Article de méthode

Cartographie moléculaire à double modalité : intégration de la détection multiplex de l’ARNm avec la cytométrie de masse par imagerie protéique

DOI :

10.3791/68616

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14 novembre 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole détaille une méthodologie de détection multiplex de l’ARNm avec imagerie protéique par cytométrie de masse dans des coupes de tissus fixés au formol inclus dans la paraffine.

Résumé

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La capacité de détecter les protéines et les ARNm dans le même test nous aide à comprendre comment la cellule se prépare à une arrivée et quels signaux elle reçoit lorsqu’elle se déplace et interagit dans l’environnement dans lequel elle se trouve. L’imagerie à haut plexage permet désormais de caractériser simultanément l’ARNm (transcriptomique spatiale) et les protéines (protéomique spatiale) résolus spatialement. Pour éviter la redondance, ces analytes peuvent être analysés en une seule coupe de tissu. Il existe de nombreuses technologies qui permettent de produire de nombreuses protéines et peu d’ARNm ou l’inverse, mais comme les analytes à action centrale sont des protéines, ce manuscrit se concentre sur l’intégration de la cytométrie de masse (IMC) d’imagerie protéique avec l’hybridation in situ de l’ARNm (ISH) à l’aide de sondes métalliques. Cela nous permet de comprendre quels messages la cellule amorce ou envoie rapidement dans le monde lorsqu’elle communique dans son microenvironnement. Il permet également de surmonter les limites liées à la détection de protéines sécrétées ou de marqueurs difficiles qui sont généralement difficiles à quantifier et à visualiser en utilisant uniquement des anticorps. Ce protocole minimise également le besoin de compensations ou de post-traitement observé dans les méthodes basées sur la fluorescence à plex supérieur, car il n’y a pas de débordement spectral fluorescent dans un système de détection basé sur une sonde métallique, ni de considérations d’autofluorescence spécifiques aux tissus.

Introduction

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Les cancers présentent des diversités structurelles et fonctionnelles chez divers patients. Le microenvironnement tumoral (TME), composé de cellules normales et malignes, est hétérogène entre les patients. Les métastases résultent de la fuite d’un résidu de la tumeur primaire dans la circulation sanguine sous forme de grappes de cellules et de cellules uniques, ce qui fournit des indices sur la progression de la maladie et la réponse thérapeutique 1,2. La complexité de ces microenvironnements doit être comprise1. Bien que les tumeurs comprennent de nomb....

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Protocole

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Ce protocole utilise des tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) prélevés chez des patientes non traitées auparavant subissant une chirurgie cytoréductrice primaire pour un carcinome séreux de l’ovaire de haut grade. Toutes les données cliniques ont été obtenues à partir du dépôt du Département d’oncologie gynécologique et de médecine de la reproduction selon des protocoles approuvés par le conseil d’examen institutionnel de l’Université du Texas MD Anderson. Le consentement éclairé écrit des patients a été obtenu, et les études ont été menées conformément aux directives éthiques reconnues.

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Résultats

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La capacité de détecter les protéines et les ARNm dans le même test nous aide à comprendre comment la cellule se prépare à une arrivée, mais aussi quelles files d’attente elle reçoit lorsqu’elle se déplace et interagit avec son environnement. Comme le montrent les données représentatives, la détection de l’ARNm et des protéines est un élément essentiel de la recherche en biologie spatiale, car les limites inférieures de détection peuvent être assez difficiles en fonction de la façon dont.......

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Discussion

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La multi-omique multiplex est une évolution critique dans les données collectées, ciblant les interactions de cellule à cellule et de cellule à voisinage qui ont un impact sur la progression de la maladie et le traitement. L’analyse de ces données dans le même échantillon et donc dans la même cellule est essentielle, car de nombreuses cibles protéiques sont exprimées transitoirement, ou diffèrent en ARNm et en niveau d’expression protéique, ce qui permet une détection ciblée de l’ARNm co.......

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Déclarations de divulgation

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Jared K. Burks est consultant pour Standard BioTools.

Remerciements

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Cette recherche a été réalisée en collaboration avec la plateforme de cytométrie en flux et d’imagerie cellulaire, qui est soutenue en partie par les National Institutes of Health par le biais de la subvention P30 CA016672 du Centre de cancérologie de M. D. Anderson. Cette recherche a également été financée en partie par le MD Anderson’s Cancer Center’s Support Grant Development Award, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. Les efforts du JKB ont été soutenus en partie par le P30 CA016672 et le spécialiste de la recherche du NCI 1 R50 CA243707-01A1. Les efforts de SFB ....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ; https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Conjugaison oligonucléotide-polymère pour imagerie de la cytométrie de masse V.2  ;
10 TBS sans ARNSEThermo Fisher Scientific & nbsp ;J62780. K7Pour les lavages intermittents entre les étapes
Système d’hybridation ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Four pour lames de mouchoir de cuisson
Diluant d’anticorpsDakoS0809  ;Tampon diluant anticorps
Anticorps : B7-H3BethylA700-025CF, A700-026CFClone : BLR025F, BLR026F
Anticorps : B7-H4Thermo Fisher Scientific & nbsp ;14-5949-82Clone : H74
Anticorps : BRD4(6F11)BethylA700-005CFClone : BL-151-6F11
Anticorps : CCR6R& DMAB195-100Clone : 53103
Anticorps : CD11bAbcam  ;ab209970Clone : EPR1344
Anticorps : CD25Abcam  ;ab215378Clone : EPR6452
Anticorps : CD278/ICOSCST  ;89601BFClone : D1K2T
Anticorps : CD31Abcam  ;ab207090Clone : EPR3094
Anticorps : CD33Abcam  ;ab238784Clone : SP266
Anticorps : CD3e & nbsp ;CST85061BFClone : D7A6E
Anticorps : CD4Abcamdéc. 181724Clone : EPR6855
Anticorps : CD44Thermo Fisher Scientific & nbsp ;MA1-10225Clone : IM7
Anticorps : CD45Thermo Fisher Scientific & nbsp ;14-9457-82Clone : CD45-2B11
Anticorps : CD8aCST  ;85336BFClone : D8A8Y
Anticorps : CXCL13R& DAF801Clone : Polyclonal
Anticorps : CXCR5R& DMAB190-100Clone : CXCR5
Anticorps : gamma-H2AXBethylA700-053CFClone : BLR053F
Anticorps : Granzyme BSanta CruzSC-8022 XClone : 2C5
Anticorps : KAP1BethylA700-014CFClone : BL-248-2G6
Anticorps : Ki67BethylA700-021CFClone : BLR021E
Anticorps : LCK & nbsp ;CST2984BFClone : D88
Anticorps : MFAP5N/AN/APMID : 31332047 / Clone : 130A  ; (Note : conçu sur mesure)  ;
Anticorps : AMSCST56856BFClone : 1A4
Anticorps : VEGFSTB-Fluidigm3163028DClone : G153-494
Anticorps : VISTACST64953BFClone : D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra  ;BioGeneXHK546-XAKTampon de récupération d’antigènes
Alcool éthylique 100 % (200 degrés)Pharmco111000200Pour la déparaffinisation
EZ & ndash ; Retriever IRBioGeneXMW016-IRSystème de prélèvement antigénique pour les sections tissulaires FFPE
Système d’hybridation HybEZ IIACD Biotechne321710Le système comprend : four HybEZ (PN 321710/321720), un plateau de contrôle d’humidité (PN 310012), et du papier humidificateur HybEZ (2 feuilles PN 310025), un bac de lavage EZ Batch (PN 321717), un porte-culasse EZ Batch (PN 321716)
Stylo PAP barrière hydrophobe ImmEdge & nbsp ;VectorLabsH-4000Enclos barrières hydrophobes
Solution intercalateur IRThermo Fisher Scientific & nbsp ;NC1038184Utilisé pour identifier les cellules nucléées
KERATIN 18/08CST  ;4546BFClone : C51
Metal OligosDiversDiversUne vigne métallique allant de T1 à T12 selon ce qui est nécessaire
Eau sans nucléase (NFW)Corning  ;46-000-CM  ;Nettoyer et préparer tout le matériel, et utiliser comme diluant lorsque nécessaire
RNAscope Protéase Plus & nbsp ;ACD Biotechne322331  ;Utilisé pour perméabiliser les membranes cellulaires des échantillons
Porte-lames RNAscope EZ-BatchACD Biotechne310017Conçu pour traiter manuellement en lot jusqu’à 20 lames efficacement
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2  ;ACD Biotechne324409Réactifs pour RNAScope
Sonde RNAscope HiPlex - Sondes ciblesACD BiotechneDiversPlage de T1 à T12 selon laquelle est nécessaire
Solution de décontamination RNaseZap RNaseThermo Fisher ScientificAM9782Une solution de décontamination de surface qui détruit les RNases
Porte-lames pour microscope à rack de teinture Plastique résistant aux produits chimiques 24 placesOptimal Scientific3028Pour la teinture de plusieurs lames
Préadolescent 20Thermo Fisher Scientific & nbsp ;AAJ20605APPour les lavages intermittents entre les étapes
Bloc protéique ultravisionThermo Fisher Scientific & nbsp ;TA125PBQTampon de blocage

Références

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  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1....

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Mots-clés

Transcriptomique spatialeHybridation in situD tection de sondes m talliquesBiomarqueurs du cancer de l ovaireLymphocytes T CD8Fibroblastes associ s au cancerProt omique spatiale

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