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Article de méthode

Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification

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DOI :

10.3791/68617

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7 octobre 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit un test d’hybridation par immunofluorescence en tandem avec du tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine pour détecter et quantifier simultanément les microARN et les protéines multiplexées.

Résumé

Lors de l’utilisation des méthodes traditionnelles de détection par imagerie par hybridation in situ (ISH) basées sur des sondes, les microARN (miARN) sont difficiles à capturer en raison de leur taille, qui varie de 19 à 25 nucléotides. Cependant, comme les miARN sont des régulateurs épigénétiques clés qui contribuent à la physiologie normale et à de nombreuses conditions pathologiques, il est important de comprendre le comportement spatio-temporel des miARN pour démêler leur fonction aux niveaux cellulaire et subcellulaire. Cela crée un besoin évident de techniques de détection et de visualisation adéquates. Par conséquent, nous avons créé l’amplification et la reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés (MARLIN), qui a été développée et optimisée à l’aide d’une coloration par immunofluorescence multiplex et de sondes d’acide nucléique verrouillé (LNA) ciblées sur un miARN. Cette méthode permet de quantifier les miARN avec une expression protéique multiplexée, ce qui permet de quantifier les miARN intracellulaires et extracellulaires dans le microenvironnement tumoral (TME) avec une sensibilité et une reproductibilité élevées. L’utilisation combinée de la détection des miARN et des tests de capture de protéines peut également fournir une compréhension complète des fonctions cellulaires et des mécanismes de régulation au sein de ce TME.

Introduction

microARN
Bien que les microARN (miARN) soient incroyablement petits, allant de 19 à 25 nucléotides de longueur, ces molécules d’ARN simple brin sont de puissants régulateurs de l’expression génique, modulant les ARN messagers (ARNm) de manière post-transcriptionnelle par le biais d’interactions spécifiques à la séquence1. Essentiellement, les miARN agissent comme des régulateurs négatifs en se liant aux ARNm cibles, empêchant leur traduction ou favorisant leur dégradation par clivage de l’ARNm, en fonction du degré de complémentarité, ce qui conduit finalement à une diminution de la production de protéines du gène ciblé. Bien que les miARN soient essentiellement des ARN non codants, environ 40 % de tous les miARN se trouvent encore dans les introns ou les exons des gènes codant pour des protéines2. L’objectif fonctionnel des miARN englobe plusieurs processus biologiques clés tels que la prolifération cellulaire, l’angiogenèse, l’apoptose, etc. Notamment, la dérégulation des miARN a été impliquée dans la tumorigenèse, car l’expression aberrante de miARN spécifiques et la régulation génique médiée par les miARN ont été associées à la transformation oncogénique dans plusieurs types de cancer3.

Depuis leur découverte, les miARN ont fait l’objet de recherches approfondies dans diverses maladies en raison de leur expression spécifique aux tissus et de leurs fonctions régulatrices, leur dérégulation étant liée à de nombreuses maladies, notamment les troubles neurodégénératifs, les troubles auto-immuns et divers cancers 4,5,6. Les modèles d’expression des miARN peuvent être corrélés avec le type de cancer, le stade et les variables cliniques, ce qui fait du profilage des miARN un outil précieux pour le diagnostic et le pronostic du cancer 4,5,6,7. La découverte de nouveaux miARN a également été accélérée par les progrès des technologies de séquençage à haut débit, améliorant la compréhension de l’implication des miARN dans divers processus biologiques8. L’importance des miARN a été soulignée par le prix Nobel de médecine 2024 décerné à Victor Ambros et Gary Ruvkun pour leur découverte de la fonction des miARN dans la régulation post-transcriptionnelle9.

En tant que biomarqueurs précieux pour le diagnostic et le pronostic de la maladie, le potentiel thérapeutique des miARN a été exploré, ce qui a conduit au développement de médicaments ciblant les miARN. Le potentiel thérapeutique des miARN dans le traitement du cancer réside dans leur capacité à réguler de manière coordonnée des modules de gènes, restaurant potentiellement des fonctions cellulaires normales10. Auparavant, les thérapies anticancéreuses à base de miARN ont été développées soit en monothérapie, soit en combinaison avec des thérapies ciblées existantes pour améliorer les réponses au traitement et augmenter les taux de guérison11. Le spectre dynamique des miARN les a positionnés comme des ressources essentielles pour des stratégies innovantes de traitement du cancer. Dans le contexte de la résistance thérapeutique, le ciblage des miARN s’est avéré prometteur pour réduire la récidive et la résistance aux traitements anticancéreux traditionnels, améliorant potentiellement la survie des patients en ciblant les cellules cancéreuses12. En explorant le rôle des miARN dans la modulation des activités de divers types de cellules dans le microenvironnement tumoral (TME), des traitements anticancéreux uniques et cliniquement pertinents peuvent potentiellement être découverts.

Tests disponibles pour détecter les miARN
Actuellement, la méthode la plus courante pour la mesure des miARN repose sur l’ARN extrait pour la PCR quantitative en temps réel (q-RT-PCR) ou le séquençage de nouvelle génération (NGS), perdant ainsi le contexte spatial. Certaines entreprises fourniront des tests de microARN TaqMan, qui utilisent des amorces de boucle de tige spécifiques à la cible pour la synthèse de l’ADNc, et des chimies à base de colorants SYBR Green avec synthèse universelle de l’ADNc. Ces tests peuvent offrir une sensibilité et une spécificité élevées et peuvent être exécutés sur une gamme d’instruments q-RT-PCR. Malheureusement, les tests TaqMan ne peuvent pas fournir une quantification absolue, ce qui peut entraîner des problèmes tels que des faux positifs et une variabilité des résultats13. De plus, malgré leur grande sensibilité, l’application de ces tests dans différents types d’échantillons peut être limitée par la nécessité d’une préparation approfondie de l’échantillon et l’interférence potentielle d’autres composants de l’échantillon.

Séquençage de nouvelle génération (NGS) : le miRNA-seq est de plus en plus populaire pour l’analyse de l’expression différentielle sur l’ensemble du miRNome des biofluides. L’un des avantages des technologies NGS comme le miRNA-seq est qu’elles permettent des analyses parallèles massives de l’expression des miARN à l’échelle du génome, ce qui permet la quantification des miARN individuels, l’identification des variations de séquence et la découverte de nouveaux miARN14. Un inconvénient important des méthodes basées sur le séquençage, telles que le kit de préparation d’échantillons de petit ARN IlluminaTruSeq, est l’induction de biais quantitatifs, affectant la précision des analyses d’expression différentielle, en grande partie à cause de l’homologie et des longueurs de lecture plus petites des miARN14. De plus, la présence d’isomiRs (variants dont la séquence ou la longueur diffère de la séquence canonique du miARN) et d’artefacts techniques peut compliquer l’interprétation des données, ce qui peut entraîner des erreurs de détection et des facteurs de confusion dans les tests de biomarqueurs14. De plus, différents outils d’analyse des données de miRNA-seq, tels que sRNAbench et miRDeep2, peuvent donner des résultats variables, affectant la cohérence et la fiabilité de la découverte de nouveaux miARN15,16. Même une technologie comme celle des microréseaux peut être insuffisante dans la plupart des cas. Bien qu’elle puisse fournir une plate-forme puissante et à haut débit pour détecter les niveaux d’expression des miARN ou des gènes, ce qui la rend adaptée aux études à l’échelle du génome, la technologie est toujours limitée par le nombre de miARN précédemment identifiés et ne peut pas vérifier directement les interactions miARN-cible, ce qui limite leur utilité dans les études fonctionnelles17.

Le facteur le plus important sur lequel on peut insister ici lorsque l’on compare toutes ces options disponibles est l’absence de contexte spatial. Ils ne fournissent aucun contexte par rapport à la morphologie tissulaire ou à la distribution spatio-temporelle au sein des cellules. La visualisation du comportement spatio-temporel des miARN est nécessaire pour démêler leur fonction aux niveaux cellulaire et subcellulaire. À l’heure actuelle, les tests d’hybridation in situ (ISH) miRNAscope sont accessibles, généralement en utilisant des méthodes de détection chromogènes. Bien que ces tests permettent de visualiser les miARN avec une résolution unicellulaire, les résultats manquent de qualité, ce qui rend difficile la différenciation entre l’expression des miARN et le contexte de l’échantillon. En général, beaucoup d’entre eux produisent des tests de mauvaise qualité, qui ne sont pas fiables et nécessitent généralement une quantification manuelle.

Par conséquent, nous avons développé l’amplification et la reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés (MARLIN) en utilisant une coloration par immunofluorescence multiplex (par coloration de la protéine Opal) et des sondes d’acide nucléique verrouillé (LNA) ciblées sur un miARN, dans des tissus inclus dans de la paraffine fixée au formol (FFPE). Nous y sommes parvenus en mettant en œuvre un système d’amplification du signal tyramide (TSA) qui est activé par un anticorps conjugué anti-digoxigénine (DIG) et à la peroxydase de raifort (HRP). Le HRP agit comme un catalyseur pour la TSA, tandis que l’Anti-DIG se fixe à la sonde LNA. Ce test est particulièrement utile pour comprendre la nature essentielle des miR dans la modification post-transcriptomique avec des protéines, et potentiellement d’autres ARN simultanément. De plus, en raison de l’absence d’un test disponible dans le commerce capable de quantifier à la fois l’expression des miARN et des protéines, MARLIN fournit un moyen efficace de comprendre les relations in situ entre les miR et les protéines dans les échantillons FFPE.

Les premiers résultats de la quantification de miR-181c-3p à l’aide de MARLIN ont démontré la faisabilité d’une analyse parallèle des miARN et des protéines dans le contexte spatial natif du tissu FFPE ovarien humain. Au-delà de cet exemple, sur la base des composants de MARLIN, il est théoriquement possible d’étendre jusqu’à quatre protéines en utilisant des fluorophores multiplexés fluorescents commerciaux comme Alexa Fluor, ou d’autres colorants à petites molécules18.

De plus, étant donné que cette méthodologie utilise des variations par rapport aux méthodes d’histologie standard, elle devrait être compatible avec d’autres tissus FFPE de mammifères, à condition d’une sélection appropriée de sondes et d’anticorps. Cette méthodologie préserve l’architecture spatiale et permet la quantification des miARN cellulaires et subcellulaires et de la colocalisation des protéines. Cette approche comble une lacune critique de la biologie spatiale en cartographiant les modèles de co-expression et la distribution spatiale des miARN-protéines, qui peuvent être directement contextualisés dans les architectures tissulaires natives. Nous présentons ici MARLIN avec un aperçu graphique détaillé dans la figure 1. Bien que le protocole présenté soit optimisé pour miR-181c-3p, d’autres miR sont possibles à étudier, à condition d’une conception de sonde appropriée. Les paramètres critiques de cette méthode comprennent : l’évaluation de la qualité des tissus et l’optimisation des concentrations de sondes. Il est recommandé d’évaluer l’intégrité de l’ARN du bloc tissulaire à l’aide d’une métrique DV200 en utilisant deux sections de 10 μm et en extrayant l’ARN à l’aide d’un protocole qui préserve toutes les tailles de fragments d’ARN. Les échantillons dont le score DV200 est supérieur à 50 ou supérieur, et dont les concentrations sont conformes au protocole, doivent être systématiquement testés.

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Protocole

Ce protocole utilise des tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) de coupes de tissus tumoraux ovariens humains de patientes atteintes de HGSC. Ces échantillons ont été prélevés chez des patientes non traitées auparavant subissant une chirurgie cytoréductrice primaire pour un cancer de l’ovaire. Tous les échantillons et les données cliniques ont été obtenus à partir du dépôt du cancer de l’ovaire du Département d’oncologie gynécologique et de médecine de la reproduction, conformément aux protocoles approuvés par le conseil d’examen institutionnel de l’Université du Texas, MD Anderson. Le consentement éclairé écrit des patients a été obtenu par le personnel de la réception, et les études ont été menées conformément aux directives éthiques reconnues.

1. Préparation des tissus

  1. Faites cuire tous les échantillons FFPE pendant la nuit à 60 °C et nettoyez chaque équipement et outil avec de l’eau sans RNAse. Assurez-vous que les sections ont une épaisseur d’environ 5 μm.
    REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour les tumeurs ovariennes mais peut potentiellement être utilisé avec d’autres types de tissus après des tests supplémentaires.
  2. Effectuez une déparaffinisation avec trois cycles de xylène pendant 5 minutes à chaque tour et 10 cycles de réhydratation pendant 3 minutes à chaque cycle (100 % d’éthanol (EtOH) 2x, 95 % d’EtOH 2x, 70 % d’EtOH 2x, 50 % d’EtOH 2x, 30 % d’EtOH 2x). Laver avec 1 solution saline tris-tamponnée (TBS) pendant 2 min, une fois.
    REMARQUE : Cette étape de déparaffinage, bien que recommandée, est facultative et dépend du type de tissu.
  3. Après la déparaffinisation et la réhydratation, appliquer une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % (H2O2) pendant 10 min. Laver pendant 2 min avec 1x TBS, 2x. Ensuite, appliquez une solution de paraformaldéhyde à 3,7 % (PFA) pendant 10 min. Laver pendant 2 min avec 1x TBS, 2x.
    REMARQUE : Cette étape est facultative et ne doit être envisagée que pour les tissus adipeux ou les échantillons sujets au détachement.
  4. Passez à la première série de prélèvements d’antigènes. Ce protocole utilise le système IR EZ-Retriever. En suivant les instructions du système, passez les échantillons au micro-ondes pendant qu’ils sont immergés dans un tampon EZ-AR1 frais à 95 °C pendant 15 min. Laisser refroidir 20 min.
  5. Laver pendant 2 min avec 1x TBS. Puis pendant 2 min avec 1x TBS-T (1x TBS avec 0,1 % Tween), 2x.

2. Application de protéines

  1. Dessinez une barrière autour de chaque section de tissu avec un stylo barrière hydrophobe.
  2. Ajouter 1x solution de blocage des anticorps (suffisamment pour couvrir toute la surface des tissus) et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une chambre d’humidité (humidité ambiante et non contrôlée).
  3. Par la suite, diluez le premier anticorps primaire avec la même solution bloquante, appliquez-en suffisamment pour couvrir toute la zone tissulaire et laissez incuber pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humide.
    REMARQUE : Au cours de l’élaboration de ce protocole, l’Anti-CD8 a été utilisé à une dilution de 1:75.
  4. Laver pendant 2 min en 1x TBS-T, 3x. Ensuite, ajoutez l’Anti-Ms + Rb HRP et laissez les échantillons incuber pendant 10 min à température ambiante dans une chambre d’humidité (humidité ambiante et non contrôlée).
  5. Laver pendant 2 min en 1x TBS-T, 3x. Diluer le premier fluorophore avec le diluant d’amplification au 1:100 et incuber pendant 10 min à température ambiante dans la chambre d’humidité.
    REMARQUE : Lors de l’élaboration de ce protocole, un fluorophore d’émission de 690 nm a été utilisé. À partir de ce moment, il est recommandé d’utiliser un éclairage minimal pour le reste de la procédure après l’application du premier cycle de fluorophore.
  6. Laver pendant 2 min en 1x TBS-T, 3x. Commencer la deuxième série de coloration des anticorps par la deuxième série de récupération de l’antigène au micro-ondes, en immergeant à nouveau les échantillons dans un tampon EZ-AR1 frais à 95 °C pendant 15 minutes, puis en les refroidissant pendant 20 minutes.
  7. Laver pendant 2 min avec 1x TBS. Laver ensuite pendant 2 min avec 1x TBS-T, 2x.
  8. Appliquez à nouveau la solution de blocage des anticorps 1x pendant 30 min dans une chambre d’humidité à température ambiante (humidité ambiante et non contrôlée).
  9. Diluez le deuxième anticorps primaire avec la même solution bloquante, appliquez suffisamment pour couvrir toute la surface tissulaire et laissez incuber toute la nuit à 4 °C dans une chambre d’humidité pendant au moins 16 h.
    REMARQUE : Lors de l’élaboration de ce protocole, Anti-EpCAM a été utilisé à une dilution de 1:200.
  10. Commencer le lendemain par un lavage de 2 min en 1x TBS-T, 3x. Ajoutez ensuite l’Anti-Ms + Rb HRP et laissez incuber les échantillons pendant 10 min à température ambiante dans une chambre d’humidité (humidité ambiante et non contrôlée).
  11. Laver pendant 2 min en 1x TBS-T, 3x. Diluez le deuxième fluorophore avec le diluant d’amplification au 1:100 et incubez pendant 10 min à température ambiante dans la chambre d’humidité.
    REMARQUE : Lors de l’élaboration de ce protocole, un fluorophore d’émission de 620 nm a été utilisé.

3. Application de la sonde

  1. Laver pendant 2 min en 1x TBS-T, 3x.
  2. Commencer le troisième et dernier prélèvement d’antigène avec EZ-AR1 Elegance au micro-ondes à 107 °C pendant 15 min. Laisser refroidir 20 min. Laver pendant 3 min en 1x TBS.
  3. Appliquez RNAscope Protease Plus (suffisamment pour couvrir toute la zone tissulaire) et maintenez à 40 °C pendant 30 min. Utilisez un four. Laver pendant 5 min en 1x TBS, 2x.
  4. Effectuer la préparation de la sonde par dénaturation à 90 °C pendant 4 min de la sonde miARN LNA. Diluez ensuite immédiatement la sonde à l’aide d’un tampon miRNA-ISH. Solution vortex et rotation de la sonde.
    REMARQUE : Au cours du développement de ce protocole, la sonde cible miR-181c-3p a été utilisée à une dilution de 1:250.
  5. Appliquez la sonde (suffisamment pour couvrir toute la surface des tissus) et remettez au four pendant 1 h à 60 °C. Laver pendant 5 min dans 5 tampons salins de citrate de sodium (SSC).
  6. Effectuez cinq lavages rigoureux dans un SSC préchauffé à 60 °C dans l’ordre suivant et des dilutions pendant 5 min à chaque tour : un cycle de 5x SSC, deux cycles de 1x SSC et deux cycles de 0,2x SSC.
  7. Laver pendant 5 min dans 0,2x SSC à température ambiante. Incuber avec un tampon de blocage pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Utilisez une combinaison de 1x TBS et de 0,5 % de poudre de réactif de blocage, assurez-vous de vortex et de faire tourner la solution de blocage avant l’application.
  8. Appliquer un conjugué HRP anti-digoxigénine (souris) (pour ces échantillons, une dilution de 1:500 a été utilisée) et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée.
  9. Laver pendant 5 min dans 1x TBS-T, 3x Appliquer une dilution recommandée de 1:50 du fluorophore Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) pendant 10 min dans une chambre d’humidité à température ambiante (humidité ambiante et non contrôlée). Assurez-vous de vortex et de faire tourner la solution TSA+Cy3 avant l’application.
  10. Laver pendant 5 min en 1x TBS-T, 3x.

4. Coloration et montage nucléaires

  1. Appliquer la solution de travail 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (suffisamment pour couvrir toute la surface des tissus) pendant 5 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée (humidité ambiante et non contrôlée).
    REMARQUE : Pour ce protocole, une dilution de 1:1000 a été utilisée, le stock DAPI de travail étant dilué dans le TBS.)
  2. Laver pendant 5 min en 1x TBS-T, 3x. Une fois la cuisson terminée, appliquer les lamelles à l’aide d’un support de montage et laisser sécher les lames pendant 10 min. Conservez les lames à 4 °C dans l’obscurité entre 24 et 72 h avant l’imagerie et jusqu’à trois mois après.

5. Imagerie et analyse

  1. Pour l’imagerie, utilisez un microscope à balayage de lames (de préférence) à un grossissement de 40x.
  2. Effectuer une analyse quantitative ultérieure pour énumérer les points à l’aide du DAPI et de la contre-coloration des protéines pour la segmentation cellulaire et le phénotypage.
    REMARQUE : Au cours de ce protocole, nous avons utilisé l’imagerie avec un Phenoimager HT. Des balayages complets de lames ont été capturés à un grossissement de 40x en utilisant des filtres appropriés pour les fluorophores présents, et les images multiplexées ont ensuite été exportées sous forme de fichiers OME-TIFF. Les images numérisées ont ensuite été téléchargées dans le logiciel d’analyse d’images Visiopharm pour une analyse quantitative.

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Résultats

Lors de la mise à l’essai de ce protocole, il est important d’avoir deux sections en série du même échantillon représentatif pour plus de précision et de comparaison. Dans ce cas, un échantillon de cancer de l’ovaire de haut grade (HGSC) a été utilisé pour comparer les résultats. Une lame de contrôle (figure 2A-B) qui ne subirait que la coloration des miARN et une lame de test qui subirait à la fois une color...

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Discussion

Bien que l’importance des miARN soit reconnue et comprise, les observations du développement normal et des états pathologiques sont actuellement entravées par la difficulté d’étudier les miARN à l’aide de méthodes standard. La rareté des méthodes in situ a conduit au développement de MARLIN (miRNA FISH assay). Compte tenu de l’homologie et de la courte longueur des miARN, il devient difficile de visualiser leur emplacement et leur effet sur la régulation post-transcriptomique. L...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier les personnes suivantes, Chi Lam Au Yeung et Manjunath Nimmakayalu, qui faisaient partie du comité de thèse de Basant pendant le développement du test. Aussi, Samuel Mok, qui a sectionné et fourni les échantillons utilisés. Enfin, nous remercions Johan Doré et Dan Winkowski qui nous ont largement aidés lors de l’analyse et de l’utilisation du logiciel Visiopharm. Cette recherche a été financée en partie par l’Alliance de recherche sur le cancer de l’ovaire (OCRA 811621 et 891490), la Fondation Sie et le Fonds de dotation Stephanie C. Stelter. Cette recherche a été réalisée en collaboration avec la plateforme de cytométrie en flux et d’imagerie cellulaire, qui est soutenue en partie par les National Institutes of Health par le biais de la subvention P30 CA016672 du Centre de cancérologie de M. D. Anderson et du spécialiste de recherche 1 R50 R50 CA243707-01A1 du NCI de Jared Burks.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x solution saline tamponnée TRIS (TBS) pH 7,6  ;Thermo Fisher Scientific  ; J62662  ; K7Pour les lavages intermittents entre les étapes
1x diluant/blocage d’anticorps opale & nbsp ;Akoya BiosciencesARD1001EASolution bloquant les protéines
Diluant d’amplification d’automatisation 1x PlusAkoya Biosciences & nbsp ;FP1609Utilisé pour diluer les fluorophores d’opale
20x Concentré  ; Tampon de citrate de sodium salé (SSC)Sigma-AldrichS6639-1LPour les lavages de miARN après hybridation par sonde
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)  ;Thermo Fisher Scientific/InvitrogenEN62248 / 62248Pour la coloration nucléaire
Système d’hybridation ACD HybEZ IIACD Biotechne321711Four utilisé pour réguler la température pendant le protocole miRNAscope
Anti-CD8 (D8A8Y), Rabbit mAbTechnologies de signalisation cellulaire85336SExemple d’anticorps primaire utilisé pour optimiser ce protocole
Anti-digoxigénine (souris) conjugué HRPRevvity Health Sciences IncNEF832001EARéactif secondaire utilisé pour la détection des miARN
Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAbTechnologies de signalisation cellulaire93790Exemple d’anticorps primaire utilisé pour optimiser ce protocole
Poudre de réactif de blocageAkoya Biosciences & nbsp ;FP1012Solution bloquante des miARN
Alcool éthylique 100 % (200 degrés)Pharmco111000200Pour la déparaffinisation
Tampon EZ-AR1BioGeneXHK521-XAKUtilisé pour la récupération d’antigènes de sections de tissu FFPE à l’étape protéique
Tampon d’élégance EZ-AR1BioGeneXHK546-XAKUtilisé pour la récupération antigénique de sections de tissu FFPE à l’étape de la sonde du miARN
Système IR EZ-RetrieverBioGeneXMW015-IRMicro-ondes utilisé pour la récupération antigénique de sections de tissu FFPE
Solution de peroxyde d’hydrogène 30 % & nbsp ;Sigma-Aldrich & nbsp ;HX0640-5  ;Pour la préparation des tissus. Aide à bloquer l’activité endogène de la peroxydase et à produire des produits très colorés
sonde miARN miR-181c-3pQiagen339112Exemple de sonde miARN utilisée pour optimiser ce protocole
Ensemble tampon miRCURY LNA miARN ISH (FFPE)Qiagen339450  ;Utilisé pour diluer la sonde de miARN
Opal 620Akoya Biosciences & nbsp ;FP1495001KTFluorophore pour identifier l’anticorps primaire
Opal 690  ;Akoya Biosciences & nbsp ;FP1497001KTFluorophore pour identifier l’anticorps primaire
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EAAnticorps secondaire utilisé comme agent de détection
Pierce 16 % de formaldéhyde (v/v), sans méthanolThermo Fisher Scientific28908Produire 3,7 % de PFA pour la préparation tissulaire
Antifondu en diamant ProLongThermo Fisher ScientificP36970Supports de montage
ARNscope Protéase PlusACD Biotechne322331Perméabiliser les coupes tissulaires & nbsp ; en digérant partiellement les protéines et en digérant exposer les molécules de miARN cibles
Eau sans ARN & nbsp ;Corning  ;46-000-CM  ;Nettoyer et préparer tout le matériel, et à utiliser comme diluant si nécessaire...   ;
Préadolescent 20Sigma-AldrichP1379-25MLPour créer TBS-T
Amplification du signal tyramide plus cyanine 3Akoya Biosciences & nbsp ;NEL744001KTFluorophore pour identifier les miARN
Sondes U6 et MiARN brouilléesQiagen339459Sondes de contrôle optionnelles
Grade histologique des xylènesThermo Fisher ScientificUN1307Pour la déparaffinisation

Références

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

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Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification
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