mg/mL. En règle générale, il s’agit d’une concentration supérieure à la normale par rapport aux protocoles de coloration manuels, car il doit durer plusieurs cycles d’imagerie et de décapage. Les formulations DAPI fraîchement préparées en DMF ont tendance à être plus brillantes que les formulations DAPI disponibles dans le commerce. Les réactifs contenant du formamide, tels que le DAPI, doivent être répartis sous une hotte chimique. Le formamide peut provoquer une toxicité pour la reproduction et des lésions organiques et est soupçonné d’être cancérigène. Utilisez l’EPI approprié (p. ex., des gants et une blouse de laboratoire).
    5. Préparez le tampon d’imagerie ARN-ISH immédiatement avant l’utilisation avec de l’eau déminéralisée sans nucléases 12.125, 1,5 mL de tampon d’imagerie 10x B et 275 μL de tampon d’imagerie 40x Stock A (décongelé ou fraîchement préparé)
    6. Préparez jusqu’à 10 paires d’anticorps primaires (les anticorps protéiques primaires sont décrits dans le tableau 2) pour seqIF selon des dilutions testées par titrage dans un tampon multicolorant commercial pour un total de 400 μL par lame dans un tube de microcentrifugation compatible avec le système. Assurez-vous que chaque cycle de seqIF ne contient qu’un seul anticorps primaire par espèce hôte.
    7. Préparer les fluorophores secondaires (tableau 3) et le DAPI selon les combinaisons d’anticorps primaires à l’étape 6.3.7 pour seqIF selon les dilutions testées par titrage. Diluer dans un tampon multicolorant à raison d’un total de 400 μL par cycle dans un tube conique de 50 mL avec un volume mort d’au moins 1 mL. Les concentrations par exemple pour les anticorps secondaires Alexa Fluor et le DAPI sont les suivantes : dilution 1:200 pour Alexa Fluor 555, dilution 1:400 pour Alexa Fluor 647, dilution 1:1800 pour DAPI (à partir de 1 mg/mL de DAPI dans le DMF)
      REMARQUE : Cette étape est sensible à la lumière. L’ajout de DAPI aux secondaires n’est pas conforme au protocole du fabricant, car il peut aider à maintenir l’expression de DAPI tout au long de plusieurs cycles de seqIF, ce qui aide à aligner les images après l’exécution. La plupart des logiciels de traitement d’image, tels que ceux inclus dans ce système, utilisent le signal DAPI pour confirmer l’alignement de l’imagerie cyclique pour la colocalisation fluorescente.
  4. Initialisation du système
    1. Chargez chacun des réactifs de l’étape 6.3 dans l’ordre spécifié par le système. Notez que l’ordre sera généralement le suivant : ci-dessus, mais assurez-vous toujours que les réactifs correspondent à l’endroit où ils sont chargés
    2. Chargez la lame récupérée de l’antigène dans le support et assurez-vous que la fenêtre d’imagerie de la lame est alignée au centre de l’espace d’imagerie avant de placer la puce microfluidique compatible avec le système sur le dessus et de la verrouiller en place.
      REMARQUE : Les puces microfluidiques peuvent être réutilisées pour les tests de titrage seqIF si elles sont nettoyées et stockées de manière appropriée jusqu’à une fois supplémentaire, tant que les joints restent intacts. Les puces microfluidiques ne peuvent pas être réutilisées si un panel d’ARN est utilisé en raison d’une contamination potentielle.
    3. Préparez la solution de clivage en mélangeant 1,35 mL de 4x SSC et 150 mL de solution de clivage commerciale 10x.
      REMARQUE : La solution de clivage 10x s’oxyde rapidement et est stockée dans une ampoule en verre qui ne doit être brisée qu’immédiatement avant d’être utilisée dans une expérience seqRNA-ISH+seqIF.

7. Fonctionnement du système

  1. Selon les instructions du fabricant, la durée approximative d’exécution de deux lames à un seqRNA-ISH de 12 plex avec un seqIF de protéine de 20 plex est de 48 h pour une fenêtre d’imagerie de 12,5 cm x 12,5 cm.
  2. Une fois l’exécution seqRNA-ISH+seqIF terminée, la lame peut être retirée et stockée dans 1x PBS ou immédiatement utilisée pour un seqIF supplémentaire (pour un maximum de 40 protéines).
    REMARQUE : Il est important de nettoyer et de rincer la microfluidique du système avec de l’eau sans nucléases avant et après chaque passage pour réduire le risque de contamination.

8. FACULTATIF : Analyse d’images et statistiques

  1. Procéder à l’analyse d’images et statistiques via des outils d’analyse d’images ou d’analyse pathologique.

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Résultats

À titre d’exemple de cette méthode, nous avons analysé le seqRNA-ISH (Tableau 1) + SeqIF (Tableau 2 et Tableau 3) sur deux lames provenant d’un carcinome séreux de l’ovaire humain de haut grade.

La figure 2 illustre la superposition de seqRNA-ISH+seqIF sur un échantillon de tissu tumoral ovarien. Les marqueurs protéiques structurels tels que le collagène 1 sont utilisés pour identifier les régions tumorales, tandi...

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Discussion

L’étape la plus critique de la préparation et de la manipulation des échantillons est la réduction de la contamination par l’ARNase. Cela peut être réalisé en utilisant des masques pour prévenir la contamination par l’haleine et en essuyant les surfaces de travail avec une solution de décontamination RNase et de l’éthanol à 70 % fabriqué avec de l’eau sans nucléases. Pour les lames FFPE, il est préférable de couper plusieurs lames adjacentes dans des blocs FFPE pour seqRNA-ISH+seqIF et d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée en partie par l’Alliance de recherche sur le cancer de l’ovaire (OCRA 811621 et 891490), la Fondation Sie et le Fonds de dotation Stephanie C. Stelter. Cette recherche a été réalisée en collaboration avec la plateforme de cytométrie en flux et d’imagerie cellulaire, qui est soutenue en partie par les National Institutes of Health par le biais de la subvention P30 CA016672 du Centre de cancérologie de M. D. Anderson et du spécialiste de recherche 1 R50 R50 CA243707-01A1 du NCI de Jared Burks.

Nous tenons également à remercier Emily Martersteck de Lunaphore, pour son assistance technique et sa formation.

L’auteur (s) a (sont) reçu(s) un ensemble de sondes ciblées et de contrôle RNAScope dans le cadre d’un programme d’accès précoce de Bio-Techne à un prix réduit, et certains réactifs ont été fournis gratuitement pour être utilisés dans cette étude. Le fabricant n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, ni dans la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Pour la coloration nucléaire (produit utilisé au cours de cette étude, le 62247 a été abandonné)
Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 mlThermo Fisher Scientific339652Utilisé pour les aliquotes & Solutions secondaires mixtes
Alcool isopropanol stérile à 70 %TexwipeTX3270Pour la décontamination des surfaces
AnticorpsDiversDiversUtilisé pour les cibles primaires, varie en fonction du canal utilisé
APOE - Hôte : Souris, Clone : 960318R& DMAB41443-100(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
aSMA - Hôte : Souris, Clone : 1A4CSTRéférence 69319SF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
Microtome autodécoupéLeica14051956472Section de tissu
CD10 - Hôte : Lapin, Clone : E5P7SCST65534S(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD11c - Hôte : Lapin, Clone : D3V1ECSTRéférence 93233SF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD163 - Hôte : Lapin, Clone : D6U1JCSTN° 93498S(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD163 - Hôte : Lapin, Clone : ja51-30InvitrogenMA5-32684(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD20 - Hôte : Souris, Clone : L26Le béthyleA500-017ACF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD31 - Hôte : Souris, Clone : 3F8E2Technologie des protéinesRéférence 66065-2-IG(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD33 - Hôte : Lapin, Clone : BLR061GLe béthyleA700-061CF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD4 - Hôte : Lapin, Clone : EPR6855AbcamAB181724(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD45 - Hôte : Lapin, Clone : BL-178-12C7Le béthyleRéférence A700-012(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD45RO - Hôte : Souris, Clone : UCHL1Le béthyleA500-020ACF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD56 - Hôte : Lapin, Clone : BLR152JLe béthyle99746(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD66b - Hôte : Lapin, Clone : BLR111HInvitrogenRéférence : MA5-44413(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD68 - Hôte : Souris, Clone : KP-1Biolégende916104(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD8 - Hôte : Souris, Clone : C8/144BBiolégende372902(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
CD86 - Hôte : Lapin, Clone : E2G8PCSTRéférence 76755SF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
Col 1A1 - Hôte : Souris, Clone : E3E1XCSTRéférence 66948S(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
Tubes DNA LoBind 2mLEppendorf22431048Utilisé pour les solutions de sondes d’ARN mixtes
Sessiccation de la drérite 21005 indicatriceCole-Palmer21005Dessiccateur pour dessiccateur
Lames de microtome Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistologie - Utilisé lors de la coupe d’échantillons
Alcool éthylique 100 % (200 proof)Pharmco111000200Pour la déparaffinisation
EZ-AR2 Tampon EleganceBioGeneXHK547-XAKUtilisé pour le prélèvement d’antigènes de coupes de tissus FFPE
FOXP3 - Hôte : Lapin, Clone : PolyclonalLe béthyleA700-034CF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
Chèvre anti-Souris IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21425(remarque : spécifique à cette étude) F(ab')2-Goat anti-Souris IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor&trade ; 555
Chèvre anti-souris IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-48289/A-21237(remarque : spécifique à cette étude) F(ab')2-Goat anti-Souris IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor&trade ; Plus 647
Chèvre anti-Lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21430(remarque : spécifique à cette étude) F(ab')2-Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor&trade ; 555
Chèvre anti-Lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21246(remarque : spécifique à cette étude) F(ab')2-Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor&trade ; 647
GZMB - Hôte : Lapin, Clone : PolyclonalTechnologie des protéines13588-1-AP(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
HS-POLR2A-T1ACD Biotechne310457-T1Sonde à faible expression humaine
Hs-PPIB-T5ACD BiotechneRéférence 313907-T5Contrôle de la sonde d’expression moyenne humaine
Hs-UBC-T9ACD Biotechne310047-T9Effet humain exprimant le contrôle
Solution de peroxyde d’hydrogène 30 %Sigma-AldrichRéf. HX0640-5Pour la préparation des tissus. Aide à bloquer l’activité endogène de la peroxydase et à produire des produits très colorés. Pour faire une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 %
Ker8/18 - Hôte : souris, clone : polyclonalTechnologie des protéines66187-1-PBS(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
LRP5 - Hôte : Lapin, Clone : HPA030505SigmaHPA030505-100UL(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
Lunaphore 20x Tampon MulticolorationBio-TechneBU06Utilisé comme diluant et pour les lavages pour le COMET
Puce COMET LunaphoreBio-TechneMK03Puce mcirofluidics pour l’instrument COMET
Lunaphore COMETBio-TechneCM10-SSeq-IF autostainer
Kit tampon d’élution LunaphoreBio-TechneBU07-LSolution 1 & Solution 2 pour les étapes d’élution du COMET
Kit de tampon d’imagerie LunaphoreBio-TechneBU09Soluté & Solvant utilisé pour l’imagerie pendant l’exploitation de COMET
Tampons d’extinction LunaphoreBio-TechneBU08-LSolution 1 & Solution 2 pour les étapes d’extinction du COMET
MicropipetteDiversN/Apour la préparation de réactifs
Periostin - Hôte : Souris, Clone : 1A11A3Technologie des protéines66491-1-PBS(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
Pierce 16 % Formaldéhyde (p/v), sans méthanolThermo Fisher Scientific28908Pour produire 3,7 % de PFA pour la préparation des tissus
Entrée 320102 sonde (canal T2)ACD Biotechne300040Contrôle négatif DapB en T2
Entrée 320102 sonde (canal T3)ACD Biotechne300040Contrôle négatif DapB en T3
Entrée 320102 sonde (canal T4)ACD Biotechne300040Contrôle négatif DapB en T4
RNAscope HiPlex Solution mère de clivageBio-TechneRéf. 324399Réactif pour le clivage pendant le test RNAScope
RNAscope HiPlex Pro pour COMET 12-plex, kit de 20 lamesBio-Techne322075Réactifs & Tampons pour RNAScope
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-APOE-T2ACD BiotechneRéf. 433093-T2(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-APOE-T2
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-ARG1-T4ACD BiotechneRéf. 401581-T4(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-ARG1-T4
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-CD274-T1ACD BiotechneRéférence 600863-T1(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-CD274-T1
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-CD40-T6ACD BiotechneRéf. 445973-T6(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - HS-CD40-T6
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-CXCL1-01-T12ACD Biotechne1256473-T12(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - HS-CXCL1-01-T12
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-GZMB-T7ACD BiotechneRéférence 468453-T7(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-GZMB-T7
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-IFNG-T3ACD Biotechne310503-T3(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - HS-IFNG-T3
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-IL23A-T8ACD BiotechneRéférence 562853-T8(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-IL23A-T8
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-IL6-T9ACD Biotechne400883-T9(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-IL6-T9
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-TNFa-T11ACD Biotechne310423-T11(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-TNFa-T11
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-VEGFa-T5ACD BiotechneRéf. 423163-T5(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-VEGFa-T5
Sonde RNAscope HiPlex - Hs-VISTA-T10ACD Biotechne491513-T10(remarque : spécifique à cette étude) Accès anticipé RNAscope et commerce ; Sonde HiPlex CS - Hs-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS Sonde de contrôle négatifACD Biotechne324347Panneau de contrôle négatif 12 plex recommandé par le fabricant. DapB en T1-T12.
RNAscope HiPlex12 CS Sonde de contrôle positif-HsACD Biotechne324317Panneau de contrôle positif humain 12 plex complet recommandé par le fabricant. Hs -RTU pour le gène d’entretien suivant dans les canaux T1 à T12 : Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
Eau sans RNAseCorning46-000-CMNettoyer et préparer tout l’équipement, et l’utiliser comme diluant si nécessaire
Solution de décontamination RNaseZap RNaseThermo Fisher ScientificAM9782Une solution de décontamination de surface qui détruit les RNases
RNeasy FFPE KitQiagen73504 et 19093Pour l’extraction d’ARN et Mesure DV200
Enveloppe de diapositivesSimport ScientificM9504MApour le stockage des lames dans un tampon liquide.
Conception chirurgicale Lame de rasoir industriel à usage généralThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histologie - Utilisé lors de la coupe d’échantillons
TOX 1/2 - Hôte : Lapin, Clone : E613QCSTRéférence 62886SF(remarque : spécifique à cette étude) Protéine primaire Anticorps
Xylène de grade histologiqueThermo Fisher ScientificNo ONU 1307Pour la déparaffinisation

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