Profilage spatial complet de transcriptomes agnostiques par stéréo-seq

Summary

Cet article présente un protocole permettant d’effectuer un profilage transcriptomique spatial complet de l’ARN de l’hôte, du virus, du fongique et du microbiome à partir de coupes de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine à l’aide de Stereo-seq, qui permet de cartographier à haute résolution divers transcriptomes tout en préservant l’architecture tissulaire.

Abstract

La composition spatiale des cellules de l’hôte, ainsi que les charges bactériennes ou virales dans les tissus, peuvent avoir un impact sur l’interaction des types de cellules et des analytes qui entraînent la cellule à travers des processus spécifiques au type de cellule. Le stéréo-séquençage pour les tissus FFPE utilise l’amorçage aléatoire des codes-barres spatiaux, ce qui est différent des méthodes standard de transcriptomique spatiale, qui utilisent l’A’tailing pour capturer l’ARN messager (ARNm) ou la sonde pour capturer des transcrits spécifiques à l’espèce. Ces méthodes n’englobent pas les connaissances plus récentes sur l’impact et l’importance d’autres types d’ARN provenant de l’ARN long non codant, de l’ARN mitochondrial, du microARN ou d’autres espèces d’ARN, telles que microbiennes, virales et fongiques. Voici une procédure étape par étape, de la section tissulaire à la préparation de la banque pour une application de stéréo-séquençage spatiale indépendante de l’espèce avec détection de l’ARN à l’aide d’une méthodologie de sonde aléatoire, compatible avec les tissus inclus dans la paraffine fixée au formol (FFPE). Cette méthode Stereo-seq a une perle de capture aléatoire de 0,22 μm qui se répète dans un réseau tous les 0,5 μm, permettant une résolution subcellulaire à partir d’une technologie basée sur le séquençage. Comme cette méthode détecte à la fois l’ARN hôte et l’ARN non hôte, le protocole nécessite des considérations particulières pour permettre de déterminer ce qui se trouve à l’intérieur du tissu par rapport à ce qui a été déposé sur le tissu pendant le processus de collecte, de préservation, de coupe et de détection (c.-à-d. les contaminants environnementaux et de manipulation). Enfin, ce protocole permet d’avoir une résolution de haut niveau (unicellulaire) d’espèces multi-ARN dans un contexte spatial, fournissant un aperçu de l’intra- et inter-actime des types cellulaires et des espèces pathologiques.

Introduction

Les technologies spatio-omiques ont révolutionné l’étude de l’hétérogénéité cellulaire tissulaire en permettant la quantification simultanée de plusieurs cibles, ADN (génomique), ARN (transcriptomique), métabolites (métabolomique) ou protéines (protéomique⁾¹. La résolution de ces différents tests varie souvent, ce qui entraîne des limitations différentes lors de la mesure des analytes, soit avec une rareté accrue lors de la mesure d’une cellule unique ^2,3, soit avec un contexte spatial natif 4. En revanche, les méthodes en vrac telles que le séquençage de l’ARN ne fournissent qu’une expression génique moyenne sur des échantillons entiers et obscurcissent l’hétérogénéité cellulaire², ou le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq)^2,3, qui nécessite une dissociation tissulaire pour le séquençage de cellule unique, nécessite souvent un filtrage. Par conséquent, ces méthodes excluent les grandes cellules et les agrégats, tandis que les méthodes bioinformatiques tentent d’éliminer les fragments et les doublets, qui induisent tous des biais ^5,6,7. La transcriptomique spatiale conserve l’architecture tissulaire, fournissant des informations essentielles sur l’organisation et les interactions cellulaires. La plupart des méthodes de séquençage spatial non ciblées n’ont pas de résolution à l’échelle d’une seule cellule, ce qui nécessite une déconvolution des zones de capture spatiale contenant de 10 à 100 cellules ^8,9,10. Cependant, au cours de la dernière décennie, la transcriptomique spatiale a dépassé les besoins pour ces méthodes, car il y a eu des progrès en matière de résolution, de plus grandes zones de capture et l’intégration d’approches multi-omiques, soit en utilisant une stratégie expérimentale, soit de nouvelles techniques ^1,11,12.

Le séquençage omique à résolution spatiale améliorée (Stereo-seq) offre une résolution à l’échelle nanométrique (500 nm) et une zone de capture à l’échelle centimétrique, avec une capture transcriptomique entière indépendante de l’espèce permettant la capture de l’ARN codant, non codant et non hôte¹³. Cette méthode est actuellement la résolution la plus élevée pour la transcriptomique spatiale et offre des options pour fournir les plus grands champs de vision. Cependant, cette méthode présente quelques limitations notables, notamment des exigences de temps et de main-d’œuvre d’environ 15 heures de temps de manipulation, s’étendant sur 4 jours pour terminer les bibliothèques prêtes à être séquencées. En comparaison, d’autres technologies de transcriptomique spatiale basée sur le séquençage, telles que la transcriptomique spatiale basée sur des sondes, la transcriptomique spatiale basée sur un réseau de capture polyA, le Slide-seq et le codage à barres déterministe dans les tissus pour le séquençage omique spatial (DBiT-seq) nécessitent généralement 5 à 8 h de temps pratique sur 2 à 3 jours (Tableau 1). Pour de nombreux chercheurs, ces avancées l’emportent sur les défis techniques et sont idéales pour construire des atlas spatiaux transcriptomiques complets afin d’étudier la progression de la maladie aux niveaux cellulaire et subcellulaire, en particulier s’ils sont superposés à d’autres technologies¹.

Le protocole Stereo-seq offre des possibilités au-delà de la transcriptomique traditionnelle de l’ARNm, qui repose sur des sondes poly-T pour capturer les transcrits d’ARNm polyadénylés. Ces méthodes peuvent être modifiées en ajoutant de la polyadénylation à des tissus frais¹⁴ ou des sondes spécifiques à l’espèce pour des ensembles de gènes cibles^{prédéfinis 15} pour l’analyse de l’expression spatiale. Au lieu de cela, Stereo-seq utilise des sondes nucléotidiques aléatoires pour sélectionner divers ARN indépendamment de l’espèce, y compris des ARN microbiens, des ARN fongiques, des ARN viraux et des ARN non polyadénylés tels que les ARN amplificateurs, les ARN circulaires et les ARN longs non codants (ARNlnc)¹⁶. Théoriquement, il est possible de capturer des ARN plus petits ou des éléments réparateurs tels que de petits ARN interférents (siRNA), des microARN (miARN) et des transposons¹⁷. Cependant, à l’heure actuelle, la bioinformatique et la cartographie de ces ARN restent difficiles et sont souvent filtrées lors de l’alignement initial, qui utilise généralement une coupure de 30 pb.

Voici un protocole détaillé, avec nos modifications pour la capture aléatoire de nucléotides sur des puces DNB (DNA nanoballs) d’un fabricant afin d’assurer une meilleure compréhension et une meilleure gestion d’un protocole Stereo-seq illustré à la figure 1. Ce protocole comprend des stratégies pour les biologistes moléculaires afin de tester de nouveaux tissus FFPE sur Stereo-seq avec capture nucléotidique aléatoire afin de produire des rendements plus cohérents et plus élevés à partir d’échantillons archivés de qualité inférieure et de tissus adipeux. Le protocole décrit est optimisé pour les échantillons FFPE de la plupart des organes, quelle que soit l’espèce d’origine. Cependant, ce protocole n’inclut pas les modifications actuelles nécessaires pour manipuler les tissus difficiles tels que la moelle osseuse, qui nécessitent une décalcification.

Protocol

Aucune donnée clinique n’est fournie dans cet article sur les méthodes pour l’échantillon de patiente atteinte de carcinome séreux de l’ovaire de haut grade naïf de traitement. Cependant, les données cliniques associées ont été recueillies conformément aux protocoles approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) du MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas, Département d’oncologie gynécologique et de médecine de la reproduction, auprès des participants qui ont fourni un consentement éclairé écrit.

REMARQUE : Il est recommandé de porter un masque chirurgical et des gants pendant toute la durée du protocole afin d’éviter la contamination par la RNase. Il est recommandé aux chercheurs aux cheveux longs de les tirer en arrière ou même de porter un filet à cheveux. Utilisez toujours de l’eau stérile sans nucléases (NFW) et des tubes d’ADN/ARN sans nucléases à faible liaison pour maximiser le rendement. Les tissus non mammifères, tels que les tissus végétaux, peuvent nécessiter une optimisation de l’adhérence, impliquant de la poly-L-lysine (PLL) et des temps de perméabilisation prolongés en raison des parois cellulaires. Bien que la capture moléculaire reste théoriquement réalisable, une validation expérimentale est nécessaire car les tissus végétaux ne sont pas testés dans notre flux de travail actuel.

1. Évaluer la qualité de l’ARN et la valeur de distribution des fragments d’ARN 200 scores

1. Évaluez la qualité de l’ARN à l’aide de la valeur de distribution des fragments d’ARN 200 (DV200), qui mesure le pourcentage d’ARN supérieur à 200 pb.
2. Utilisez deux sections de 10 μm du même bloc de tissu destinées au traitement Stereo-seq.
   REMARQUE : Le traitement immédiat est optimal, mais les échantillons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 1 semaine, à -20 °C pendant 4 semaines ou à -80 °C pendant 6 mois.
3. Extraire l’ARN à l’aide d’un protocole d’extraction sélective d’ARN non dimensionnel tel que décrit par Patel et ^al.18 pour permettre une évaluation précise de la distribution de la taille des fragments d’ARN.
4. Évaluez la qualité de l’ARN à l’aide de l’un des éléments suivants à l’aide d’un analyseur de fragments pour déterminer le score DV200, ou le pourcentage d’aire sous la courbe qui représente les fragments d’ARN de plus de 200 pb. Idéalement, les tissus devraient avoir un score DV200 (> 50 %) et une concentration (> 10 ng/μL).

2. Nettoyage de l’espace de travail

1. Nettoyez toutes les surfaces avec 30 % d’eau de Javel. Laissez sécher les surfaces pendant au moins 30 minutes pour éviter la formation de chloroforme due à la combinaison d’eau de Javel et d’éthanol.
2. Essuyez les surfaces avec des lingettes de décontamination de l’ADN (DDW). Vaporisez toutes les surfaces avec une solution de décontamination RNase (RDS), puis de l’éthanol à 70 % préparé avec NFW.
   REMARQUE : Ne mélangez jamais d’eau de Javel ou tout autre alcool. Cette combinaison a produit du chloroforme, qui est hautement toxique et peut causer une perte de conscience, des lésions organiques ou la mort, même à de faibles expositions.

3. Préparation de la puce de capture d’oligonucléotides aléatoires (N-chip) stéréo-seq

1. Nettoyez l’espace de travail comme décrit aux étapes 2.1 et 2.2, y compris tous les systèmes utilisés dans cette étape.
2. Retirez la puce N Stereo-seq de son emballage, enregistrez l’ID de la puce et nettoyez les bords de la puce N Stereo-seq et de la lame de verre avec de l’éthanol à 100 % sans toucher la puce. Laisser sécher complètement à l’air.
3. Application de résine pour fixer la puce à la glissière (facultatif pour les utilisateurs utilisant des xylènes).
   REMARQUE : Bien que les agents d’élimination sans xylène soient souvent recommandés par les vendeurs commerciaux, il a été observé que les agents d’élimination sans xylène peuvent être moins efficaces en fonction du mélange de paraffine. Ils ne sont souvent pas compatibles avec certains plastiques, résines synthétiques ou tissus incrustés de cire d’abeille, et n’éliminent pas efficacement les paraffines fortement réticulées ou à point de fusion élevé. En cas de doute sur la composition en paraffine utilisée pour l’enrobage de l’échantillon, il est recommandé d’utiliser des xylènes pour une clarification optimale. De plus, les xylènes sont mieux à même d’éliminer les tissus adipeux, tels que le sein, l’ovaire, l’ovule ou le tissu cérébral.
   1. Secouez ou mélangez bien la résine pour qu’elle soit uniformément blanche. À l’aide d’une micropipette, appliquez soigneusement 10 μL de résine céramique durcissable aux UV sur le bord de la puce N Stereo-seq (Figure 2A).
      REMARQUE : La résine peut provoquer une irritation de la peau et des yeux et peut entraîner des réactions allergiques cutanées en cas d’exposition répétée. Lors du pipetage ou de la manipulation de cette résine, portez toujours des gants en nitrile, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire. Travaillez dans un endroit bien ventilé et portez un masque lorsque vous utilisez de grands volumes ou une solution chauffante et évitez tout contact direct avec la peau ou les yeux.
   2. Utilisez un coton-tige en mousse scellé, retirez l’excès de résine, en ne laissant qu’une fine ligne autour du bord de la puce. Placez la glissière dans le dispositif de séchage UV, en veillant à ne pas toucher la surface de la puce.
   3. Placez la puce appliquée à la résine sur un masque opaque sur la source de lumière UV de 405 nm pour éclairer l’arrière de la lame et durcir pendant 5 min. Ceci est illustré à la figure 2B.
      REMARQUE : N’exposez pas trop la puce Stereo-seq N à la lumière UV et ne touchez pas la résine à la surface de la puce, car cela pourrait avoir des effets néfastes sur les nanobilles.
   4. Après durcissement, utilisez des cotons-tiges en mousse scellés imbibés de chacun des éléments suivants : éthanol 100 % de qualité moléculaire ; 70 % d’éthanol ; et enfin NFW pour nettoyer autour du bord où la résine a été placée. Si des taches blanches se détachent, nettoyez à nouveau le bord. Ne touchez jamais la surface de la puce (Figure 2C).
   5. Laissez la diapositive sécher complètement à l’air. Après inspection, conservez les copeaux pendant la nuit à 4 °C avec un déshydratant si nécessaire. Cependant, il est recommandé de poursuivre immédiatement la préparation et la section des copeaux lorsque cela est possible.
      REMARQUE : Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié, y compris des lunettes de protection UV, lorsque vous travaillez avec de la lumière UV. Manipulez l’éthanol et la résine dans un endroit bien ventilé, de préférence une hotte. Éliminer les déchets conformément aux directives de l’établissement.
4. Préparation de puces avec de la poly-L-lysine (Facultatif pour les tissus adipeux ou les tissus présentant des problèmes d’adhérence.)
   1. Nettoyez l’espace de travail comme décrit aux étapes 2.1 et 2.2, y compris tous les systèmes utilisés dans cette étape.
      REMARQUE : Ne vaporisez pas de produits chimiques directement dans la machine PCR. Pour toutes les étapes pré-PCR, travaillez dans une hotte PCR, si possible, pour éviter la contamination, y compris l’amplification antérieure de l’ADNc.
   2. Immergez la puce trois fois dans du NFW frais à l’aide d’un tube conique de 50 ml.
   3. Séchez les copeaux à l’aide d’air comprimé, en utilisant toute la force de l’air comprimé à un angle d’environ 60° à 80°, en diagonale (45°) sur la surface des copeaux à environ 5 cm de la surface des copeaux (Figure 2E). Si la surface semble trouble, répétez le lavage avec du NFW frais et séchez à nouveau (la surface nuageuse signifie généralement que la céramique n’a pas été suffisamment lavée ou durcie lors des étapes précédentes).
   4. Appliquez 150 μL de solution PLL pour couvrir toute la surface de la puce. Incuber 10 min à température ambiante (22 °C à 25 °C). Ceci est illustré à la figure 2D.
   5. Retirez la solution PLL et lavez la puce deux fois avec de l’eau sans nucléase pendant 10 à 15 s.
   6. Séchez soigneusement les bords de la glissière après le deuxième lavage (sans toucher l’éclat).
   7. Séchez fermement la copeau à l’aide d’air comprimé, en utilisant toute la force de l’air comprimé à un angle d’environ 60° à 45°, en diagonale sur la surface de la copeau à environ 5 cm de la surface de la copeau (Figure 2E).
      REMARQUE : La copeau doit être complètement sèche en 30 s ou moins. Si cela prend plus de temps, la DNB sera perturbée, ce qui provoquera des artefacts dans la capture.
   8. Procédez au montage dans un délai de 1 h et gardez les copeaux au sec.
      REMARQUE : Si la surface de la copeau semble trouble après le séchage, lavez-la avec du NFW frais et répétez le processus de séchage. S’il y a des artefacts à la surface de la puce après séchage, cela peut entraîner des problèmes de capture dans ces zones. Évitez d’utiliser la PLL pour adhérer si le tissu n’en a pas besoin. Toucher la puce peut provoquer des rayures et une perte de zones de capture avant la libération de l’ADNc, ou une capture inégale après la libération. La résine à la surface de l’éclat entraîne une perte mouchetée des zones de capture. Placer la puce trop près de la buse d’air comprimé peut créer des cristaux et une pulvérisation de marques DBN endommagées sur la surface de la puce ; Cependant, cela est rare et ne se produit généralement que si la buse touche presque la puce et que la bouteille d’air comprimé est trop froide. Il est recommandé de pratiquer cette procédure plusieurs fois avec des puces d’évaluation, car cette étape est techniquement difficile.

4. Section et montage des tissus

1. Assurez-vous que l’espace de travail est propre comme décrit aux étapes 2.1 et 2.2. Assurez-vous que de nouvelles lames et NFW sont utilisées pour tous les bains d’eau et la glace pendant la section et le montage des tissus. Ne touchez pas directement la puce et ne couvrez que 80 % de la puce avec du tissu.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une épaisseur de 5 μm pour les tissus standard ou de 4 μm pour les tissus riches en graisse. Utilisez un ruban de sections en série pour faire correspondre les modalités entre les échantillons, le cas échéant.
2. Sécher les lames à 42 °C pendant 3 h soit dans un four, soit sur une machine PCR avec le couvercle ouvert. Transférez ensuite les lames ou changez la température sur le four ou la machine PCR à 37 °C et faites cuire toute la nuit pendant 12 à 48 h. Il est recommandé de l’utiliser environ 18 h.
3. Point d’arrêt facultatif : Après séchage, scellez les lames dans des sacs en aluminium avec un dessiccant à 4 °C jusqu’à 1 semaine avant de continuer.
   REMARQUE : Des temps de séchage plus longs peuvent réduire l’intégrité de l’ARN. Un séchage trop court entraînera une faible adhérence des tissus à la lame. La cuisson à une température plus élevée peut réduire l’intégrité de l’ARN. Les lames peuvent être expédiées pour un traitement externe (par exemple, l’analyse de l’hôte). Cependant, l’expédition n’est pas recommandée pour l’analyse du microbiome en raison de l’augmentation de la contamination potentielle pendant le transport.

5. Déparaffiniser les lames

1. Assurez-vous que l’espace de travail est propre comme décrit aux étapes 2.1 et 2.2.
2. Préparez les réactifs pour la déparaffinisation et le protocole Stereo-seq.
   1. Aliquote des réactifs requis : Deux 30 mL de xylènes dans des tubes coniques de 50 mL, deux 30 mL d’éthanol à 100 % dans des tubes coniques de 50 mL.
   2. Préparez les réactifs dilués suivants avec de l’ENF : 96 % d’éthanol par puce (2 coniques ou 1 mL requis), 90 % d’éthanol par puce, 80 % d’éthanol par puce, 70 % d’éthanol par puce, 50 % d’éthanol par puce, 30 % d’éthanol par puce, 2,5 mL de citrate salin-sodium (SSC) 5x à partir d’une solution 20x, 5 mL de HCl 0,01N (diluer 0,1N HCl avec NFW à pH 2). Pour les dilutions à l’éthanol, préparer une solution de 30 mL dans des tubes coniques de 50 mL ou une solution de 500 μL dans un tube de 1,5 mL si vous utilisez des joints en silicone.
   3. Préparez les solutions suivantes et conservez-les sur de la glace : i) 32,5 mL de SSC 0,1x à partir d’une solution 5x (conservez 30 mL de solution dans un tube conique et mettez les 2,5 mL restants dans un tube de 5 mL pour une utilisation future), ii) 400 μL de SSC 0,1x avec 5 % d’AR, conservez sur de la glace.
   4. Préparez les réactifs dilués suivants avec du HCl 0,1 N.
      1. Préparez une solution de réactif de perméabilisation (PR) 10x en ajoutant 1 mL de HCl 0,1 N au réactif lyophilisé fourni dans le commerce.
         REMARQUE : Ne conservez sur la glace que pendant 1 h, assurez-vous de l’aliquote pour une utilisation future et congelez à -20 °C.
      2. Préparer 500 μL de solution 1x PR (diluer une aliquote de solution 10x PR avec 0,01 N HCl, conserver sur glace jusqu’à 6 h).
         REMARQUE : Il est essentiel que le pH du HCl 0,01 N se situe à moins de 10 % du pH 2,0, car les enzymes à base de pepsine fonctionnent de manière optimale à un pH de 2.
3. Déparaffinisez les lames en les trempant dans des xylènes (recommandé) pendant 2 cycles de 20 minutes chacun.
4. Réhydratez immédiatement l’échantillon avec de l’éthanol (100 %, 96 %, pendant 2 cycles de 5 minutes chacun, suivis de 90 %, 70 %, 50 % et 30 % pendant 1 cycle de 2 minutes). Enfin, réhydratez-vous avec NFW pendant 1 min. Pour les dilutions à l’éthanol, utilisez 30 ml de solution dans un tube conique de 50 ml pour chaque lame si vous préparez des échantillons pour des études du microbiome, ou utilisez 30 ml pour deux lames si vous préparez des échantillons non liés au microbiome. Pour toutes les dilutions subséquentes, préparer 30 mL de solution dans un tube conique de 50 mL ou, si vous utilisez des joints en silicone, utiliser 500 μL de solution par copeau de 1 cm² pour couvrir complètement la surface du jet.
   FACULTATIF : Il est suggéré de placer une chambre en silicone à partir d’une glissière de retrait à 3 chambres autour de la puce pour créer un joint après l’étape 100 % éthanol, comme illustré sur la figure 2F-H. Cela permet d’utiliser de plus petits volumes de réactifs et réduit le risque d’endommager la puce. Alternativement, des tubes coniques de 50 ml peuvent être utilisés pour immerger complètement le Stereo-seq Slide tout au long de la procédure.

6. (Facultatif) Imagerie nucléaire et coloration de l’ADNsb

REMARQUE : Laissez le réactif de décrosslinking FFPE atteindre la température ambiante (~ 25 °C) avant de l’utiliser en 6.1. D’autres solutions de coloration sont possibles, mais la coloration nucléaire par fluorescence est actuellement nécessaire pour la segmentation unicellulaire et le regroupement cellulaire des données transcriptomiques.

1. Coloration par fluorescence à l’aide d’un colorant d’ADN simple brin (ADNsb)
   1. Préparez 2 μL de solution de coloration de l’ADNss dans un tampon SSC en diluant le réactif Qubit ssDNA avec 5 tampons SSC à une dilution de 1:1 par 1 à 2 puces.
      REMARQUE : La dilution de l’ADNss peut changer en fonction du microscope utilisé lors de l’imagerie.  Par conséquent, les nouveaux microscopes doivent être testés avec un ensemble de dilutions de colorant ssDNA à l’aide d’une puce d’évaluation et d’un tissu de test pour déterminer la meilleure plage dynamique.
   2. Créez un mélange maître de la solution de coloration (200 μL par puce) en utilisant une dilution de 1:20 de l’inhibiteur de la RNase (RI), une dilution de 1:200 de la dilution de l’ADNsb et les 5x SSC restants.
   3. Ajouter la solution colorante (150 μL par éclat) et incuber dans l’obscurité pendant 5 min à température ambiante. Retirez délicatement la solution de coloration du coin de la puce à l’aide d’une pipette.
      REMARQUE : Si vous utilisez la chambre en silicone amovible, retirez-la avant de colorer la puce avec le mélange de colorant ssDNA.
   4. Lavez la puce deux fois avec 0,1x SSC (150 μL par puce à chaque fois) pendant 10 à 15 s. Séchez soigneusement les bords de la diapositive avec du papier pour lentille après le deuxième lavage (sans toucher la puce).
   5. Ajouter ~3-5 μL de glycérol (utiliser moins pour un microscope inversé) pour monter le trèfle (attention aux bulles).
      REMARQUE : Assurez-vous que le volume correct de glycérol est appliqué sur la zone de la lame, généralement environ 4 μL pour une puce de 1 cm². L’utilisation d’une trop grande quantité de glycérol peut provoquer le déplacement de la lamelle lorsque la lame est tenue verticalement. L’utilisation d’une quantité insuffisante de glycérol augmente le risque de lésions tissulaires lorsque la lamelle est retirée et peut introduire des bulles, ce qui peut affecter négativement les résultats de l’imagerie et de la segmentation unicellulaire.
   6. Déposez la lamelle d’environ 1 cm de hauteur sur la puce. Si vous utilisez un microscope interactif, assurez-vous que la lamelle ne glisse pas lorsqu’elle est tenue verticalement. Si c’est le cas, il se remonte sans ajouter plus de glycérol.
   7. Capturez des images fluorescentes de tissus colorés à l’ADNsb à l’aide d’un microscope à grand champ avec un chevauchement de 10 % entre les tuiles d’image.
      REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer une carte de mise au point manuelle de 9 à 13 points avec un microscope à grand champ à l’aide d’un objectif 10x. Un microscope confocal peut être utilisé, mais il est beaucoup plus sensible aux changements focaux à travers le tissu et la puce.
   8. Assemblez dans un logiciel de traitement d’image tel qu’ImageJ, en utilisant le chevauchement théorique pour générer le positionnement approximatif de chaque tuile, puis effectuez un chevauchement informatique de correspondance de pixels pour affiner la mosaïque d’image.
   9. Traitez les images dans le logiciel StereoMap et assurez-vous que le contrôle qualité des images est réussi avant de continuer.
   10. Immergez la lame Stereo-seq dans 30 ml de SSC 0,1x jusqu’à ce que la lamelle se détache.

7. Processus de décroisement

REMARQUE : Évitez de toucher ou d’incliner la puce pendant cette étape et pipetez doucement.

1. Assurez-vous que le réactif de décrosslinking FFPE est à température ambiante chaude (~25 °C) et inspectez-le pour vous assurer qu’il n’y a pas de particules qui rendent la solution trouble. Si des particules sont visibles, chauffer à 55 °C et refroidir à 30 °C avant utilisation.
2. Allumez le thermocycleur avec les réglages suivants : 30 °C pour l’équilibre (un couvercle chauffant de 85 °C) ; 95 °C pour une incubation de 30 min ; Temps de maintien infini de 4 °C.
3. Assemblez le joint de la cassette, puis placez la glissière de la puce Stereo-seq dans la cassette.
4. Ajouter le réactif de décrosslinking FFPE (400 μL par puce) dans le puits de la cassette contenant la puce. Appliquez du ruban adhésif sur la cassette et vérifiez qu’elle est bien scellée.
5. Commencer l’incubation de 30 minutes à 95 °C à partir de l’étape 7.2. Une fois que 10 minutes se sont écoulées, placez 10 ml de méthanol dans un récipient de 15 ml (environ 1 ml par lame sera nécessaire) dans un congélateur à -20 °C.
6. Retirez délicatement la puce du thermocycleur, transférez la cassette sur le banc et décollez le ruban d’étanchéité.
7. Retirez et jetez le réactif de décrosslinking FFPE à l’aide d’une pipette. Une fois que tous les réactifs de décrosslinking ont été retirés, détachez et jetez la cassette et le joint.
8. Équilibrez la diapositive Stereo-seq à température ambiante ~23 °C. Sous une hotte stérile, séchez le bord de la lame et appliquez une nouvelle chambre en silicone (le cas échéant). Ajoutez 500 μL de méthanol réfrigéré du congélateur à -20 °C, en vous assurant que toute la section est complètement immergée pendant 20 min.
   REMARQUE : Alternativement, l’ensemble de la diapositive Stereo-seq peut être immergé dans un tube conique de 50 ml rempli de 30 ml de méthanol réfrigéré.
9. Préchauffer la solution 1x PR sur un bloc sec à 37 °C pendant 10 min avant utilisation environ 5 min avant la fin de la fixation au méthanol (étape 7.8).
10. Une fois la fixation terminée, déplacez la lame dans une hotte stérile. Essuyez tout excès de méthanol sur la lame et attendez l’évaporation du méthanol restant sur la puce (~5 min). Assemblez une nouvelle cassette et un nouveau joint. Une fois que le méthanol s’est complètement évaporé, placez la glissière de la puce Stereo-seq dans la cassette.

8. Perméabilisation et transcription inverse

REMARQUE : Pour les étapes 8.1-8.11, pipetez lentement et ne touchez pas la puce. Une pression excessive provoquera une diffusion ou des marques dans les DNB.

1. Ajouter 200 μL de réactif de perméabilisation dans la puce. Appliquez du ruban adhésif sur la cassette de diapositives Stereo-seq et assurez-vous qu’elle est bien scellée.
2. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
3. Préparez le tampon de lavage en ajoutant 380 μL de SSC 0,1x et 20 μL d’ARN (inhibiteur d’ARN) pour chaque lame. Préparez 400 μL par lame et conservez sur de la glace jusqu’à utilisation.
4. Retirez les réactifs pour la transcription inverse FFPE (FFPE RT), puis faites tourner tous les éléments suivants et maintenez le mélange d’enzymes, les oligos et les dimères sur de la glace. Réchauffez le tampon FFPE RT à température ambiante (~23 °C).
5. 5 min avant min avant la fin de la perméabilisation, préparer 200 μL par puce de mélange FFPE RT. Ajouter le tampon FFPE RT (158 μL), LE MÉLANGE D’ENZYMES FFPE RT (30 μL), l’oligo FFPE RT (10 μL) et le dimère FFPE (2 μL). Mélangez-le doucement et gardez-le sur de la glace.
6. En gardant la puce sur le thermocycleur, changez la température d’incubation à température ambiante (~23 °C). Retirez le sceau et jetez délicatement la solution 1x PR.
7. Lavez la puce très délicatement avec 200 μL de SSC 0,1x (avec 5 % RI) par puce de 1 cm² .
8. Retirez le lavage SSC 0,1x (avec 5 % RI) du coin de la puce.
9. Ajouter 200 μL de solution FFPE RT dans le coin de la puce.
10. Appliquez du ruban adhésif sur la cassette de diapositives Stereo-seq et assurez-vous qu’elle est bien scellée ; sinon, l’évaporation réduit le rendement.
11. Démarrer le protocole FFPE RT incubation réaction isotherme à 42 °C avec couvercle chauffant à 45 °C pendant (5 à 24 h).
    REMARQUE : Il est recommandé d’incuber pendant 12 à 16 h et d’être cohérent entre les expériences.

9. Libération et purification de l’ADNc

REMARQUE : Pour les étapes 9.6-9.7, pipetez lentement et ne touchez pas la puce. Une pression excessive provoquera une diffusion ou des marques dans les DNB.

1. Préparez 400 μL de tampon de libération d’ADNc en réchauffant le tampon de libération d’ADNc à 55 °C pour dissoudre tout précipité qui pourrait s’être formé.
2. Équilibrez le tampon de libération d’ADNc à une température ambiante chaude (25 °C). Ne mettez pas de glace.
3. Faites tourner le tampon de libération d’ADNc et l’enzyme de libération d’ADNc à 100 x g dans une centrifugeuse de table avant utilisation.
4. Préparez le tampon d’ADNc en ajoutant 20 μL d’enzyme de libération à 380 μL de tampon de libération d’ADNc.
5. En gardant la puce sur le thermocycleur, changez la température d’incubation à température ambiante (~23 °C). Retirez le sceau et retirez et jetez délicatement la solution FFPE RT.
6. Lavez la puce une fois, incroyablement doucement, avec 0,1x SSC par puce (200 μL).
7. Retirez le SSC 0,1x du coin de la puce, en pipetant très prudemment.
8. Ajouter 400 μL de la solution de libération d’ADNc préparée dans chaque puce.
9. Scellez la cassette de diapositives Stereo-seqs en appliquant du ruban adhésif (ou un couvercle PCR) sur la cassette. Assurez-vous que la cassette est hermétiquement scellée pour éviter toute évaporation, fuite ou contamination.
10. Incuber à 55 °C pendant ≥ 5 h (minimum 5 h jusqu’à 24 h) avec le couvercle chauffé à 60 °C.
    REMARQUE : Il est recommandé d’incuber pendant 5 à 7 h ou d’être cohérent entre les expériences avec 2 h.

10. Collectez le mélange de libération d’ADNc

1. Préchauffer NFW à 37 °C (au moins 500 μL par copeau de 1^cm2).
2. Retirez le sceau et pipetez vigoureusement dans chaque coin et centre de la puce sur le tissu, mais ne grattez pas et ne touchez pas le tissu. Rassemblez tout le mélange de libération d’ADNc de la puce et transférez-le dans un tube à centrifuger de 1,5 ou 2,0 ml. Enregistrez les numéros d’identification de la puce (ID de la puce) sur chaque tube.
3. Ajoutez 350 μL de NFW préchauffé directement sur la surface de la puce. Et encore une fois, pipetez vigoureusement avec une pipette plus petite (P100 ou P200), en inclinant la pointe pour appliquer plus de force de cisaillement, mais ne touchez pas le tissu et ne jetez pas la puce.
4. Combinez le lavage de l’étape 10.3 (350 μL) avec le mélange de libération d’ADNc de l’étape 10.2 (400 μL). Assurez-vous de ne combiner que les échantillons d’une seule puce.
5. Placez 100 μL de NFW sur la puce, scellez la glissière de la puce Stereo-seq dans la cassette et conservez-la au réfrigérateur jusqu’à la fin du protocole.
   REMARQUE : En cas de faible rendement, envisagez de relibérer l’ADNc. La présence d’ADN sur la puce peut être évaluée à l’aide d’un colorant d’ADNsb et d’une réimagerie avec ou sans lamelle.

11. Récupérez les billes d’ADNc et nettoyez-les

1. Remettez en suspension l’ADNc à partir de l’étape 10.4 avec un volume égal de billes d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI). Mélangez jusqu’à ce que les billes soient uniformément réparties dans la solution pour sélectionner des fragments d’ADN de plus de ~100 pb.
2. Incuber pendant 10 min à une température de 27 °C à 37 °C (30 °C recommandés).
   1. Pendant l’incubation. Préparez 5 ml d’éthanol frais à 80 % dans de l’eau non alcoolisée pour chaque tranche de 2 copeaux traités.
3. Prenez les tubes avec le mélange de billes incubées et faites-les tourner brièvement à 100 x g sur une centrifugeuse de table.
4. Placez les tubes sur une grille de séparation magnétique et incubez pendant au moins 5 minutes (jusqu’à ce que le liquide devienne clair).
5. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger les billes et conservez-le dans un tube propre et étiqueté. Étiquetez la libération de l’ADNc avec l’ID de la puce et la date.
6. Ajouter 1,5 mL d’éthanol à 80 % dans les tubes sans déranger les billes et incuber pendant 30 s avant de retirer l’éthanol.
7. Répétez l’étape 11.6 une fois de plus, cette fois en enlevant autant d’éthanol que possible à l’aide d’une petite pointe de pipette sans déranger les billes.
8. Faites sécher à l’air libre les billes dans les tubes jusqu’à ce qu’elles ne soient plus réfléchissantes. Le temps varie, alors vérifiez régulièrement pour éviter un séchage excessif (fissures), ce qui entraînera un faible rendement.
   REMARQUE : Mesurez l’humidité et la température de la pièce. À des températures élevées (27 °C) et à une faible humidité (moins de 20 %), les billes sèchent très rapidement (3 à 5 min). À basse température (23 °C), et à une humidité élevée (plus de 40 %), les billes sèchent beaucoup plus lentement (7 à 15 min).
9. Retirez les tubes à billes du support magnétique, ajoutez 22 μL de NFW et mélangez par vortex.
10. Incuber dans un bain sec ou une machine PCR à 27 °C pendant 5 à 15 min.
11. Centrifugez brièvement et replacez le tube sur le support de séparation magnétique jusqu’à ce que le liquide devienne clair (2 à 5 min).
12. Transférez 21 μL de surnageant contenant de l’ADNc dans le tube PCR de 0,2 mL marqué par l’échantillon sans perturber les billes.
13. Répétez les étapes 11.9 à 11.12 pour chaque tube, en recueillant un total de 42 μL d’ADNc. Poursuivez directement avec l’amplification de l’ADNc (étapes 12.1 à 12.8).
    REMARQUE : Un retard dans le démarrage de l’amplification entraînera une diminution du rendement, une augmentation des lectures courtes et une dégradation de la matrice d’ADN simple brin.

12. Amplification de l’ADNc

1. Retirez le mélange d’amplification de l’ADNc et les amorces d’ADNc FFPE du congélateur et placez-les sur de la glace humide pour les décongeler.
2. Faites tourner le mélange d’amplification de l’ADNc et les amorces d’ADNc FFPE sur une centrifugeuse de table à ~100 x g.
3. Ajoutez 50 μL de solution d’amplification de l’ADNc et 8 μL d’amorces d’ADNc FFPE dans chaque tube d’ADNc à partir de 42 μL à partir de (étape 11.13) et placez-le dans un thermocycleur avec l’adaptateur à capuchon plat pour éviter la déformation du tube.
4. Exécutez le programme du thermocycleur pour l’amplification de l’ADNc : dénaturation initiale : 95 °C pendant 5 min ; cyclage : [98 °C pendant 20 s, 58 °C pendant 20 s, 72 °C pendant 3 min] × 15 cycles ; extension finale : 72 °C pendant 5 min ; température de maintien : 12 °C (en cas de traitement immédiat) / 4 °C (en cas de traitement pendant la nuit).
5. Mesurez la concentration d’ADN de 1 μL d’ADNc avant et après le nettoyage des billes.
   REMARQUE : La quantité de produit d’ADNc avant le nettoyage doit être calculée pour dépasser 1 μg pour chaque puce de 1 cm². La concentration après le nettoyage doit être d’au moins 10 ng/μL. Des rendements plus faibles sont généralement associés à une diversité réduite des banques. Une perte d’échantillon significative à ce stade est corrélée avec les scores DV200 ; cependant, le DV200 n’est pas un prédicteur parfait des résultats.
6. Répétez le nettoyage des billes d’ADNc à partir des étapes 11 (nettoyage des billes) en utilisant le produit PCR de l’étape 12.4, avec trois modifications : utilisez un support magnétique PCR plus petit, ajoutez seulement 200 μL d’éthanol à 80 % à l’étape 11.6 et remettez en suspension dans 22 μL de tampon Tris-EDTA (TE) (pH 8) à l’étape 11.9.
7. Conservez les billes dans un tube contenant 20 μL de NFW, étiqueté avec le nom des échantillons, le code-barres, la date et l’ID de la puce.
8. Mesurez la distribution des fragments d’ADNc à l’aide d’un analyseur de fragments. La taille des fragments doit être comprise entre 250 et 400 pb. Si les fragments sont trop petits, répétez le nettoyage des billes, mais utilisez la température ambiante (~25 °C) au lieu de 27 °C.
   POINT D’ARRÊT FACULTATIF : Après avoir mesuré l’ADNc, il peut être stocké à -20 °C jusqu’à 1 mois et à -80 °C jusqu’à 1 an. Les billes peuvent être conservées dans NFW pendant 1 semaine à 4 °C. Ne congelez pas les billes.

13. Préparation de la bibliothèque (Jour 4)

1. Préparation du mélange de réaction d’amplification
   1. Supprimez la solution d’amplification PCR de bibliothèque, les ensembles de codes-barres de bibliothèque, le produit d’ADNc et NFW. Décongelez l’ADNc et les réactifs sur de la glace et de l’eau à température ambiante et faites tourner à 100 x g pendant 10 s.
2. Déterminez la stratégie de code-barres de la bibliothèque pour chaque 25 μL de mélange d’amorces de codes-barres PCR.
   REMARQUE : Pour ce séquenceur, toutes les bases doivent être représentées de manière égale à chaque position d’un jeu de codes-barres. La plupart des kits commerciaux compatibles avec cela sont donc conçus avec des tétrades de code-barres prédéfinies (par lot de quatre). Ces tétrades peuvent être appliquées à des échantillons individuels lors de la répartition sur une voie de séquençage, ou elles peuvent être regroupées pour un seul échantillon lors du séquençage d’un échantillon par voie. Il est impératif de maintenir des codes-barres équilibrés, car les codes-barres déséquilibrés réduiront la quantité de données utilisables générées par le séquenceur.
3. Déterminez le volume d’ADNc pour 20 ng (par exemple, 10 ng/μL nécessiteraient 2 μL). À l’aide de ce produit, préparez une solution NFW (25 μL) d’ADNc dilué (diluée à ~1 ng/μL).
4. Combinez un mélange d’amplification de banque (50 μL) avec de l’ADNc dilué dans NFW (25 μL) et un mélange d’amorces de code-barres PCR (25 μL) dans le tube PCR de 0,2 mL.
5. Mélanger le puits par pipetage et faire tourner à 100 x g pendant 10 s. (Ne pas vortex)
6. Placez les tubes PCR de 0,2 ml dans le thermocycleur et assurez-vous d’avoir un insert pour éviter que les tubes ne soient écrasés.
7. Exécutez le programme du thermocycleur pour l’amplification de l’ADNc : dénaturation initiale : 95 °C pendant 5 min ; cycle : [98 °C pendant 20 s, 58 °C pendant 20 s, 72 °C pendant 3 min] × 8 cycles ; extension finale : 72 °C pendant 5 min ; température de maintien : 12 °C (en cas de traitement immédiat) / 4 °C en cas de traitement toute la nuit.
   REMARQUE : Il est possible d’utiliser des quantités variables d’ADNc d’entrée pour préparer la bibliothèque. Cependant, la quantité utilisée affectera le nombre de cycles de PCR nécessaires à l’amplification. Par exemple, le fournisseur recommande 20 ng d’ADN d’entrée et l’utilisation de 8 cycles. Il est également possible d’utiliser 40 ng avec 7 cycles ou 80 ng avec 6 cycles. Il n’est pas recommandé d’utiliser moins de 20 ng ou plus de 80 ng d’ADNc d’entrée.

14. Nettoyage du cordon d’amplification de la bibliothèque

1. Quantifiez le produit de bibliothèque brute comme indiqué à l’étape 12.5.
2. Répétez le nettoyage des billes à partir de l’étape 11 (nettoyage des billes) en utilisant le produit de la bibliothèque brute de l’étape 13.7 avec trois modifications : utilisez un rapport bille / produit de 0,8:1, utilisez un support magnétique PCR plus petit, utilisez seulement 200 μL d’éthanol à 80 % par rapport à l’étape 11.7 et remettez en suspension dans 22 μL de tampon TE (pH 8) à l’étape 11.9. Préparez environ 1 ml d’éthanol frais frais à 80 % par deux chips de 1 cm² .
3. POINT D’ARRÊT EN OPTION : Après avoir mesuré la bibliothèque, elle peut être stockée à -20 °C jusqu’à 1 mois et à -80 °C jusqu’à 1 an. Les billes peuvent être conservées à NFW pendant 1 semaine à 4 °C. Ne congelez pas les billes.

15. Système DNBSEQ-T7RS pour le séquençage de DNB amorcés par oligonucléotides aléatoires Stereo-Seq

1. À l’aide d’un kit PE75 sur le système DNBSEQ-T7RS, répartissez les cycles comme 25 pour la lecture 1 et 62 pour la lecture 2 (PE25+62), suivis d’un indice de 10 pb :
   1. La première lecture (lecture 1 sur 25 cycles) capture l’ID de puce (CID) spatial ou des informations spécifiques à l’emplacement à partir des codes-barres basés sur la puce.
   2. La deuxième lecture (lecture 2 sur 62 cycles) capture l’identificateur moléculaire (MID), une séquence aléatoire de 6 pb, directement attachée aux inserts de gènes avec 3 cycles d’obscurité supplémentaires utilisés pour la correction de phase et l’étalonnage du décalage du code-barres. Ceci est suivi d’un insert de gène de 30-59 pb à partir de la lecture 2, qui est identifié par cartographie avec des génomes ou des transcriptomes connus.
      REMARQUE : Des insertions de gènes plus longues sont possibles, mais nécessiteraient différents kits d’extrémités appariées et une modification du flux de travail de cartographie.
   3. Le cycle d’index pour le démultiplexage couvre 10 pb sur la base des codes-barres de séquençage regroupés à l’étape 13.2.
      REMARQUE : Temps de séquençage typique d’environ 10-12 h pour une cellule d’écoulement de 75 EH. Le séquençage est le plus souvent effectué dans une carotte de séquençage ou une installation commerciale, et non un processus interne pour la plupart des laboratoires, car il nécessite un DNBSEQ-T7RS ou un instrument de séquençage similaire.

Results

Les données ci-dessous démontrent la capacité d’effectuer une segmentation unicellulaire à l’aide du pipeline SAW et de la cartographie avec des ARN adénylés non poly tels que l’ARNt (TRDMT1) à partir d’une section FFPE. Les données impartiales de Stereo-seq permettent d’examiner l’importance non seulement des ARNm, mais aussi des ARNt, des ARNr et des ARN non hôtes (le cas échéant). En utilisant la sortie directe du pipeline SAW¹⁶...

Discussion

Le protocole Stereo-seq est très détaillé et implique plusieurs étapes critiques qui nécessitent de la précision, un timing et un environnement propre pour garantir le succès, en particulier avec le profilage du microbiome ou de l’hôte qui peut nécessiter des précautions spécifiques.

L’utilisation d’eau exempte de nucléases pendant toutes les étapes est requise, et la puce de capture ne doit pas être touchée avec autre chose que l’échantillon et les réactifs. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes centrifugeuses de 1,5 mL DNAse/ARNase classique	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	3456	Pour mélanger des réactifs (d’autres bandes sont correctes) et nbsp ;
100 % éthanol	Sigma-Aldrich	E7023	Qualité moléculaire
Tubes centrifugeuses coniques stériles en polypropylène de 15 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339650	Utilisé pour les aliquotes   ;
20x Concentré  ; Tampon de citrate de sodium salé (SSC)	Sigma-Aldrich	S6639-1L	J’ai utilisé pour fabriquer 5 fois le SSC pour la teinture et 1 X SSC pour les étapes de lavage et le retrait du couvre-slip.
Instrument bioanalyseur 2100	Agilent	Discountinued	Instrument : Bioanalyseur
Chambre à 3 puits, amovible	Ibidi	80381	Chambre en silicone pour réduire les volumes lors de la réhydratation et de la fixation du méthanol.
Source lumineuse UV de 405 nm	Divers	N/A	Pour le durcissement de la résine UV
Tubes centrifugeuses stériles en polypropylène conique de 50 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339652	Utilisé pour les aliquotes et pour la déparaffinisation   ;
Alcool isopropanol stérile à 70 %	Texwipe & nbsp ;	TX3270	Pour la décontamination de surface   ;
Kit d’ADN à haute sensibilité Agilent	Agilent	5067-4626	Pour la caractérisation par bioanalyseur de l’ADN et des bibliothèques
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513	Pour la caractérisation de l’ARN par bioanalyseur
Feuille d’aluminium	Divers	N/A	Pour couvrir la lame pendant la coloration de l’ADNs.
Beckman Coulter SPRIselect	Beckman Coulter Life Sciences & nbsp ;	B23317/B23318/B23319	Nettoyage de perles SPRI cDNA et bibliothèque
Javel	Divers	N/A	Nettoyage de la station de travail pour éliminer la contamination du microbiome
Couvillons en mousse scellés CONSTIX	Contec	19161023	Pour un nettoyage précis à la résine
Couverture	Sigma-Aldrich	BR470045-2000EA
Packs dessiccants	Divers	N/A	Des compresses de dessiccant sans RNase et sans poussière.
Masque facial jetable	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	12-888-001	Protection, contamination par ARNase et stérilité   ;
Lingettes d’effacement de l’ADN	Sigma-Aldrich	L9060-250EA	Décontamination par essuyage des surfaces (lingettes humides)
Tubes de liaison ADN 1,5 mL	Eppendorf  ;	22431021	Utilisé pour la collecte d’ADNc et les amplifications post-bibliothèque.
Tubes de liaison ADN 2 mL	Eppendorf  ;	22431048	Utilisé pour la collecte d’ADNc avant l’amplification.
DNBSEQ OneStep Kit de réactifs DNB Make	Génomique complète	940-001891-00	Réactifs pour la préparation et l’amplification de nanobilles d’ADN (DNB)
Kit de réactifs de nettoyage DNBSEQ-T7RS	Génomique complète	940-001903-00	Cartouche pour lavage après séquençage terminé
Kit de réactifs de charge DNBSEQ-T7RS DNB	Génomique complète	940-001894-00	Réactifs et plaques pour charger les DNB vers la cellule à flux
Pile de flux de séquençage DNBSEQ-T7RS	Génomique complète	940-001902-00	1 voie/cellule de flux
Kit de visualisation stéréo-séquent DNBSEQ-T7RS	Génomique complète	940-001893-00	La cartouche et les réactifs pour le séquençage.
Système DNBSEQ-T7RS	Génomique complète		Cet ensemble de visualisation stéréo-séquence utilise la technologie DNBSEQ. Une série de séquençage commence par l’hybridation d’une ancre d’ADN, puis une sonde fluorescente est fixée à la nanoball d’ADN (DNB) en utilisant la chimie du séquençage combinatoire de l’ancre de sonde (cPAS). Enfin, le système d’imagerie haute résolution capte le signal fluorescent. Après le traitement numérique du signal optique, le séquenceur génère des informations de séquençage de haute qualité et précises.
Air comprimé à dépoussière	Matin	M-6318	Il est important d’utiliser cette marque ou une avec un propergol similaire   ;
Lames microtomes Edge-Rite	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	4280L	Histologie - Utilisée lors du découpage des échantillons
Congélateur pare-explosion	Divers	N/A	Pour refroidir le méthanol avant et pendant l’étape de fixation du méthanol.
Pinceaux d’histologie	Divers	N/A	Histologie - Utilisée lors du découpage des échantillons
Acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	2104-50ML	Pour diluer l’enzyme de prémuliablisation dans 0,01 N HCl (pH 2). La concentration standard en stock pour la solution de HCl est de 0,1 N.
Système d’imagerie	divers	N/A	GC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Solution de décontamination RNaseZap Invitrogen RNase	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9780	Nettoyage de la station de travail pour éliminer la contamination par ARNase
Essuie-glaces délicats Kimtech   ;	Kimtech	34155	Sécher les établis, le matériel, les pipettes, etc.
Blouse de laboratoire	Divers	N/A	Équipement de protection individuelle (EPI)
Papier pour objectifs	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	11-997	Divers travaux pour sécher des lames sans scaping
Lingettes d’effacement ADN Lookout	Sigma-Aldrich	L9060	Nettoyage de la station de travail pour éliminer la contamination par PCR
Rack de séparation Magentic 5uL - 0,2  ;	Permagen Labware	MSRLV08	Pour la séparation des billes dans des tubes PCR
Rack Magjet 12x1,5 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	MR02	Pour la séparation des billes dans des tubes de 1,5 mL
Microtome rotatif manuel	Leica	RM2235	Histologie - Utilisée lors du découpage des échantillons
Methonal &ge ; 99,9 %, adapté à l’immunofluorescence, HPLC	Sigma-Aldrich	34860	Pour la fixation (doit être de qualité HPLC)
Pinces micro-disséquantes	Sigma-Aldrich	F4142-1EA	Histologie - Utilisée lors du découpage des échantillons
Micropipette	Divers	N/A
Eau de qualité moléculaire sans nucléase non traitée à la DPEC	Divers	N/A	Dilutions et élution des perles
Gants en nitrile	Divers	N/A	PPE
Four	Divers	N/A	Pour cuire les chips
Tubes PCR 0,2 mL avec condensateurs attachés	Divers	N/A	Pour les applications PCR
Couvertures PCR   ;	Divers	N/A	Remplacement si l’adhésif sur la housse fournie est faible
Hotte PCR & Hotte Poste de travail	Mystaire	MY-PCR24-010	Pour les étapes pré-PCR (ARN vers ADNc)
Mesure de pH	Divers	N/A	Un pH-mètre pour confirmer le pH HCl.
Solution de poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	A005-C	Optionnel pour augmenter l’adhérence des tissus à l’éclat
Fluoromètre Qubit 4	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q33226	Stérilisation ; Mesure des quantités d’ADN
Kits de quantification de l’ADN dsDNA Qubit	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q32851	Pour la mesure de l’ADNc et des quantifications de bibliothèques
Kit d’analyse d’ADN ssDNA pour qubits	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q10212	Coloration ssDNA (Seul colorant utilisé)
Bloc de glace sans ARN	Divers	N/A	Histologie - Utilisée lors de la coupe des échantillons pour hydrater les blocs avant le coupage
Solution de décontamination RNaseZap RNase	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9782	Une solution de décontamination de surface qui détruit les ARN
RNeasy FFPE Kit	Qiagen	73504 & 19093	Pour l’extraction d’ARN et l’extraction d’ARN Mesure DV200   ;
Résine Sculpt Ultra White	Siraya Tech	N/A	Résine UV résistante à haute température
Kit de préparation de la bibliothèque de codes-barres Stereo-seq 16	STOmics / Génomique complète	111KL160	Pour la construction de la bibliothèque OMNI FFPE stéréo-séquent
Kit d’accessoires FFPE stéréo-seq	STOmics / Génomique complète	310AK002	Pièces accessoires spatiales OMNI du kit 211SN114
Culasse à puce N-seq stéréo (1 cm x 1 cm)	STOmics / Génomique complète	210CN114	Puce OMNI spatiale partie du kit 211SN114
Adaptateur PCR stéréo-seq  ;	STOmics / Génomique complète	301AUX001	Pour les étapes d’hybridation PCR, modifiées pour en tenir trois similaires, similaires à l’adaptateur d’hybridation Situ PCRmax
Kit N de transcriptomique stéréo-séquent	STOmics / Génomique complète	211KN114	Spatial OMNI regent, partie du kit 211SN114
Conception chirurgicale : lame de rasoir industrielle polyvalente	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-812-236	Histologie - Utilisée lors du découpage des échantillons
Solution tampon TE pH 8,0	Sigma-Aldrich	8890	Pour éluer l’ADNc et les bibliothèques
Cycleurs thermiques	BioRad / divers	1861096 /12015392 / divers	Machine PCR avec couvercle manuel ou options de puits profonds (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler, etc.)
Kits tampons de pH tout-en-un Thermo Scientific Orion	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-624-500
Bain de flottaison tissulaire - Digital XH-1003	Première	NC0779538	Histologie - Utilisée lors du découpage des échantillons
Lunettes à protection UV	Divers	N/A	Pour la sécurité lors du durcissement UV
Xylènes	Sigma-Aldrich	247642	Pour la déparaffinisation