Ce protocole chirurgical est un guide étape par étape pour insérer un cathéter intrathécal dans l’espace sous-dural de la colonne vertébrale d’un rongeur afin d’administrer un traitement ciblé.
Article de méthode
Accès à l’espace sous-dural de la moelle épinière des rongeurs pour l’administration du traitement
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le traitement des maladies ou des lésions de la moelle épinière est difficile, en partie en raison des difficultés à développer des traitements efficaces qui peuvent être appliqués directement sur la moelle. Les traitements actuels des lésions de la moelle épinière (LME), par exemple, sont principalement la péridurale. Cependant, les thérapies péridurales ne permettent pas d’interaction directe avec la moelle épinière, ce qui réduit l’effet potentiel du traitement. Ici, une méthode est proposée pour accéder à l’espace sous-dural dans un modèle de rongeur pour un effet plus direct d’un traitement donné. À l’aide du protocole décrit, une implantation sous-durale réussie d’un dispositif bioélectronique pour l’enregistrement/stimulation de la moelle épinière, ainsi que l’insertion en toute sécurité d’un hydrogel chargé de neurotrophine-3, ont été réalisées. Les animaux exposés à ce protocole dans les deux applications n’ont montré aucun changement dans la fonction des membres postérieurs ou antérieurs après l’intervention, et aucun dysfonctionnement ne s’est développé jusqu’à 12 semaines après l’intervention. Bien que les exemples présentés ici soient très spécifiques, le protocole proposé peut être utilisé dans une variété d’applications pour permettre un traitement localisé plus efficace des troubles neurologiques de la moelle épinière.
Introduction
Les maladies et les lésions de la moelle épinière peuvent avoir des effets dévastateurs sur des millions de personnes dans le monde, entraînant d’importants fardeaux sociaux, économiques et de soins de santé 1,2. Les lésions de la moelle épinière et les maladies neurodégénératives peuvent entraîner des dysfonctionnements moteurs, sensoriels et autonomes chroniques qui réduisent la qualité de vie et l’indépendance des personnes touchées. Les traitements actuels, tels que l’intervention chirurgicale et la pharmacothérapie, se concentrent sur l’atténuation des traumatismes initiaux et la gestion des complications secondaires3. Cependant, ces approches permettent rarement une régénération neuronale ou une récupération fonctionnelle substantielles, ce qui nécessite un besoin urgent d’interventions plus efficaces qui ciblent les mécanismes sous-jacents.
L’une des principales préoccupations des stratégies de traitement actuelles est l’emplacement et l’administration du traitement souhaité. Les traitements tels que la neuromodulation ou l’intervention pharmaceutique ont la capacité d’influencer l’activité neuronale, de faciliter la récupération fonctionnelle et potentiellement de rétablir les connexions dans les circuits spinaux endommagés4. La stimulation de la moelle épinière peut entraîner une amélioration du contrôle moteur et une réduction de la douleur5. Cependant, ces stratégies se limitent actuellement à une administration indirecte vers le tissu lésé, centrée sur l’espace péridural, sans tenir compte de la barrière de la dure-mère dela moelle épinière6,7,8. Bien que les traitements périduraux aient montré des avantages cliniques, ils sont limités en raison de l’accès indirect aux populations neuronales cibles, ce qui peut entraîner une réduction potentielle des effets des agents thérapeutiques.
Notre groupe s’est efforcé de surmonter ces limites associées aux stratégies axées sur la péridurale et d’explorer le potentiel de l’administration directe d’un traitement sous-dural dans des modèles de lésions de la moelle épinière (LME). L’insertion de cathéters dans l’espace sous-dural permet d’appliquer le traitement directement sur la moelle épinière, ce qui améliore l’interaction avec le tissu neural affecté 9,10. L’administration sous-durale réduit également les effets de barrière de la dure-mère, améliorant l’efficacité de la stimulation électrique et des systèmes d’administration de médicaments ciblés11,12. Cette méthode pourrait améliorer la précision et l’efficacité du traitement, ce qui pourrait conduire à de meilleurs résultats en matière de récupération fonctionnelle.
Cet article décrit un protocole étape par étape pour un accès sûr à l’espace sous-dural de la moelle épinière du rongeur. Cette procédure est axée sur la région thoracique de la colonne vertébrale (T10-T12), cependant, elle peut être mise en œuvre à différents endroits du cordon si nécessaire. Les repères anatomiques sont spécifiés, permettant l’identification de la région, et des instructions détaillées sur la laminectomie, la durotomie et la pénétration de la dure-mère sont présentées. Deux applications de ce protocole sont également présentées, notamment l’implantation d’un dispositif de stimulation électrique ainsi que l’administration d’un système d’administration de médicament à base d’hydrogel (Figure 1). Les étapes décrites sont facilement reproductibles par des chercheurs ayant de l’expérience dans la chirurgie des rongeurs. Ce protocole est écrit dans le contexte d’un modèle de contusion de LME ; Cependant, le modèle spécifique de blessure peut être modifié en fonction des résultats expérimentaux souhaités. La technique décrite ici est non seulement prometteuse pour faire progresser le traitement des lésions médullaires, mais pourrait également fournir une plate-forme pour de futures recherches sur la réparation et la régénération de la moelle épinière grâce à des interventions précises et localisées.
Protocole
Toutes les procédures ont été menées conformément aux directives éthiques de l’Université d’Auckland et ont été approuvées par le comité d’éthique animale (AEC) et les responsables du bien-être animal (AWO) de l’université. Des rats femelles Sprague-Dawley pesant de 240 à 260 g ont été utilisés et logés en groupe (21 °C ; 12 h : 12 h, cycle lumière-obscurité) et ont eu accès ad libitum à la ration standard des rongeurs avant et après la chirurgie. Il est recommandé d’essayer d’abord ce protocole en l’absence d’un modèle de blessure, car l’intention est de fournir un accès sûr à l’espace sous-dural de la moelle épinière du rongeur. Il s’agit d’une première étape importante pour démontrer que le protocole peut être appliqué sans causer de blessures, ce qui permet un examen plus précis d’un modèle de blessure souhaité. Le protocole peut être combiné avec les nombreux modèles de blessures différents utilisés par les groupes de recherche. Par conséquent, le protocole ne décrit pas d’étapes précises à l’égard des blessures, car celles-ci varient en fonction de l’application. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation préopératoire
- Stérilisez tous les instruments (figure supplémentaire 1) et les consommables appropriés.
- Pesez le(s) rat(s) à opérer le lendemain.
- Calculer les doses appropriées de médicaments à administrer ; bupivacaïne (analgésique) @ 2 mg/kg, dose - 0,08 mL/100 g ; méloxicam (analgésique) @ 2 mg/kg, dose - 0,04 mL/100 g ; buprénorphine (analgésique) @ 0,03 mg/kg, dose - 0,1 mL/100 g ; enrofloxacine (antibiotique) @ 10 mg/kg, dose - 0,08 mL/100 g12,13.
REMARQUE : La bupivacaïne a été administrée par voie sous-cutanée à 3 ou 4 sites le long du site chirurgical avant l’incision initiale.
2. Préparation chirurgicale
- Assurez-vous que le système d’anesthésie est correctement configuré (vérifiez si tous les tubes associés au système d’oxygène et d’anesthésie sont correctement configurés).
- Préparez les injections requises en fonction du poids des rats ainsi qu’une injection de solution saline de 3 mL à administrer avant le début.
- Assurez-vous que le coussin chauffant (température de maintien de 37 °C), la lampe, le microscope et le rasoir sont tous installés et fonctionnels.
REMARQUE : Aucun grossissement spécifique pour le microscope de dissection n’est nécessaire, car le grossissement variera en fonction des préférences de l’utilisateur et de la visibilité pendant la procédure.
ATTENTION : Assurez-vous que la température de l’animal ne descend pas en dessous de 35 °C ou ne dépasse pas 40 °C pendant la procédure
3. Préparation des animaux
- Assurez-vous que tous les tubes associés au système d’anesthésie et à la bouteille d’oxygène sont connectés. Si vous utilisez le système d’anesthésie utilisé dans cette étude (voir le tableau des matériaux), réglez l’induction de l’isoflurane à 3 % et entrez le poids de l’animal dans le système d’anesthésie pour régler le débit d’oxygène pour l’anesthésie d’entretien (figure supplémentaire 1A).
REMARQUE : Maintenez l’anesthésie à un niveau de maintien adapté à chaque animal. Cela peut varier entre 1,3 % et 2 % selon l’animal. - Placez le rat dans la chambre d’induction jusqu’à ce qu’il ne puisse plus se redresser, passez au niveau de maintenance souhaité à l’isoflurane et déplacez le rat vers le cône nasal.
- Administrer 3 mL de solution saline et les injections de médicament requises, par voie sous-cutanée, avant le rasage.
REMARQUE : Après les injections de solution saline et le rasage, injectez la bupivacaïne à plusieurs endroits le long du site d’incision prévu - Tout en surveillant le niveau d’anesthésie de l’animal, préparez tous les instruments (microscope, outils, champs stériles) dans la zone chirurgicale. Placez un champ stérile pour les outils dans la zone souhaitée et organisez les outils sur le drapé, en maintenant le champ stérile.
- Rasez la fourrure le long du dos de l’animal, de la base du cou jusqu’au haut des hanches.
- Désinfectez la zone avec un gommage au chlorhex, suivi d’une teinture de chlorhex, en utilisant un mouvement circulaire en partant du centre de la zone rasée (3x), et appliquez du lubrifiant sur les yeux pour éviter le dessèchement.
- Transférez le rat dans le coussin chauffant sous le microscope, placez une presse et un champ de scellement sur la zone rasée et découpez un trou suffisamment grand pour exposer le champ chirurgical, mais pas trop grand pour exposer toute fourrure non rasée.
- Placez une sonde de température rectale pour surveiller la température de l’animal et maintenez ~37 °C avec le coussin chauffant. Effectuez des contrôles du bien-être animal toutes les 5 à 10 minutes.
- Administrez le réflexe de pédale pour confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie et commencez la procédure.
4. Dissection tissulaire de la colonne vertébrale
- À l’aide d’une lame de scalpel, faites une incision linéaire (~6-8 cm) dans une direction rostrale à caudale (Figure 2A), en commençant sous la base du cou et en s’étendant sur la bosse thoracique, exposant les vertèbres T9-T13.
- Associez doucement le tissu conjonctif sous le site d’incision à l’aide d’une pince Graefe ou de micro-ciseaux à ressort, pour exposer directement le tissu musculaire de la colonne vertébrale.
- Identifiez l’apophyse T13 en localisant les deux tendons blancs en forme de V près de la moitié caudale de l’incision. L’apophyse épineuse directement rostrale au V du côté de la queue de l’animal est T13 (figure 2B).
- À partir de T13 et jusqu’à T9, faites de petites incisions dans les tissus conjonctifs entre chaque processus pour les séparer avant de dégager le muscle, afin d’aider à maintenir l’emplacement au fur et à mesure que la procédure progresse (Figure 2C). Ensuite, coupez des canaux dans le muscle qui sont parallèles aux deux côtés des apophyses épineuses à l’aide de micro-certificats. Faites-le des deux côtés de la colonne vertébrale pour exposer la lame de chaque segment de la colonne vertébrale (Figure 2D).
- Fixez des pinces serrefine des deux côtés des parois musculaires pour maintenir un champ de vision ouvert sur la colonne vertébrale. Fixez une paire sur les côtés du T13, une autre à la bordure T11/T12 et une autre à T11/T10 (Figure 2E).
- Une fois que des canaux clairs sont formés, coupez le tissu conjonctif entre chaque processus à l’aide de microciseaux ou de rongeurs (Figure 2F).
- Dégagez les canaux jusqu’à ce que le tissu conjonctif et le muscle soient proprement disséqués de chaque lame, de la partie rostrale de T13 à la partie caudale de T9, exposant les segments T10-12 pour la procédure de laminectomie. La réussite de l’achèvement est indiquée par une lame clairement visible de chaque côté des processus.
REMARQUE : Un microscope n’est pas nécessaire pour l’étape 4, mais est fortement recommandé.
5. Laminectomie
- Localisez la partie caudale de la lame T12 qui chevauche la partie rostrale de la lame T13, positionnez l’extrémité des rongeurs en dessous et commencez doucement à retirer des morceaux de lame, comme recommandé dans les protocoles standard JoVE 14,15 (Figure 2G).
REMARQUE : À l’aide d’une pince, saisissez l’apophyse épineuse de chaque lame afin de maintenir la stabilité et de « soulever » doucement les plaques lors de chaque coupe avec les rongeurs (figure 2G). Lorsque vous glissez l’extrémité des rongeurs sous la lame, maintenez la pression vers l’extérieur loin de la moelle épinière pour minimiser les dommages potentiels.
ATTENTION : Veillez à ne pas enfoncer les rongeurs trop loin en dessous lorsque vous faites des coupes, car cela pourrait endommager la dure-mère et/ou la moelle épinière elle-même. - En vous déplaçant d’un côté à l’autre, continuez à couper des morceaux d’os de la lame T12 jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment d’espace pour étendre la coupe sur la ligne médiane du processus, exposant la moelle épinière, avec un trou d’environ 5 mm de diamètre (Figure 2H).
REMARQUE : L’ablation de l’os de la colonne vertébrale peut entraîner des saignements qui peuvent réduire la visibilité pendant la procédure. Utilisez des cotons-tiges ou des lingettes non pelucheuses roulées (figure supplémentaire 1B) pour gérer cela pendant la laminectomie. - Travaillez les rongeurs sous le limbe de chaque côté, puis dégagez un canal uniforme jusqu’à la partie crânienne de T12 (Figure 2I).
REMARQUE : La moelle épinière deviendra visible lorsque des morceaux de la plaque laminaire seront retirés pour chaque segment de la colonne vertébrale. - Répétez les étapes 5.1 à 5.3 pour retirer T11 et T10.
- Continuez la laminectomie, en maintenant des coupes uniformes des deux côtés, en se déplaçant rostralement jusqu’à T9 (Figure 2J).
REMARQUE : Pour les procédures de lésions médullaires de contusion (voir la section Résultats représentatifs), la lame au-dessus du ou des segments de la moelle épinière souhaités doit être dégagée suffisamment large pour permettre l’utilisation d’un dispositif de lésion de contusion (voir la zone élargie au milieu de la figure 2K). Pour l’administration de médicaments, la laminectomie peut être juste assez large pour visualiser l’application du composé souhaité. - Rincer doucement le sac thécal avec une solution saline et préparer la zone souhaitée pour la durotomie une fois que la laminectomie est terminée et qu’une zone suffisante de T10-T12 a été retirée (Figure 2K).
REMARQUE : Cette procédure est spécifique pour l’accès aux segments de la colonne vertébrale (T10-T12), cependant, ces méthodes peuvent être utilisées pour effectuer des laminectomies à divers segments le long de la colonne vertébrale.
6. Durotomie pour l’application du traitement
- Réaliser la durotomie (incision de la dure-mère) à l’aide de la sonde de dissection pour accéder à l’espace sous-dural de la moelle épinière (Figure 3A).
REMARQUE : Ajustez le grossissement de l’endoscope en fonction de la préférence du chirurgien pour la visibilité de la dure-mère. - Pliez une aiguille de 27-G selon un angle de 90 degrés, le biseau vers le haut (Figure 3B).
REMARQUE : Utilisez une paire de tourne-aiguilles ou d’hémostatiques pour saisir l’aiguille lors de la flexion. - Percez doucement la dure-mère avec la pointe de l’aiguille au point d’entrée souhaité sur la moelle épinière (Figure 3B).
ATTENTION : Veillez à ne pas endommager la moelle épinière sous-jacente ou son vaisseau sanguin médian. - Une fois la dure-mère perforée, soulevez doucement l’aiguille dorsalement pour déchirer un trou circulaire dans la dure-mère, pas plus de 2 mm, de chaque côté du vaisseau sanguin médian. Une durotomie réussie est indiquée par une petite quantité de liquide céphalo-rachidien (LCR) qui s’échappe de l’un ou l’autre trou.
REMARQUE : Gardez une distance d’au moins quelques mm de l’extrémité de la laminectomie pour permettre un accès plus facile à l’espace sous-dural. Si nécessaire, réinsérez soigneusement la pointe de l’aiguille dans le trou initial pour augmenter sa taille. - Assurez-vous que la position choisie pour l’incision de la durotomie et la position immédiatement devant sont exemptes de vaisseaux sanguins ramifiés du vaisseau sanguin médian.
ATTENTION : NE PAS endommager le vaisseau sanguin médian, car cela provoquerait des saignements excessifs, empêchant la fin de la procédure. - À l’aide des trous pratiqués dans la dure-mère, administrez le traitement souhaité ou implantez un dispositif dans l’espace sous-dural. Pour ce protocole, des cathéters intrathécaux sont utilisés pour l’administration du traitement afin de guider le dispositif de stimulation en position ou d’injecter l’hydrogel (Figure 3C).
REMARQUE : Maintenez un champ de vision dégagé en éliminant continuellement le sang et/ou le LCR après des durotomies. - Assurez-vous que les extrémités des cathéters sont visibles sous la dure-mère avant de progresser dans la moelle épinière. Une application réussie est indiquée par des cathéters se déplaçant en douceur sur les petits vaisseaux sanguins de la colonne vertébrale sous la membrane durale.
- Une fois le traitement souhaité administré (Figure 3D,E), placez un morceau de mousse de gel chirurgicale stérile dans l’espace créé par la laminectomie pour aider à l’hémostase, à la cicatrisation des plaies et au maintien de la structure de la colonne vertébrale.
- Après la mise en place de la mousse de gel, utilisez une suture résorbable en polydioxanone 4-0 pour fermer la couche musculaire et cutanée au-dessus de la colonne vertébrale.
7. Soins postopératoires
- Vérifiez les animaux tous les jours et donnez-leur les médicaments postopératoires nécessaires (buprénorphine pendant 2 jours ; enrofloxacine et méloxicam jusqu’à 5 jours). Administrer 1 à 3 ml de solution saline par voie sous-cutanée au besoin (si <10 % du poids corporel de l’eau est consommé pendant 24 h pendant la période postopératoire).
- Selon la procédure, surveillez la fonction de la vessie, la fonction motrice, l’échelle de grimace et tout autre signe de bien-être animal.
- Retirez les sutures cutanées environ 10 à 14 jours après la chirurgie.
Résultats
Le protocole proposé a été appliqué dans deux contextes expérimentaux différents. Les données présentées sont représentatives des groupes non blessés car l’intention était de démontrer que les manipulations sous-durales décrites dans la procédure (en l’absence d’un modèle de blessure) n’altèrent pas la fonction. Un dispositif bioélectronique a été implanté (figure 1A) ou un hydrogel a été administré (figure 1B) à des rats Sprague-Dawley âgés de 6 à 8 semaines. La fonction motrice de ces animaux a été comparée à celle d’animaux témoins qui ont subi une chirurgie simulée sans procédure sous-durale à l’aide de l’échelle de fonction motrice BBB. Plusieurs groupes d’animaux sont représentés ici, montrant la viabilité de chaque procédure et sa sécurité. Après chaque procédure, tous les animaux ont maintenu une fonction motrice normale sans différence dans le score de la BHE entre les groupes 7 jours après la procédure, ce qui indique la mise en œuvre en toute sécurité du protocole décrit. De plus, un groupe d’animaux (figure 4C) présentant une altération de la fonction motrice des membres postérieurs est représenté à des fins de comparaison avec les groupes de procédure sous-durale, afin de démontrer qu’aucun effet indésirable n’a été noté dans les groupes expérimentaux. Ce groupe a subi une procédure de contusion par lésion médullaire avec une force d’impact de 175 kdyn, comme décrit dans la littérature antérieure12,13.
Implant bioélectronique
Pour l’implantation du dispositif, le protocole comprend la création de deux sites de durotomie, l’un pour l’entrée du cathéter et l’autre pour la sortie, afin de faciliter le déplacement des cathéters de guidage sous la dure-mère et le placement contrôlé du dispositif. Le dispositif bioélectronique se composait de deux bras bifurqués reliés à une interface PCB encapsulée par un boîtier biocompatible. Les bras sont temporairement reliés à de petits cathéters intrathécaux par une suture en soie 7-0 pour aider au positionnement de l’implant. Les cathéters sont lentement tirés à travers les trous de durotomie rostrale, glissés sous la dure-mère et à travers les trous de durotomie de sortie caudale jusqu’à l’emplacement du traitement. Les bras de l’implant attachés ont ensuite été tirés et positionnés sur chaque hémisection de la moelle épinière. L’extrémité arrière de l’implant est suturée au muscle attaché au processus T13. Le boîtier est suturé au muscle trapèze/grand chemin rostral à la laminectomie. La peau est ensuite fermée autour de la base de l’unité d’habitation pour permettre un accès externe.
Traitement à l’hydrogel
Pour la livraison d’hydrogel, seul un point d’entrée est requis. L’hydrogel a été administré via des cathéters intrathécaux similaires positionnés au même endroit que le dispositif de stimulation. Les cathéters ont été chargés avec 10 μL d’un poloxamer hydrogel12 et ont été insérés dans l’espace sous-dural de la même manière que les étapes d’implantation du dispositif. Une fois en place, les cathéters ont été lentement rétractés tandis que l’hydrogel était libéré en continu sous la dure-mère (Figure1B) sur chaque hémi-cordon. Après chaque procédure, les animaux ont été suivis pendant 7 jours afin d’assurer une récupération adéquate.
L’échelle de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) à 21 points a été utilisée pour l’évaluation de la fonction motrice16. Les animaux des deux groupes ont été évalués avant l’intervention (ligne de base) et 1 jour, 3 jours et 7 jours après l’opération. Le comportement en plein champ a été évalué directement et à l’aide d’enregistrements vidéo en aveugle. Les scores de la fonction motrice pour les membres postérieurs gauche et droit de chaque groupe ont été comparés à ceux d’animaux témoins non opérés et d’un groupe séparé de LME afin de déterminer l’étendue des effets indésirables de la chirurgie. Les animaux du groupe implant ou hydrogel n’ont montré aucun déficit de la fonction motrice après l’une ou l’autre procédure, par rapport aux témoins non opérés ou aux animaux blessés par lésion médullaire. A noter, une analyse histologique confirmant l’absence de lésion de la moelle épinière a déjà été publiée dans nos précédents travaux. Cette étude a démontré que l’utilisation de cette méthode pour implanter un dispositif ne produit pas de traumatisme supplémentaire de la moelle épinière jusqu’à 7 jours après l’intervention11. Des changements minimes dans l’activité des astrocytes (GFAP) et des microglies/macrophages (Iba1) ont été observés après l’implantation d’un dispositif par rapport aux animaux témoins. La surface et la rondeur des sections de la moelle épinière coronale directement sous l’implant ont également été examinées, ne montrant aucun changement de morphologie.
Figure 1 : Stratégies de traitement sous-dural (A) Exemple du dispositif d’implant et (B) cathéter/seringue utilisé pour l’injection de l’hydrogel. (C) Modèles représentatifs de l’implant et de l’insertion d’hydrogel dans la moelle épinière d’un rat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de la laminectomie, représentant le champ opératoire. (A) Orientation de l’animal pour les images chirurgicales dans les figures 2 et 3. (B) Repères du tendon musculaire pour l’emplacement du processus T13 afin de guider le début de la dissection musculaire. (C) Coupes perpendiculaires pour identifier chaque processus à enlever par laminectomie. (D) Canaux musculaires coupés parallèlement aux processus rachidiens pour permettre l’accès aux plaques osseuses pour l’extraction. (E) Clips serrefine Bulldog utilisés pour retenir le muscle/la peau de chaque côté de la colonne vertébrale afin de fournir un espace chirurgical adéquat. (F) Élimination des tendons blancs interconnectant chaque processus avant le début de la laminectomie. (G) Champ chirurgical au début de la laminectomie alors que les rongeurs sont glissés sous la plaque T12 pour commencer à couper l’os. (H) La première moitié de l’apophyse T12 a été retirée pour exposer la moelle épinière et laisser suffisamment d’espace au chirurgien pour se déplacer rostralement et commencer à enlever les apophyses restantes (T11/T10). (I) Ablation de la partie crânienne de T12, avec ablation complète du segment. (J) Laminectomie à mi-chemin à T11 utilisant des coupes plus larges pour l’application d’un exemple de contusion LÉDER. (K) Laminectomie complète après ablation des segments T10-T12, exposant complètement la surface dorsale de la moelle épinière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Étapes de la réalisation de la durotomie et de l’application d’un traitement ciblé. (A) Schéma de l’emplacement des trous dans la dure-mère de la moelle épinière. (B) Champ chirurgical montrant une aiguille de 27 G pénétrant dans la dure-mère pour créer la durotomie ; cela se fait des deux côtés du vaisseau sanguin central comme on le voit en (A). (C) Insertion initiale d’un cathéter utilisé pour l’application du traitement. (D) Dispositif de stimulation électrique en place sur la moelle épinière. (E) Cathéters chargés d’hydrogel pour injection à la surface de la moelle épinière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : État postopératoire et fonction motrice. (A) Images représentatives d’animaux après l’implantation du dispositif et l’administration d’hydrogel. (B) Scores représentatifs de la BHE chez les animaux ayant subi une contusion vertébrale par rapport aux animaux qui ont subi une procédure sous-durale (implant ou hydrogel) ou aux animaux témoins qui n’ont subi aucune manipulation. La taille des échantillons du groupe témoin (non opéré), du SCI et de l’implant était de n = 5, et la taille de l’échantillon du groupe Hydrogel était de n = 3. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Outils chirurgicaux. Photographie des outils chirurgicaux utilisés. (1) Scalpel à lame #10. (2) Micro-ciseaux Vannas. (3) Pince Graefe. (4) Pinces bouledogue Serrefine. (5) Rongeurs. (6) Aiguille de 27 g pour la durotomie. (7) Pinces fines. (8) Seringue de 1 mL pour l’application d’une solution saline au besoin. (9) Ciseaux de dissection. (10) Hémostats pour la suture. (11) Cotons-tiges pointus. (12) Boules de coton stérilisées. (13) Lingettes roulées non pelucheuses. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure supplémentaire 2 : Espace sous-dural et espace péridural. Représentation schématique de la colonne vertébrale et de la moelle épinière, démontrant la péridurale vs. espace sous-dural. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Discussion
La méthodologie présentée ici fournit des instructions étape par étape pour accéder à l’espace sous-dural de la colonne vertébrale et démontre son innocuité et sa faisabilité à travers deux exemples d’administration de traitement dans la région thoracique de la moelleépinière11,12. De nombreux groupes de recherche ont mis au point des approches pour tenter de traiter les lésions de la moelle épinière (LME) par des interventions électriques ou chimiques. Les stratégies actuelles, y compris les dispositifs implantables pour l’optogénétique17 ou la stimulation électrique18, ainsi que les thérapies pharmaceutiques utilisant des hydrogels19,20, ont démontré divers degrés de succès pour faciliter la récupération et la réadaptation. Cependant, le ciblage précis reste un défi critique, car la plupart des traitements actuels sont administrés en dehors de l’espace sous-dural. La technique décrite ici offre une approche prometteuse pour la mise en œuvre d’interventions directement sur la moelle épinière, y compris un moyen d’accès à long terme à l’espace sous-dural (figure supplémentaire 2), favorisant l’administration soutenue et ciblée d’agents thérapeutiques pour les lésions médullaires et les maladies neurodégénératives. Cela a des implications importantes pour le contournement de la barrière hémato-moelle épinière, un défi majeur dans le développement de traitements efficaces pour les troubles de la moelle épinière.
Laminectomie
Bien que les procédures de laminectomie chez les rongeurs soient largement utilisées 17,21,22, plusieurs aspects critiques du protocole doivent être notés. Les repères anatomiques utilisés dans le protocole ci-dessus (étape 4.3 ; Graphique 2A) permettent d’accéder à la région thoracique inférieure de la moelle épinière et sont spécifiques au travail de notre groupe. Si la procédure doit être appliquée à une autre région de la colonne vertébrale, on peut compter les segments rostrals ou caudals jusqu’aux vertèbres initiales pour déterminer l’emplacement. Une autre considération cruciale est l’étendue de l’élimination du limbe. Pour minimiser le risque de blessure indésirable à la moelle épinière pendant la procédure, au moins deux niveaux contigus doivent être retirés. Cela permet d’avoir suffisamment d’espace pour la durotomie et d’assurer une bonne visualisation. Cette précaution réduit le risque de blessure des petits vaisseaux sanguins lors de l’insertion du cathéter. L’ablation excessive de l’os de la paroi latérale de la colonne vertébrale doit également être évitée pour éviter des saignements inutiles ou une instabilité de la colonne vertébrale après la chirurgie. En maintenant un équilibre entre un accès adéquat et une perturbation minimale, la procédure garantit une administration plus sûre et plus précise du traitement.
Durotomie et insertion d’un cathéter
La réalisation de la durotomie nécessite de la précision pour éviter de pénétrer la moelle épinière. Une mauvaise insertion peut entraîner des ecchymoses ou des lacérations à la moelle épinière ou aux vaisseaux sanguins sous-duraux. Les ouvertures créées dans la dure-mère doivent être juste assez grandes pour s’adapter à la stratégie de traitement souhaitée, dans ce cas, le diamètre des cathéters intrathécaux, sans compromettre l’intégrité de la membrane. Lors de la réalisation de la durotomie, le liquide céphalo-rachidien peut s’écouler lorsque la dure-mère est perforée ; Cependant, la quantité est minime. Bien que de grandes déchirures de la dure-mère puissent entraîner des complications, la littérature antérieure suggère que de petites ponctions telles que celles utilisées dans le protocole décrit (étape 6.4) sont capables de s’auto-guérir via le dépôt/la vascularisation du collagène23, ce qui n’entraîne aucun effet indésirable mesurable après la procédure. Lors de la mise en place des cathéters, ils doivent être insérés aussi parallèlement que possible à la moelle épinière afin de minimiser le risque de blessure par force directe. Une manipulation soigneuse est nécessaire pour éviter la flexion ou le sertissage, assurant une insertion en douceur et un positionnement correct.
Soins postopératoires
Les soins postopératoires après l’intervention sont une considération importante étant donné que les rongeurs sont généralement logés en groupe dans des conditions standard. Un comportement agressif ou des interactions sociales après cette procédure peuvent affecter les résultats expérimentaux, selon le type de traitement appliqué. Ce protocole se traduit par une ligne de 6 à 8 cm de sutures cutanées le long du dos de l’animal. Il est recommandé de garder les animaux d’une seule maison pendant 7 à 10 jours après l’opération pour permettre la cicatrisation des plaies et empêcher l’élimination potentielle des sutures par un compagnon de cage. Dans le cas d’une application d’administration de médicament, une fois l’incision cicatrisée, ils peuvent être relogés dans les groupes précédents sans comportement ouvertement agressif ni complications liées à la procédure. Dans le cas des dispositifs implantables, les animaux ne doivent être logés que par groupes de 2. Nous avons constaté que l’hébergement d’animaux en groupes de 3 ou plus peut entraîner des complications liées à l’agressivité avec les résultats du traitement.
Applications de traitement
Bien que la procédure décrite ici se concentre sur la moelle épinière thoracique et deux stratégies de traitement spécifiques, elle est adaptable à d’autres régions de la colonne vertébrale et à d’autres applications thérapeutiques. Des procédures de laminectomie similaires ont été réalisées avec succès à différents niveaux de la colonne vertébrale chez des modèles de rongeurs. Cependant, le petit espace sous-dural chez les rongeurs présente un défi, laissant une marge d’erreur minimale lors de l’administration du traitement. Bien que les étapes de laminectomie et de durotomie puissent être facilement effectuées par des personnes expérimentées dans les chirurgies de rongeurs, le placement précis d’un dispositif ou d’un médicament sous la dure-mère sans causer de blessure peut nécessiter un temps de formation supplémentaire. En plus de la formation chirurgicale, plusieurs facteurs peuvent aider à l’application du traitement. Il est crucial de maintenir un champ de vision dégagé lors de l’application du traitement. Assurez-vous, lors de l’utilisation de cathéters intrathécaux tels que décrits dans cette étude, qu’il n’y a pas de points déchiquetés ou rugueux sur les cathéters avant de les insérer sous la dure-mère. Comme mentionné ci-dessus, l’emplacement de la durotomie est extrêmement important. Plus le point d’entrée du cathéter est éloigné de la lame rostrale restante, plus il est facile pour les cathéters d’être alignés et de rester parallèles à la moelle épinière lors de l’insertion. Le calendrier des stratégies de traitement en relation avec une blessure doit également être pris en considération. Les travaux futurs consisteront à établir ces procédures chez les animaux à divers moments après la blessure afin de permettre par la suite l’évaluation des traitements destinés à traiter les blessures chroniques. Ce protocole représente une avancée significative dans l’application du traitement des maladies neurologiques de la moelle épinière et offre une approche polyvalente et précise pour administrer des thérapies directement au tissu de la moelle épinière.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est financé par CatWalk Spinal Cord Injury Trust et une bourse de recherche HRC Sir Charles Hercus (BH). Ce travail a également été soutenu par le Secrétaire adjoint à la Défense pour les affaires de santé, approuvé par le Département de la défense, pour un montant de 534 258 dollars, par le biais du Programme de recherche sur les lésions de la moelle épinière au titre de la subvention n°. Réf. : HT9425-23-1-0492. Les schémas des figures 2A et 3A ont été générés à l’aide de Biorender.com.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Seringues de 1 mL et 3 mL | Amtech | ||
| Seringues tuberculines de 1 ml | BD | 302100 | |
| 2 pinces Graefe | FST | 11051-10 | |
| Aiguilles 25G pour l’administration des médicaments | Nipro | SH811 | |
| Aiguilles 27G pour incision durale | Nipro | SH816 | |
| 6 pinces de bulldog en tissu | FST | 18051-28 | |
| 70 % d’éthanol | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Gants en latex Biogel Surgeons | Molnlycke | 822775-01 | |
| Bupivicaïne 2 mg/kg | Aspen Nouvelle-Zélande | 2023-02 | |
| Buprénorphine 0,05 mg/kg | Ceva (vétergisique) | 9000320 | |
| Chlorhex et teinture d’ehtanol | Perrigo | K076A | |
| Gommage chlorhex | Schulke | LBL11258 | |
| Rongeurs courbés | FST | 16021-14 | |
| Pinces Dumont #4 | FST | 11294-00 | |
| Gelfoam, éponge à la gélatine stérile absorbable | GELFOAM | 09-0342-04-015 | |
| Seringue Hamilton | Hamilton | 80314 | |
| Bouillotte (37 oC) | Kent Scientific | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Impacteur Infinite Horizon et logiciel | Systèmes de précision et instrumentation (PSI) | IH-0400 | |
| Isoflurane | Medsource | Inconnu | |
| Metacam 2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| Sutures non absorbables (Ethilon 4-0, P-3) | Ethicon | 1603G | |
| Réservoir O2 | |||
| Microscope chirurgical Omax | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Pressez et scellez du film plastique pour le drapé | Content | N/A | |
| Poignée de scalpel | Outils scientifiques fins (FST) | 10004-13 | |
| Lames scalpel taille 10 | Amtech Medical | SH070 | |
| Suite d’induction Somnoflow | Kent Scientific | SF-01 | Système d’anesthésie à faible débit |
| Serviettes absorbantes stériles et coton | Swisspers | N/A | |
| Coton-tiges stériles (standard + pointu) | help@hand | N/A | |
| Solution saline stérile 0,9 % | Fabriqué et autoclavé en laboratoire | N/A | |
| Des sections stériles de Kim Wipe roulé | Kimtech Science | 34155 | |
| Sonde de température | Kent Scientific | SF-01 | |
| Ciseaux de printemps Vannas | FST | 15903-08 | |
| Lubrifiant à base d’eau | |||
| Balances | N’importe lequel | N/A |
Références
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Réimpressions et autorisations
