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Détection séquentielle de biomolécules dans des échantillons fixés au formol et inclus dans de la paraffine avec imagerie par spectrométrie de masse

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie par spectrométrie de masse pour la détection séquentielle des métabolites, des glycanes liés à l’N et des peptides tryptiques dans des échantillons de tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tissus sont des environnements cellulaires complexes, composés d’un vaste éventail de types de cellules et de biomolécules qui interagissent tous les uns avec les autres pour remplir les fonctions de l’organe. Traditionnellement, les techniques d’analyse des biomolécules telles que les métabolites, les glycanes et les protéines impliquaient l’homogénéisation des tissus, détruisant toute information spatiale. Ces méthodes traditionnelles ont empêché la compréhension complète des interactions moléculaires intra et extracellulaires complexes. L’imagerie par spectrométrie de masse (MSI), quant à elle, préserve non seulement les informations spatiales des biomolécules dans les tissus, mais permet également de détecter plusieurs classes d’analytes à partir de la même section de tissu grâce à une analyse séquentielle à une résolution proche de celle d’une seule cellule. Cela nous permet d’obtenir une image plus complète des interactions moléculaires entre différentes classes de biomolécules. Le protocole présenté ici décrit les étapes de réalisation de l’imagerie par spectrométrie de masse des métabolites, des glycanes liés à l’N et des peptides tryptiques séquentiellement à partir de la même section de tissu à une résolution de 20 μm. L’examen consciencieux de l’ordre dans lequel les classes d’analytes sont imagées, ainsi que la manipulation minutieuse des sections pour en assurer l’intégrité, permettent de collecter plusieurs images de haute qualité à partir de la même section. Ces données peuvent ensuite être intégrées à d’autres données omiques spatiales (transcriptomique, immunohistochimie, etc.) collectées à partir de coupes en série, où la même cellule peut être analysée dans ces coupes adjacentes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) est une technique puissante qui permet de détecter et de visualiser des centaines à des milliers de biomolécules à partir de coupes de tissus minces, sans qu’il soit nécessaire de connaître a priori les molécules exactes présentes dans le tissu, ce qui en fait un excellent outil pour la découverte de biomarqueurs1. Bien que plusieurs types de MSI soient utilisés par différents laboratoires, notamment la désorption par électro-ionisation (DESI)2,3, la désorption par désorption par injection laser assistée par matrice infrarouge (IR-MALDESI)4 et la spectrométrie de masse d’ions secondaires (SIMS)5, la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) reste la plus couramment utilisée et la plus polyvalente. La plupart des classes de biomolécules peuvent être détectées par MSI en adaptant la préparation de l’échantillon, y compris le lavage/prétraitement des tissus, la digestion enzymatique et la matrice/solvant utilisé 6,7. MALDI MSI a été utilisé pour la détection de métabolites, de lipides, de glycanes, de protéines et de peptides protéolytiques.

Les études MSI ont été utilisées dans une variété d’études cliniques et précliniques pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie 8,9, améliorer la classification et la stadification du cancer10,11, prédire l’issue du traitement12, améliorer le diagnostic13 et déterminer les marges tumorales moléculaires14, entre autres. La plupart de ces études se sont concentrées sur la détection d’une seule classe d’analytes. Cependant, il est souvent intéressant d’analyser plus d’une classe de biomolécules à partir d’un même échantillon. Traditionnellement, cela a été réalisé avec des coupes en série de tissus. Mais plus récemment, des exemples ont été montrés d’analyse séquentielle de plusieurs classes d’analytes à partir d’une même section de tissu. Par exemple, Yagnik et al. ont démontré l’imagerie lipidique de tissus congelés suivie d’une immunohistochimie MALDI à partir de la même section pour la classification des types de cellules15. Clift et al. ont montré l’application séquentielle de PNGaseF, de collagénase et de trypsine à des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) pour l’imagerie des glycanes liés à l’N, des protéines de la matrice extracellulaire et des protéines générales, respectivement16. Escobar et al. ont démontré l’analyse séquentielle de glycanes liés à l’N, D’O-GlcNAc et de peptides tryptiques à partir de la même section de tissu congelé17. Ces types d’expériences sont réalisés grâce à une planification expérimentale minutieuse pour analyser d’abord les analytes les plus facilement perdus, suivis de ceux qui sont plus stables dans le tissu. Dans de nombreux cas, les lavages utilisés pour éliminer les classes indésirables de molécules aident à améliorer d’autres classes de molécules6, une propriété qui peut être exploitée, où chaque lavage qui supprime la matrice précédemment appliquée contribue également à améliorer le signal de la classe suivante d’analytes à imager.

Récemment, nous avons publié un flux de travail pour l’analyse séquentielle des métabolites, des glycanes liés à l’N et des peptides tryptiques de la même section de tissu cancéreux de l’ovaire FFPE18. Nous présentons ici le flux de travail détaillé pour l’analyse de ces trois classes de biomolécules à partir d’une même section de tissu ; une vue d’ensemble du protocole est détaillée à la figure 1. À notre connaissance, il s’agit d’un premier protocole décrivant en détail ce flux de travail pour l’imagerie séquentielle à partir de tissus FFPE. Brièvement, des coupes de tissus sont déparaffinés avec du xylène avant d’être enrobées d’une matrice de 1,5-diaminonaphtalène (10 mg/mL dans de l’acétonitrile à 50 %) pour l’imagerie des métabolites en mode ions négatifs. La matrice est ensuite retirée, les sections réhydratées et l’antigène récupéré, avant d’être pulvérisée avec de la PNGase F (0,1 μg/μL dans du bicarbonate d’ammonium) pour libérer des glycanes liés à l’azote in situ. Après l’incubation, les sections sont recouvertes d’une matrice d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) (10 mg/mL dans 70 % d’acétonitrile, 0,1 % d’acide trifluoroacétique) et imagées en mode d’ions positifs. La matrice est ensuite retirée de nouveau, la réhydratation et la récupération de l’antigène sont répétées, et les sections sont pulvérisées avec de la trypsine (0,075 μg/μL dans du bicarbonate d’ammonium) et incubées avant d’être à nouveau enrobées de matrice CHCA (10 mg/mL dans de l’acétonitrile à 70 %, 0,1 % d’acide trifluoroacétique) et imagées en mode ionique positif. Toutes les solutions doivent être fraîches, immédiatement avant utilisation, et si possible, les expériences doivent être effectuées sur 3 jours consécutifs. En cas de retard, les sections doivent être stockées dans un congélateur à -80 °C sous dessiccation.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise des tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) prélevés chez des patientes non traitées auparavant subissant une chirurgie cytoréductrice primaire pour un carcinome séreux de l’ovaire de haut grade. Toutes les données cliniques ont été obtenues à partir du dépôt du cancer de l’ovaire du Département d’oncologie gynécologique et de médecine de la reproduction, selon des protocoles approuvés par le conseil d’examen institutionnel de l’Université du Texas MD Anderson. Le consentement éclairé écrit des patients a été obtenu par le personnel de la réception, et les études ont été menées conformément aux directives éthiques reconnues.

1. Préparation de l’échantillon d’imagerie du métabolite

REMARQUE : Ce protocole suppose que des coupes de tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine (4 μm d’épaisseur) ont déjà été montées sur des lames de microscope en verre, car les échantillons cliniques doivent généralement être sectionnés dans une carotte de pathologie clinique par des histotechniciens. Comme le travail présenté ici est effectué sur l’instrument TOF référencé, la mesure orthogonale du TOF atténue le besoin de lames conductrices traditionnellement utilisées dans les expériences MSI. L’utilisation de lames de microscope standard est également plus propice aux flux de travail standard dans les laboratoires de pathologie clinique, ainsi qu’à l’utilisation de tissus d’archives déjà présents sur les lames.

  1. Faites des repères aux quatre coins de la diapositive à l’aide d’un scribe en diamant.
  2. Déparaffiniser les coupes par immersion dans du xylène de qualité histologique pendant 3 min.
    REMARQUE : Le xylène est nocif et doit être utilisé dans une hotte chimique.
  3. Immerger les sections dans du xylène frais pendant 3 min.
  4. Laissez la lame sécher à température ambiante.
  5. Placez la diapositive dans une cible d’adaptateur de diapositive.
  6. Acquérez une image optique de la diapositive à l’aide d’un scanner à plat à une résolution de 4 800 ppp.
  7. Fabriquer une matrice MALDI en dissolvant 15 mg de 1,5-diaminonaphtalène (DAN) dans 1,5 mL de 50 % d’ACN. Sonicate jusqu’à dissolution complète, ~5 min. Filtrez la solution matricielle avant de la charger dans la boucle d’échantillonnage.
    REMARQUE : Le DAN est un cancérogène suspecté et doit être utilisé avec un équipement de protection individuelle approprié. La pulvérisation matricielle doit être effectuée dans une hotte chimique.
  8. Pulvérisez la lame avec une solution DAN à l’aide d’un pulvérisateur de réactifs robotisé avec les paramètres suivants : Vitesse de la piste - 1 200 mm/s ; Espacement des chenilles - 3 mm ; Température de la buse - 60 °C ; Hauteur de la buse - 40 mm ; Débit - 100 μL/min ; Passes - 4 ; N 2 Pression - 10 psi ; Motif - CC
  9. Appliquez 0,5 μL de phosphore rouge en suspension dans du méthanol à un endroit connu sur la lame.

2. Collecte de données d’imagerie des métabolites

  1. Placez la ou les lames préparées dans un adaptateur de diapositive II et chargez-les dans un spectromètre de masse timsTOF fleX MALDI QTOF.
  2. Chargez la méthode appropriée pour la collecte de données en mode ions négatifs dans timsControl avec tims OFF. Si l’instrument n’était pas déjà en mode ions négatifs, attendez au moins 25 min après le changement de polarité pour l’équilibrage avant l’étalonnage et la collecte des données avec les paramètres suivants de l’instrument pour les métabolites : plage m/z - 50 - 600 ; Portée de balayage laser - 16,0 μm en X et Y ; Taille de champ résultante - 20,0 μm en X et en Y ; Tirs laser - 150 ; Fluence laser - ~30 %; Entonnoir 1 RF - 150.0 Vpp ; Entonnoir 2 RF - 200,0 Vpp ; Multipolaire RF - 200,0 Vpp ; Énergie de collision - 10,0 eV ; Collision RF - 500.0 Vpp ; Temps de transfert - 55,0 μs ; Stockage PrePulse - 5,0 μs (figure supplémentaire S1).
  3. Effectuez un profil cible (cliquez sur le bouton Générer maintenant ) et un réglage de la mise au point (cliquez sur le bouton Ajuster maintenant ) dans l’onglet Support d’échantillon. Ajustez la position du laser en X et Y, si nécessaire sur la languette du laser , pour vous assurer que le laser est exactement aligné avec le réticule.
  4. Prélevez un spectre de phosphore rouge en additionnant au moins cinq séries de tirs laser à partir de l’endroit sur la diapositive.
  5. Effectuez un étalonnage en cliquant sur le bouton Calibrer dans l’onglet Étalonnage. Supprimez tous les pics d’erreur de très faible intensité ou de ppm élevé.
    REMARQUE : Même les amas de phosphore (P2 et P4) donnent généralement un signal très faible. Le score d’étalonnage doit être de 100 % avant de cliquer sur accepter. Si ce n’est pas le cas, effacez le spectre additionné et acquérez-en un nouveau.
  6. Lancez le logiciel flexImaging . L’interface graphique d’acquisition d’images démarrera automatiquement.
  7. Sélectionnez Configurer une nouvelle exécution d’imagerie dans la fenêtre Choisir une exécution d’imagerie .
  8. Choisissez Flux de travail classique dans la fenêtre Sélectionner un flux de travail .
  9. Dans la fenêtre Stockage des données , indiquez un nom d’exécution d’imagerie et un répertoire de résultats pour les données.
    REMARQUE : Les espaces ne doivent pas être utilisés dans les noms de fichiers.
  10. Dans la fenêtre Paramètres d’acquisition , choisissez Régions de mesure définies par l’utilisateur et tapez 20 dans la zone Largeur raster . Cliquez sur Parcourir pour sélectionner la méthode timsControl précédemment créée.
  11. Dans la fenêtre Exemple d’image , cliquez sur Parcourir pour sélectionner l’image optique acquise à l’aide du scanner à plat.
  12. Dans la fenêtre Apprendre l’échantillon , effectuez un alignement en trois points entre l’image optique et la diapositive ; Ensuite, déplacez le support d’échantillon vers le premier repère gravé sur la lame et alignez le réticule dans timsControl avec une caractéristique distincte de la gravure. Zoomez sur l’image (zoom à 100 % recommandé), réglez l’exemple d’image sur Définir les points d’apprentissage et cliquez sur le même emplacement dans l’image optique. Répétez ce processus 2 fois plus pour un total de trois points d’apprentissage. Cliquez sur Suivant pour terminer l’enseignement.
  13. Cliquez sur OK pour quitter l’Assistant Exécution d’une nouvelle imagerie.
  14. Vérifiez l’exactitude de l’enseignement en cliquant sur le bouton Position Sample Carrier dans le logiciel. Zoomez et cliquez sur une caractéristique distincte du quatrième point de repère (inutilisé) de l’image ; le support d’échantillon se déplacera vers cette position dans timsControl. Vérifiez que le réticule s’aligne sur la fonction sélectionnée. S’ils ne s’alignent pas, effacez l’enseignement dans flexImaging et répétez le processus d’apprentissage pour améliorer la précision.
  15. Dans le logiciel, sélectionnez l’outil Ajouter une région de mesure de polygone et décrivez le(s) tissu(s) à imager. Chaque clic de souris créera un point d’ancrage. Appuyez sur le bouton de retour arrière du clavier pour supprimer les points, un par un. Une fois la région dessinée, double-cliquez sur la souris pour fermer le polygone.
  16. Vérifiez le signal en tirant le laser à quelques endroits dans le tissu. Cliquez sur un emplacement dans l’image à l’aide du bouton Position du support d’échantillon, comme à l’étape 2.14, pour vérifier l’enseignement. Le spectre sera dominé par des pics matriciels autour de m/z 157 et 313 ; Zoomez sur la région M/Z en dessous de 154 et de 250-300 pour montrer de nombreux pics de métabolites de petites molécules et d’acides gras, respectivement. Ajustez la fluence du laser au besoin pour un signal optimal.
  17. Enregistrez la méthode timsControl.
  18. Démarrez l’acquisition d’images en cliquant sur le bouton Démarrer AutoXecute Run dans le logiciel
    REMARQUE : L’imagerie en mode ions négatifs avec la matrice DAN permet de détecter de nombreux métabolites du cycle TCA, des acides aminés et des acides gras, entre autres.

3. Préparation de l’échantillon pour l’imagerie des glycanes liés à l’azote

  1. Après avoir retiré l’échantillon du spectromètre de masse, retirez la matrice DAN en immergeant la lame dans de l’éthanol à 100 % (200 proof) pendant 1 min.
  2. Réhydrater la lame dans des bocaux Coplin : Fraîche 100 % éthanol pendant 1 min ; éthanol à 95 % pendant 1 min ; 70 % d’éthanol pendant 1 min ; Arroser pendant 3 min ; Eau douce pendant 3 min.
  3. Laissez la diapositive sécher pendant ~15 min.
  4. Effectuer la récupération de l’antigène en immergeant la lame dans 100 mM de tampon Tris (obtenu en dissolvant 6,06 g de Tris Base dans 500 mL d’eau et en ajustant le pH au besoin), pH 9, dans un bocal Coplin avec un couvercle placé sans serrer sur le dessus qui est placé dans une chambre de démasquage avec 500 mL d’eau dans la chambre. Chauffer à 95 °C pendant 20 min.
  5. Retirez le bocal Coplin de la chambre de détrempage et placez-le sur la paillasse pour qu’il refroidisse pendant 20 min.
  6. Remplacez la glissière par tampon par de l’eau en cinq changements. Pour les trois premiers, versez la moitié de la solution et remplacez-la par de l’eau. Pour les deux derniers, versez toute la solution et remplacez-la par de l’eau.
  7. Laissez la diapositive sécher complètement.
  8. Créer une chambre d’humidité pour l’incubation de la lame après l’application de PNGaseF. Découpez un cercle d’une lingette absorbante pour couvrir le fond d’une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre. Roulez deux lingettes de laboratoire pour créer des oreillers de chaque côté de la boîte de Pétri (figure 2). Ajoutez 8 ml d’eau pour saturer ces lingettes et mettez le couvercle sur la boîte de Pétri et placez-la dans un four à 37 °C pendant au moins 30 min pour la préchauffer.
    REMARQUE : L’intérieur du plat doit sembler humide.
  9. Préparez PNGaseF en reconstituant 100 μg d’enzyme lyophilisée dans 200 μL de bicarbonate d’ammonium de 100 mM, pH 7,8 et vortex à mélanger. Transférez la solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et diluez-la à 1 mL avec de l’eau.
  10. Vaporisez la lame avec PNGaseF à l’aide du pulvérisateur de réactifs robotisé avec les paramètres suivants. Utilisez la pompe à seringue pour les applications à faible volume/faible débit : Vitesse de piste - 1200 mm/s ; Espacement des chenilles - 3 mm ; Température de la buse - 45 °C ; Hauteur de la buse - 40 mm ; Débit - 25 μL/min ; Passes - 15 ; N 2 Pression - 10 psi ; Motif - CC
  11. Placez la lame dans la boîte de Pétri préchauffée, côté tissu vers le haut, avec une extrémité sur chacun des coussins de lingettes de laboratoire. Replacez la lame et scellez la boîte de Pétri avec un film d’étanchéité adhésif. Placez dans le four à 37 °C et placez un coussin chauffant pour reptiles réglé à 40 °C sur la boîte de Pétri.
    REMARQUE : Cela maintient le couvercle la partie la plus chaude du plat et empêche la condensation de se former sur le couvercle et de tomber sur le tissu, ce qui provoquera des artefacts dans les images.
  12. Incuber la lame pendant 2 h pour permettre à la digestion de se poursuivre.
  13. Retirez la lame de la boîte de Pétri et laissez sécher pendant ~5 min.
  14. Fabriquer la matrice MALDI en dissolvant 15 mg d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) dans 1,5 mL de phosphate d’ammonium à 70 %, 0,1 % d’AGT et 10 mM.
    REMARQUE : Le TFA est caustique et doit être utilisé dans une cagoule avec un équipement de protection individuelle approprié.
  15. Sonicate jusqu’à dissolution complète, ~5 min.
  16. Filtrez la solution matricielle avant de la charger dans la boucle d’échantillonnage.
  17. Pulvérisez la lame avec CHCA à l’aide du pulvérisateur de réactifs robotisé avec les paramètres suivants : Vitesse de la piste - 1 200 mm/s ; Espacement des chenilles - 3 mm ; Température de la buse - 75 °C ; Hauteur de la buse - 40 mm ; Débit - 120 μL/min ; Passes - 3 ; N 2 Pression - 10 psi ; Motif - HH
  18. Appliquez 0,5 μL de phosphore rouge en suspension dans du méthanol à un endroit connu sur la lame.

4. Collecte de données d’imagerie des glycanes liés à l’azote

  1. Placez la ou les lames préparées dans la cible de l’adaptateur de diapositive et chargez-les dans le spectromètre de masse MALDI QTOF.
  2. Chargez la méthode appropriée pour la collecte de données en mode ionique positif dans timsControl. Si l’instrument n’était pas déjà en mode d’ions positifs, attendez au moins 25 min après le changement de polarité pour l’équilibrage avant l’étalonnage et la collecte des données avec les paramètres suivants de l’instrument pour les glycanes : plage m/z - 700-3500 ; Portée de balayage laser - 16,0 μm en X et Y ; Taille de champ résultante - 20,0 μm en X et en Y ; Tirs laser - 200 ; Fluence laser - ~25 %; Entonnoir 1 RF - 450.0 Vpp ; Entonnoir 2 RF - 500.0 Vpp ; Multipolaire RF - 500,0 Vpp ; Énergie de collision - 10,0 eV ; Collision RF - 2 700,0 Vpp ; Temps de transfert - 140,0 μs ; Stockage PrePulse - 14,0 μs (figure supplémentaire S2).
  3. Effectuez un profil cible (cliquez sur le bouton Générer maintenant ) et un réglage de la mise au point (cliquez sur le bouton Ajuster maintenant ) dans l’onglet Support d’échantillon . Ajustez la position du laser en X et Y, si nécessaire, sur l’onglet laser pour vous assurer que le laser est aligné avec le réticule.
  4. Prélevez un spectre de phosphore rouge en additionnant au moins cinq séries de tirs laser à partir de l’endroit sur la diapositive.
  5. Effectuez un étalonnage en cliquant sur le bouton Calibrer dans l’onglet Étalonnage. Supprimez tous les pics d’erreur de très faible intensité ou de ppm élevé.
    REMARQUE : Le score d’étalonnage doit être de 100 % avant de cliquer sur accepter. Si ce n’est pas le cas, effacez le spectre additionné et acquérez-en un nouveau.
  6. Ouvrez le fichier .mis précédemment utilisé pour l’imagerie des métabolites dans le logiciel.
  7. Enregistrez le fichier sous un nouveau nom indiquant qu’il s’agit de données glycanes.
  8. Sous Modifier | Propriétés de l’exécution d’imagerie, remplacez la méthode d’acquisition par la méthode de glycane souhaitée.
  9. Effacer l’enseignement précédent à l’aide de Modifier | Points d’apprentissage clairs.
    REMARQUE : La glissière ne sera pas exactement dans la même position après l’avoir retirée et rechargée dans l’adaptateur de glissière.
  10. Effectuer un nouvel enseignement à l’aide de Modifier | Définir des points d’enseignement ; Définissez 3 points comme cela a été fait dans l’assistant d’imagerie d’origine (étape 2.12).
  11. Vérifiez l’exactitude de l’enseignement en cliquant sur le bouton Position Sample Carrier dans le logiciel. Zoomez et cliquez sur une caractéristique distincte du quatrième point de repère (inutilisé) de l’image. Le support d’échantillon se déplacera vers cette position dans timsControl ; Vérifiez que le réticule s’aligne sur la fonction sélectionnée.
    REMARQUE : Si le réticule ne s’aligne pas, effacez l’enseignement et répétez le processus d’enseignement pour améliorer la précision.
  12. Enregistrez le fichier.
  13. Vérifiez le signal en tirant le laser à quelques endroits dans le tissu. Cliquez sur un emplacement dans l’image à l’aide du bouton Positionner le support d’échantillon comme à l’étape 4.11 pour vérifier l’enseignement. Confirmez que le spectre présente des pics de glycanes abondants avec des pics dominants généralement à m/z 1 663 et 1 809. Ajustez la fluence du laser au besoin pour un signal optimal.
  14. Enregistrez la méthode timsControl.
  15. Démarrez l’acquisition d’images en cliquant sur le bouton Démarrer l’exécution d’AutoXecute .

5. Préparation d’échantillons pour l’imagerie peptidique tryptique

  1. Retirez la matrice CHCA en immergeant la lame dans de l’éthanol à 100 % (200 proof) pendant ~1 min
  2. Réhydratez la lame dans des bocaux Coplin comme suit : Fraîche 100 % éthanol pendant 1 min ; éthanol à 95 % pendant 1 min ; 70 % d’éthanol pendant 1 min ; Arroser pendant 3 min ; Eau douce pendant 3 min.
  3. Laissez la diapositive sécher pendant ~15 min.
  4. Effectuez la récupération de l’antigène en immergeant la lame dans un tampon Tris de 100 mM, pH 9, dans un bocal Coplin avec un couvercle placé sans serrer sur le dessus qui est placé dans une chambre de démasquage avec 500 mL d’eau dans la chambre. Chauffer à 95 °C pendant 20 min.
    REMARQUE : Cette deuxième récupération de l’antigène est nécessaire pour dénaturer les protéines afin d’obtenir un accès plus efficace de la trypsine aux sites de clivage.
  5. Retirez le bocal Coplin de la chambre de détrempage et placez-le sur la paillasse pour qu’il refroidisse pendant 20 min.
  6. Remplacez la glissière par tampon par de l’eau en cinq changements. Pour les trois premiers, versez la moitié de la solution et remplacez-la par de l’eau. Pour les deux derniers, versez toute la solution et remplacez-la par de l’eau.
  7. Laissez la diapositive sécher complètement.
  8. Préparez la trypsine en reconstituant 100 μg d’enzyme lyophilisée dans 200 μL de 100 mM d’acide acétique et faites une pipette de haut en bas pour mélanger. Effectuer l’aliquote dans des tailles appropriées pour l’expérience (généralement 40 μL) et conserver à -20 °C.
  9. Préparez une aliquote de 40 μL de trypsine en ajoutant 350 μL de bicarbonate d’ammonium 100 mM, pH 7,8 et 39 μL d’ACN. Bien mélanger.
    REMARQUE : L’acétonitrile (10 % d’ACN) augmente l’activité de la trypsine par rapport à la solution aqueuse et réduit la tension superficielle de la solution pour la pulvérisation19.
  10. Vaporisez la lame avec de la trypsine à l’aide d’un pulvérisateur de réactifs robotisé avec les paramètres suivants. Utilisez le pousse-seringue pour les applications à faible volume/faible débit : Vitesse de piste - 750 mm/s ; Espacement des chenilles - 3 mm ; Température de la buse - 30 °C ; Hauteur de la buse - 40 mm ; Débit - 10 μL/min ; Passes - 12 ; N 2 Pression - 10 psi ; Motif - HH
  11. Placez un carré de lingette absorbante au fond d’une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre ; assurez-vous que les coins touchent à peine le bord du plat et répartissez 1 mL d’eau sur la lingette.
  12. Placez la lame sur la lingette, côté mouchoir vers le haut, placez le couvercle sur la boîte de Pétri et scellez la boîte de Pétri avec un film d’étanchéité adhésif.
  13. Incuber la lame pendant 4 h à 37 °C pour permettre la digestion.
  14. Retirez la lame de la boîte de Pétri et laissez-la sécher pendant ~5 min.
  15. Réalisez une matrice MALDI en dissolvant 15 mg d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) dans 1,5 mL de 70 % d’ACN, 0,1 % d’TFA, 10 mM de phosphate d’ammonium.
  16. Sonicate jusqu’à dissolution complète, ~5 min.
  17. Filtrez la solution matricielle avant de la charger dans la boucle d’échantillonnage.
  18. Pulvérisez la lame avec CHCA à l’aide d’un pulvérisateur de réactifs robotisé avec les paramètres suivants : Vitesse de la piste - 1200 mm/s ; Espacement des chenilles - 3 mm ; Température de la buse - 75 °C ; Hauteur de la buse - 40 mm ; Débit - 120 μL/min ; Passes - 4 ; N 2 Pression - 10 psi ; Motif - HH
  19. Appliquez 0,5 μL de phosphore rouge en suspension dans du méthanol à un endroit connu sur la lame.

6. Collecte de données d’imagerie du peptide tryptique

  1. Placez la ou les lames préparées dans un adaptateur de diapositive et chargez-les dans un spectromètre de masse timsTOF MALDI QTOF.
  2. Chargez la méthode appropriée pour la collecte de données en mode ionique positif dans timsControl. Si l’instrument n’était pas déjà en mode d’ions positifs, attendez au moins 25 min après le changement de polarité pour l’équilibrage avant l’étalonnage et la collecte des données en utilisant les paramètres suivants de l’instrument pour les peptides : plage m/z - 600-4500 ; Portée de balayage laser - 16,0 μm en X et Y ; Taille de champ résultante - 20,0 μm en X et en Y ; Tirs laser - 200 ; Fluence laser - ~25 %; Entonnoir 1 RF - 450.0 Vpp ; Entonnoir 2 RF - 500.0 Vpp ; Multipôle RF - 600,0 Vpp ; Énergie de collision - 10,0 eV ; Collision RF - 3400.0 Vpp ; Temps de transfert - 180,0 μs ; Stockage PrePulse - 18,0 μs (figure supplémentaire S3).
  3. Effectuez un profil cible (cliquez sur le bouton Générer maintenant ) et un réglage de la mise au point (cliquez sur le bouton Ajuster maintenant ) dans l’onglet Support d’échantillon. Ajustez la position du laser en X et Y, si nécessaire, sur la languette du laser pour vous assurer que le laser est aligné avec le réticule.
  4. Prélevez un spectre de phosphore rouge en additionnant au moins cinq séries de tirs laser à partir de l’endroit sur la diapositive.
  5. Effectuez un étalonnage en cliquant sur le bouton Calibrer dans l’onglet Étalonnage. Supprimez tous les pics d’erreur de très faible intensité ou de ppm élevé. Vérifiez que le score d’étalonnage est de 100 % avant de cliquer sur Accepter. Si ce n’est pas le cas, effacez le spectre additionné et acquérez-en un nouveau.
  6. Ouvrez le fichier .mis précédemment utilisé pour l’imagerie des glycanes.
  7. Enregistrez le fichier avec un nouveau nom indiquant qu’il s’agit de données peptidiques.
  8. Sous Modifier | Propriétés de l’exécution d’imagerie, remplacez la méthode d’acquisition par la méthode peptidique souhaitée.
  9. Effacer l’enseignement précédent à l’aide de Modifier | Points d’apprentissage clairs.
    REMARQUE : La glissière ne sera pas exactement dans la même position après l’avoir retirée et rechargée dans l’adaptateur de glissière.
  10. Effectuer un nouvel enseignement à l’aide de Modifier | Définir des points d’enseignement ; définissez trois points comme cela a été fait dans l’assistant de création d’images d’origine (étape 2.12).
  11. Vérifiez la précision de l’enseignement en cliquant sur le bouton Position du support d’échantillons . Zoomez et cliquez sur une caractéristique distincte du quatrième point de repère (inutilisé) de l’image. Le support d’échantillon se déplacera vers cette position dans timsControl ; Vérifiez que le réticule s’aligne sur la fonction sélectionnée.
    REMARQUE : Si le réticule ne s’aligne pas, effacez l’enseignement et répétez le processus d’enseignement pour améliorer la précision.
  12. Enregistrez le fichier.
  13. Vérifiez le signal en tirant le laser à quelques endroits dans le tissu. Cliquez sur un emplacement dans l’image à l’aide du bouton Position Sample Carrier comme à l’étape 6.11 pour vérifier l’enseignement. Confirmez que le spectre présente des pics peptidiques abondants avec des pics dominants généralement à m/z 944, 1 105 et 1 198. Ajustez la fluence du laser au besoin pour un signal optimal.
  14. Enregistrez la méthode timsControl.
  15. Démarrez l’acquisition d’images en cliquant sur le bouton Démarrer l’exécution d’AutoXecute .

7. Coloration histologique

REMARQUE : Il existe plusieurs méthodes pour l’hématoxyline et l’éosine. Voici une méthode Carazzi modifiée fréquemment utilisée dans ce laboratoire.

  1. Retirez la matrice CHCA en immergeant la lame dans de l’éthanol à 100 % pendant 1 min.
  2. Colorer la diapositive comme suit : éthanol à 95 % pendant 30 s ; 70 % d’éthanol pendant 30 s ; Eau pendant 30 s ; Hématoxyline pendant 2 min ; Eau pendant 30 s ; 70 % d’éthanol pendant 30 s ; 95 % d’éthanol pendant 30 s ; Éosine pendant 1 min ; 95 % d’éthanol pendant 30 s ; 100 % éthanol pendant 30 s ; Xylène pendant 2,5 min ; Lamelle avec support de montage.
  3. Laissez sécher la lame pendant >1 h et éliminez les bulles en appuyant doucement sur la lamelle.
  4. Numérisez avec un scanner de lames numérique.

8. Visualisation des données

REMARQUE : Il y a une analyse approfondie qui peut être effectuée avec SCiLS Lab qui dépasse le champ d’application de ce protocole. Ici, nous nous contenterons de décrire la création de fichiers de base, la visualisation des données et la recherche de pics dans des bases de données pour une identification présumée.

  1. Lancez SCiLS Lab 2025b et choisissez Nouveau.
  2. Sélectionnez le(s) fichier(s) de données à charger dans le logiciel.
    REMARQUE : Avec SCiLS Lab Pro, plusieurs fichiers de données collectés avec les mêmes paramètres peuvent être chargés ensemble pour être normalisés les uns par rapport aux autres et visualisés simultanément.
  3. Organisez les échantillons dans la disposition de votre choix. Déplacez les échantillons en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en les faisant glisser. Faites pivoter les échantillons en cliquant avec le bouton droit de la souris et en les faisant glisser. Sélectionnez Suivant.
  4. Dans la fenêtre Paramètres de l’axe de masse , effectuez les ajustements nécessaires. Les valeurs par défaut fonctionnent généralement bien pour les données timsTOF. Cliquez sur Suivant.
  5. Dans la fenêtre Recherche de fonctionnalités , définissez les valeurs appropriées pour le prélèvement automatique des pics lors de l’importation. Cliquez sur Suivant.
    REMARQUE : Cela ne fonctionne pas bien pour les données sur les métabolites des tissus FFPE et doit être ignoré.
  6. Les paramètres d’importation seront visualisés dans la fenêtre Résumé de l’importation . Cliquez sur Importer.
  7. Indiquez un nom de fichier et un emplacement pour enregistrer le fichier SCiLS.
    REMARQUE : Selon la taille du fichier, l’importation peut prendre de quelques minutes à plusieurs heures.
  8. Une fois l’opération terminée, une fenêtre récapitulative sera visible. Cliquez sur Ouvrir le jeu de données importé pour interagir avec le fichier SCiLS.
  9. En haut à droite du logiciel, cliquez sur le menu déroulant à côté de Normalisation et sélectionnez Root Mean Square.
    REMARQUE : Il s’agit de la méthode la plus appropriée pour les données timsTOF compte tenu de la rareté des données de centroïde importées et elle fournira la meilleure visualisation.
  10. Sous Fichier | Propriétés du fichier, définissez la largeur de l’intervalle sur une valeur appropriée, généralement 10 à 15 ppm pour les données timsTOF. Vérifiez que la valeur est appropriée en évaluant si elle couvre la largeur d’un pic dans le spectre moyen.
  11. Zoomez sur le spectre moyen en bas du logiciel, soit en cliquant et en faisant glisser, soit en faisant rouler la molette de la souris vers l’avant.
  12. Sélectionnez un pic à visualiser en positionnant le réticule au sommet et en cliquant avec le bouton gauche de la souris.
  13. Ajoutez les ions d’intérêt à la liste des images d’ions active en appuyant sur Ctrl + barre d’espace.
  14. Enregistrez la liste des fonctionnalités sélectionnées en cliquant sur le bouton Enregistrer en tant que liste de fonctionnalités en bas de la fenêtre des images ioniques sur le côté droit du logiciel.
  15. Ouvrez une liste de fonctionnalités enregistrée en cliquant sur Fichier | Feature Table et recherchez à l’aide de MetaboScape les ID de métabolites ou de glycanes présumés, si MetaboScape est installé et configuré sur le même réseau. Vous pouvez également convertir les fichiers SCiLS en fichiers .imzML pour les importer dans METASPACE (https://metaspace2020.org/) à des fins d’identification présumée.
    REMARQUE : Une description complète des capacités de SCiLS Lab se trouve dans le manuel de l’utilisateur sous l’option de menu Aide .

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’achèvement de ce protocole devrait aboutir à trois ensembles de données MSI robustes provenant de la même section de tissu. Dans la visualisation du spectre complet des données de métabolites, le spectre sera fortement dominé par des pics matriciels à m/z 157 et 315. Ceci est normal pour les tissus FFPE. De nombreux signaux de métabolites et d’acides gras seront observés en zoomant sur les gammes m/z <155 et entre 250 et 300. La figure 3 montre des exemples de gammes complètes et zoomée...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La collecte de données MSI séquentielles à partir d’une seule coupe de tissu nécessite une attention particulière aux détails. Il y a quelques étapes qui sont absolument cruciales pour obtenir des données de haute qualité. Tout d’abord, il faut faire attention si plus d’une diapositive est préparée en même temps. Lorsque vous placez les lames dans des bocaux Coplin ou que vous vous déplacez entre ceux-ci, veillez à ne pas placer deux lames dans la même position dans le bocal. Cela entraî...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS et l’installation d’imagerie par spectrométrie de masse de l’Université du Texas à Austin sont soutenus par un prix de l’Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas (RP240559). Cette recherche a été financée en partie par l’Alliance de recherche sur le cancer de l’ovaire (OCRA 811621 et 891490), la Fondation Sie et le Fonds de dotation Stephanie C. Stelter. Cette recherche a été réalisée en collaboration avec la plateforme de cytométrie en flux et d’imagerie cellulaire, qui est soutenue en partie par les National Institutes of Health par le biais de la subvention P30 CA016672 du Centre de cancérologie de M. D. Anderson et du spécialiste de recherche 1 R50 R50 CA243707-01A1 du NCI de Jared Burks.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-diaminonaphtalèneFisher ScientificD010125GMatrice MALDI pour l’imagerie des métabolites
AcétonitrileFisher ScientificRéf. A955-4Solvant de qualité LC-MS utilisé pour la préparation de la matrice
Acide &alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamiqueSigma-AldrichRéférence 70990-1G-FMatrice MALDI pour l’imagerie des glycanes et des peptides
Bicarbonate d’ammoniumFisher ScientificRéf. A643-500Tampon pour enzymes
Phosphate d’ammoniumSigma-AldrichRéf. 467782-50GAdditif pour réduire les amas de matrices pendant l’imagerie
Chambre de démasquage NxGenBiocare MédicalN/AUtilisé pour le prélèvement d’antigènes dans les tissus
ÉthanolFisher Scientific04-355-223Solvant de qualité LC-MS utilisé pour la préparation et la coloration des matrices
Pulvérisateur de réactifs robotisé M5Imagerie HTXN/AUtilisé pour l’application d’enzymes et de matrices sur les tissus
MéthanolFisher ScientificN° A456-4Solvant de qualité LC-MS pour la fabrication d’une suspension de phosphore rouge
Trypsine de qualité MSFisher ScientificPI90058Enzyme pour la digestion des protéines
Adaptateur de glissière MTP IIBruker Daltonics8235380Adaptateur pour insérer les lames du micrscope dans le spectromètre de masse
NanoZoomer SQ Scanner de lames numériqueHamamatsu CorpN/AUtilisé pour générer des images de microscopie numérique de tissus colorés
Scanner à plat Perfection V600EpsonN/AUtilisé pour générer une image optique de la lame pour la collecte de données MSI
Sceau de PetriFisher Scientific50-212-518Pour sceller la boîte de Pétri pendant la digestion enzymatique
PNGaseFBiographie du bouledogueNZPP550LYEnzyme pour le clivage des glycanes liés à l’N à partir de protéines
Phosphore rougeSigma-AldrichRéférence 04004-250GCalibrateur MALDI pour le mode ions positifs et négatifs
Laboratoire SCiLS (2025b)Bruker DaltonicsN/ALogiciel de visualisation de données MSI
timsTOF fleX QTOF Spectromètre de masseBruker DaltonicsN/AUtilisé pour la collecte de données de spectrométrie de masse
Acide trifluoracétiqueFisher Scientific85183Additif matriciel pour diminuer le pH pour l’imagerie en mode ions positifs
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Tampon pour le prélèvement d’antigènes
EauFisher ScientificW64Solvant de qualité LC-MS utilisé pour les matrices, les enzymes et la coloration
WypAll X60Fisher Scientific19-413-113Lingette absorbante pour l’incubation d’enzymes humidifiées
XylèneFisher ScientificX3P-1GALAgent nettoyant pour la coloration

References

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