Détermination structurelle de l’hémagglutinine à partir de la cryotomographie électronique des virus de la grippe

La cryotomographie électronique (cryoET) a été appliquée au cours des dernières décennies pour capturer des instantanés de complexes protéiques, de virus, de cellules et d’organismes. Modalité de cryo-microscopie électronique (cryoEM), la cryoET est une méthode de biologie structurale où un échantillon biologique est congelé instantanément, puis imagé à travers une variété d’orientations par inclinaison ^1,2,3. Les images prises à chaque orientation sont ensuite alignées par calcul sur leur axe d’inclinaison commun et reconstruites dans un tomogramme pour fournir une vue tridimensionnelle⁴.

Alors que la cristallographie aux rayons X et la cryoEM à particule unique nécessitent des molécules purifiées et structurellement homogènes, la cryoET peut imager une molécule directement dans son contexte natif⁴. Par conséquent, l’un des principaux avantages de la cryoET est sa capacité à visualiser des échantillons pléomorphes, tels que les virus membraneux, y compris la grippe ^5,6,7. Une autre promesse de la cryoET est sa capacité à imager à toutes les échelles. Bien que les tomogrammes ne soient généralement pas résolus au-delà de 5-10 nm⁸, l’intégration de la moyenne du sous-tomogramme, où des copies de la même particule sont identifiées, alignées et moyennées, peut aboutir à une résolution quasi atomique dans certaines molécules biologiques telles que les ribosomes ^9,10. Cependant, seuls des types limités de molécules peuvent atteindre cette résolution ; les moyennes du sous-tomogramme ne dépassent généralement pas la résolution de 10-15 Å. En revanche, la cryoEM à particule unique atteint régulièrement des résolutions de 3-4 Å après la révolution de résolution¹¹. Les progrès récents dans le domaine de l’acquisition et de l’analyse de données cryoET à haut débit ont permis de déterminer la structure de molécules biologiques supplémentaires dans leur contexte natif 12,13,14,15,16,17,18.

L’une des utilisations courantes de la cryoET consiste à visualiser la morphologie, l’organisation et la structure du virus. Malgré la résolution plus faible offerte par cette technique par rapport à la cryoEM à particule unique ou à la cristallographie aux rayons X, la cryoET combinée à la moyenne par sous-tomogramme peut fournir des informations sur le comportement des protéines virales dans leur environnement natif et fournir des détails cruciaux sur leur organisation dans le contexte du virion. Une cible courante de la cryoET des virus est les glycoprotéines de surface qui sont couramment utilisées pour la fixation et la fusion des cellules hôtes, car elles sont souvent les principaux antigènes et cibles pour les traitements ou les vaccins. Avec les progrès récents dans les boîtiers de traitement cryoET, il est devenu de plus en plus possible d’atteindre des moyennes de résolution subnanométrique de ces glycoprotéines 19,20,21,22. C’est le cas de l’hémagglutinine (HA), la principale protéine à la surface des virions de la grippe. Non seulement cette protéine conduit à la fois la liaison au récepteur et la fusion membranaire, mais elle couvre également le virion d’une manière incroyablement dense, avec des centaines à des milliers d’HA sur un seul virion⁵. Le protocole présenté ici (figure 1) intègre plusieurs progiciels couramment utilisés avec des scripts internes pour délimiter les étapes, du prétraitement à l’affinement du modèle pour une moyenne de sous-tomogramme de l’HA de la grippe.

REMARQUE : Des exemples d’ensembles de données utilisés pour ce protocole sont accessibles à l’adresse EMPIAR-12864, qui comprend les deux ensembles de séries d’inclinaison utilisés pour ce protocole. Les séries d’inclinaison sont collectées à partir de grilles plongeées manuellement du virus de la grippe A purifié à une taille de pixel physique de 2,09 Å/pixel pour assurer un champ de vision suffisamment grand pour que chaque série d’inclinaison contienne plusieurs virions, et également pour rendre les reconstructions à la plus haute résolution possible. Pour les propres ensembles de données des utilisateurs, il est recommandé de démarrer le flux de travail avec des films bruts d’inclinaison. Ces jeux de données ont été traités et visualisés à l’aide de postes de travail performants. La table des matériaux répertorie le matériel et les logiciels utilisés pour ce protocole. Tous les progiciels utilisés dans ce protocole sont open source et disponibles en téléchargement ; Les liens et les instructions d’installation sont répertoriés dans la table des matériaux. La station de travail recommandée pour le traitement des ensembles de données cryoET doit être équipée d’au moins un processeur à 8 cœurs, d’une carte GPU dédiée avec 6 Go de VRAM, 64 Go de RAM et 2 To de stockage local.

1. Prétraitement des données des films d’inclinaison et reconstruction de tomogrammes cryo-électroniques dans Warp ²³ et IMOD ²⁴

1. Dans un terminal, activez un environnement conda sur lequel Warp est installé à l’aide de la commande suivante :
   conda activate warp_environment
2. Créez un fichier de paramètres de série de cadres pour le traitement des séries de cadres. Il s’agit d’un fichier de configuration qui contient des métadonnées sur le microscope, l’emplacement des données à traiter et l’emplacement de stockage des fichiers de sortie.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   REMARQUE : Ces données ont été collectées en mode super-résolution.
3. Effectuez l’estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) et la correction de mouvement.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   REMARQUE : m_grid paramètre doit correspondre au nombre de sous-images dans une vidéo d’inclinaison - nos ensembles de données se composaient de 5 sous-images par vidéo d’inclinaison.
4. Importez les métadonnées des séries d’inclinaison afin que WarpTools puisse identifier les films appartenant à chaque série d’inclinaison.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. Une fois le dossier tomostar rempli, créez un fichier de paramètres de série d’inclinaison pour le traitement de la série d’inclinaison
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Écrivez des piles d’inclinaison et effectuez un alignement automatisé des séries d’inclinaison basé sur les repères à l’aide du programme batchruntomo d’IMOD à l’aide de l’interface graphique^{d’Etomo 24}.
   1. Exécutez la commande suivante dans le terminal :
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      REMARQUE : Les tiltseries ont été exportées à 4 fois la taille des pixels physiques pour réduire le temps d’alignement et les ressources de calcul.
   2. Choisissez un exemple de dataset pour définir d’abord les paramètres d’alignement avant de les appliquer en tant que modèle pour batchruntomo.
   3. Importez les paramètres d’alignement d’IMOD si vous utilisez batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      REMARQUE : Pour cet ensemble de données, l’utilisation de l’interface graphique d’Etomo a produit de meilleurs résultats que les wrappers dans WarpTools.
   4. Vous pouvez également effectuer un alignement automatisé des séries d’inclinaisons sans repère à l’aide de l’enrouleur AreTomo²⁵ dans WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      REMARQUE : L’emballage AreTomo a été testé avec AreTomo1.3.4.
7. Exécutez la commande suivante dans le terminal pour estimer les paramètres CTF pour les séries d’inclinaison :
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. Reconstruisez des tomogrammes à l’aide de WarpTools.
   1. Définir la variable d’environnement :
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      REMARQUE : Cette étape garantit que les tomogrammes seront compatibles avec les étapes ultérieures de traitement et de visualisation d’images dans d’autres logiciels utilisés dans ce protocole.
   2. Pour reconstruire des tomogrammes, exécutez dans un terminal : WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Répétez les étapes 1.2 à 1.8.2 pour tous les ensembles de données.

2. Prétraitement du tomogramme et prélèvement des particules

1. Dans un terminal, activez un environnement conda sur lequel IsoNet²⁶ est installé.
   conda activate isonet_env
2. Préparez le traitement des tomogrammes en créant d’abord un sous-dossier et en déplaçant tous les tomogrammes dans ce dossier.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Générez un fichier étoile dans le dossier du projet.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. À l’aide d’un éditeur de texte, ouvrez le fichier étoile généré et entrez la valeur approximative de flou pour les images d’inclinaison de 0 degré dans la quatrième colonne (_rlnDefocus) de chaque tomogramme, qui se trouve dans le fichier processed_items.json dans le dossier warp_tiltseries.
   REMARQUE : La valeur de défocalisation doit être en angströms pour IsoNet. Warp écrit les valeurs de défocalisation en μm, ce qui nécessite un facteur de multiplication de 10 000.
5. Exécutez la commande CTF deconvolve dans le terminal.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. Après la déconvolution, lancez l’interface graphique^{EMAN2 27} pour commencer le prétraitement des tomogrammes pour le prélèvement de particules.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. Sous Tomographie, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur la flèche à côté de Données brutes et sélectionnez Importer des tomogrammes dans le menu déroulant.
8. Faites un clic gauche sur la flèche à côté de Segmentation et sélectionnez Prétraiter les tomogrammes.
   REMARQUE : Les paramètres par défaut conviennent probablement à de nombreux jeux de données. Pour ces tomogrammes, un filtre passe-bas à 4 Å a été appliqué et les images d’inclinaison ont été normalisées. Après le prétraitement, un répertoire d’informations sera automatiquement généré par EMAN2 avec des fichiers .json vierges (avec des noms de base similaires aux fichiers prétraités). L’angpix doit être ajouté aux fichiers json avant le prélèvement des particules.
9. Entraîner le réseau neuronal convolutif (CNN) à reconnaître la glycoprotéine HA.
   1. Modifiez le répertoire de travail pour l’emplacement des tomogrammes à utiliser pour l’entraînement CNN et le prélèvement de particules :
      cd path/to/tomograms
   2. Utilisez le terminal pour ouvrir la fenêtre d’entraînement CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Vérifiez que quatre fenêtres sont ouvertes : l’une contenant les informations sur les paramètres CNN et les tomogrammes dans le répertoire, et les trois autres fenêtres contenant les images des bonnes références (positives), des mauvaises références (négatives) et des particules sélectionnées par les CNN (particules).
   4. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le bouton Nouveau dans l’interface graphique de CNN pour initialiser un nouveau CNN. Réglez le taux d’apprentissage par défaut sur 0,0001 et la taille de la boîte sur 8.
   5. Dans la colonne Nom de fichier , cliquez avec le bouton gauche de la souris sur un tomogramme représentatif pour l’ouvrir dans une nouvelle fenêtre.
      REMARQUE : Un seul tomogramme peut être ouvert à la fois.
      1. Pour vous déplacer sur l’axe z d’un tomogramme, placez le curseur sur le tomogramme ouvert et appuyez sur la molette de défilement de la souris de l’ordinateur pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Le curseur étiqueté N# changera l’axe z.
   6. Sur le tomogramme ouvert, sélectionnez 10 à 20 caractéristiques correspondant à HA à l’aide du bouton gauche de la souris dans le panneau Positif.
      REMARQUE : Sélectionnez les vues de dessus et de côté de HA, qui apparaissent sous forme de cylindres ou de triangles au-dessus de la membrane, comme de bonnes références pour un réseau plus robuste.
      1. Des images de références positives apparaîtront dans la fenêtre Positif . Pour supprimer une référence, maintenez la touche Maj enfoncée et cliquez avec le bouton gauche sur une image de référence.
   7. Passez au panneau Négatif et sélectionnez 10 à 20 références correspondant à des caractéristiques telles que des patchs de membrane vides, la densité vRNP, les marqueurs de repère et les débris.
      REMARQUE : Les références apparaîtront dans la fenêtre Négatif .
   8. Lancez l’entraînement CNN en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur le bouton Train dans la fenêtre principale.
      REMARQUE : Le nombre d’itérations (Niter) dans la fenêtre principale modifie le nombre d’itérations d’entraînement subies par le CNN. Il est recommandé de régler le paramètre sur 50.
   9. Une fois que le CNN a été entraîné sur les références sélectionnées, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Appliquer pour utiliser le CNN pour choisir des particules dans le tomogramme ouvert.
      REMARQUE : Les images des particules prélevées sont visibles dans la fenêtre Particules. Les particules sélectionnées seront également affichées sur le tomogramme en cercles bleus.
   10. Continuez à sélectionner les références positives et négatives en fonction du réseau appliqué, en enregistrant périodiquement la progression via le bouton Enregistrer .
   11. Une fois satisfaisant, sélectionnez Appliquer tout pour que le CNN sélectionne les particules dans tous les tomogrammes du répertoire et évalue les résultats sur plusieurs tomogrammes ; Effectuer une formation supplémentaire au besoin.
10. Enregistrez les coordonnées dans un fichier texte pour chaque tomogramme.
    1. Ouvrez l’interface graphique EMAN2 à l’aide de la e2projectmanager.py commande.
    2. Cliquez sur la flèche à côté de Subtomogram Average (Moyenne du sous-tomogramme ) et cliquez sur Manual Boxing (Mise en boîte manuelle).
    3. Entrez le nom d’un tomogramme et cliquez sur Lancer.
    4. Enregistrez les coordonnées dans le fichier texte en sélectionnant Fichier > Enregistrer la > tomogram_ha.txt de la boîte.
    5. Accédez au sous-dossier neuralnets et au sous-dossier info pour sauvegarder nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf et boxes3dref.hdf.
11. Pour s’assurer que l’analyse n’est effectuée que sur des virions entièrement assemblés où la présence de la couche de protéine matricielle (M1) et du complexe ribonucléoprotéique viral (vRNP) est apparente, entraînez un deuxième réseau neuronal convolutif pour reconnaître la protéine M1.
    1. Suivez le même protocole que celui décrit à l’étape 2.9, en changeant la taille de la boîte d’entraînement de 8 à 14.

3. Conservation des particules

1. Téléchargez des carnets de notes à partir de https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
2. Ouvrez le bloc-notes CNN_Particle_Cleaning.ipynb et chargez les modules requis.
   REMARQUE : Le script utilise Open3D²⁸ comme package pour visualiser les coordonnées des particules sous forme de nuages de points 3D.
3. Chargez des fichiers texte correspondant aux coordonnées HA et M1 et visualisez-les sous forme de nuages de points 3D à l’aide du package Open3D.
4. Filtrez les valeurs aberrantes de coordonnées HA en utilisant la suppression statistique des valeurs aberrantes comme implémentée dans Open3D.
   REMARQUE : Les valeurs initiales suggérées pour HA sont nb_neighbors = 50 (nombre de coordonnées voisines autour d’une coordonnée) et std_ratio = 0,5.
5. Calculez la distance entre les nuages de points HA et M1. Toutes les coordonnées HA situées à plus de 20 pixels du nuage de points M1 seront alors identifiées comme une valeur aberrante. Toutes les coordonnées de particules non identifiées comme une valeur aberrante seront enregistrées dans un fichier .txt de sortie.
   REMARQUE : 20 pixels correspondent à une distance approximative de 16 nm avec une taille de pixel de 8,35 Å/pixel. Le centre d’un trimère HA par rapport à la couche M1 est d’environ 15 nm dans nos tomogrammes.
6. Concaténez toutes les particules et enregistrez-les en tant que fichiers stellaires à l’aide de pts2starfile.ipynb.

4. Calcul de la moyenne et classification itératifs du sous-tomogramme

1. À l’aide de WarpTools, extrayez les particules avec un facteur de compartimentage de 4 et effectuez les premiers cycles de sous-tomogramme en moyenne dans RELION4²⁹.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   REMARQUE : La taille de boîte suggérée est de 48 x 48 x 48 pixels, ce qui correspond à une boîte de ~360 ųqui serait assez grande pour contenir un tableau de 7 à 8 HA.
   1. Convertir le fichier étoile warp en fichier compatible RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Générez une référence initiale à l’aide de relion_refine_mpi sur un sous-ensemble de particules.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Utilisez relion_refine_mpi pour effectuer un auto-affinage 3D sur les sous-tomogrammes.
      1. Exemple de commande : mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         REMARQUE : L’échantillonnage global et local initial a été réglé à 7,5 et 1,8 degrés, ce qui correspond à un ordre de healpix de 4 et à un ordre de healpix local de 2. Les améliorations initiales exploitent principalement la forte densité de la membrane, la protéine M1 et le réseau HA. La plage de décalage de translation peut être plus grande pour englober les décalages qui peuvent se produire lors de l’alignement du tableau.
   4. Répétez l’affinement après la convergence de la première exécution d’affinement en changeant la translation en 8 et l’étape en 2.
2. Tirez parti de la classification 2D pour éliminer les particules indésirables à l’aide de relion_refine.
   1. Exemple de commande : relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      REMARQUE : La classification 2D a été utilisée à la place de la classification 3D, car elle est plus efficace en termes de calcul. Les sous-tomogrammes peuvent être directement utilisés comme entrée dans la tâche de classification 2D sans traitement d’image supplémentaire.
   2. Combinez des classes contenant une matrice HA identifiable contenant une densité cylindrique HA, une membrane et M1 à l’aide de relion_star_handler.
   3. Tout d’abord, créez des fichiers étoiles contenant de bonnes classes.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. Ensuite, utilisez la commande relion_star_handler suivante pour combiner les fichiers étoiles individuels.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Réextrayez au niveau bin2 et les particules non compartimentées pour un raffinement local itératif.
   1. Pour affiner bin2, extrayez les particules à l’aide d’une boîte plus petite de 80 et effectuez une recherche locale avec healpix et healpix local définis sur 4 (échantillonnage angulaire local de 1,8 degré).
   2. À ce stade, combinez des ensembles de particules provenant de différents ensembles de données à l’aide de relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. Après la première série de perfectionnement, créez un masque cylindrique à l’aide de e2filtertool.py dans l’environnement EMAN2 qui englobe la membrane centrale HA plus et la densité M1.
      REMARQUE : Paramètres utilisés pour le masque cylindrique : cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12 ; Tous les autres paramètres ne sont pas cochés.
   4. Effectuez un cycle supplémentaire de raffinement avec le masque appliqué.
   5. Effectuez une autre série de classifications 2D pour éliminer les valeurs aberrantes qui ne s’alignent pas avec l’HA central et les débris supplémentaires.
   6. Répétez le processus avec des particules non compartimentées d’une taille de boîte de 120 et créez un masque souple qui recouvre l’HA central, alignez la référence sur la symétrie C3 et appliquez la symétrie à cette étape de raffinement.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      REMARQUE : La résolution finale obtenue avec RELION était de 6,1 Å.
4. Raffinement final dans MTools⁹
   1. Création d’une population de raffinement (après activation de l’environnement Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Ajoutez des sources de données pour chaque ensemble de données.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Répétez l’étape précédente avec des jeux de données supplémentaires.
   3. Créez l’essence de raffinement.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Raffinement multiparticulaire.
      1. Affinez d’abord les poses de particules à l’aide de la commande : MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Par la suite, affinez à la fois les poses de particules et l’aberration sphérique à l’aide de la commande : MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         REMARQUE : Le raffinement a été arrêté ici car les itérations ultérieures n’ont pas amélioré la résolution. Cependant, différentes combinaisons de paramètres qui n’ont pas été testées de manière exhaustive peuvent continuer à améliorer les résultats.

5. Raffinement du modèle

1. À l’aide de ChimeraX³⁰, chargez la carte finale et un modèle atomique de HA.
2. Cartographiez et combinez tous les segments qui correspondent à l’ectodomaine HA, puis utilisez l’outil Ajuster aux segments pour ancrer dans le modèle HA.
   1. Enregistrez les coordonnées transformées du modèle.
3. Ouvrez l’interface graphique^{Phenix GUI 31} et utilisez l’outil Real Space Refinement .
   1. Lorsque vous êtes invité à ajouter des fichiers, ajoutez le modèle HA transformé et la carte, et remplissez la résolution de la reconstruction finale.
   2. Effectuez cinq séries de minimisation globale, d’ajustement du rotamère local, d’affinement de l’occupation et d’affinement de l’ADP de groupe.
4. Visualisez la reconstruction finale et le modèle à l’aide de ChimeraX.

Pour démontrer l’utilisation de ce protocole de traitement (figure 1), le flux de travail décrit précédemment a été appliqué à deux ensembles de données de 25 tomogrammes combinés, obtenus à partir d’une souche du virus de la grippe A H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934). Les paramètres de collecte des données sont décrits dans le tableau 1. La figure 2 illustre un tomogramme représentatif et des vues agrandies de virions grippaux pléomorphes. Des morphologies variées sont capturées dans ce tomogramme, car les virions varient de forme sphérique à ovale/allongée. Alors que la plupart des particules de la grippe contiennent des assemblages M1 et vRNP bien organisés, certains virions semblent être plus désorganisés et manquent de composants structurels cruciaux.

À partir de cet ensemble de données, un ensemble initial de 40 995 sous-tomogrammes a été utilisé pour la reconstruction de bin4 (8,35 Å/pix) après le prélèvement et la conservation des particules. Les deux ensembles de données ont d’abord été traités indépendamment en RELION4 avec une symétrie C1 et un masque sphérique large qui englobait l’ensemble du réseau HA. Trois cycles de raffinement ont été effectués pour ces sous-tomogrammes, suivis d’une classification 2D. Après la classification, les sous-tomogrammes mal résolus et les particules indésirables ont été éliminés ; les sous-tomogrammes restants ont été extraits à bin2 (4,17 Å/pix) et les deux ensembles de données ont été combinés. Les sous-tomogrammes Bin2 ont d’abord été alignés ensemble dans une série de moyennes de sous-tomogrammes, puis un masque cylindrique autour de l’HA central a été appliqué pour l’alignement de la mise au point. À ce stade, la symétrie trimérique peut être clairement visualisée pour la reconstruction de l’HA. Des cycles supplémentaires de raffinement ont été effectués à bin2 et à 2,8 Å/pix. Un dernier tour de classification 2D a été effectué avec un petit masque couvrant uniquement le trimère HA central avec des sous-tomogrammes alignés. La classe principale, composée de ~94 % des sous-tomogrammes restants, a été extraite en particules non binées et soumise à un raffinement 3D avec une symétrie C3 appliquée. Enfin, ces sous-tomogrammes ont été exportés vers M, où les poses des particules et les cycles de raffinement des aberrations sphériques ont été effectués (figure supplémentaire 1).

La moyenne finale du sous-tomogramme (figure 3A), composée de 15 970 particules HA, a atteint une résolution globale de 6,0 Å et une plage de résolution locale de 5-7 Å (figure 4). Un modèle de PR8 HA a été affiné de manière flexible dans la masse volumique ; à FSC=0,5 et FSC=0,143, la résolution de la carte au modèle était de 8,1 Å et 6,6 Å, respectivement. L’architecture de la reconstruction HA ressemblait beaucoup aux cartes cryoEM et cryoET précédentes. À cette résolution, on peut distinguer des hélices alpha et des feuillets bêta (Figure 3B) ; de plus, les glycanes peuvent commencer à être identifiés à quatre sites de glycosylation sur la tête et la tige de l’AH (Figure 3C).

Nos résultats montrent l’adéquation de la cryoET dans la reconstruction de l’HA à partir de virions grippaux natifs. Grâce au protocole, la densité claire de la glycoprotéine cylindrique a été observée perpendiculairement à la membrane virale, et la résolution s’est améliorée à chaque étape. Pour ses propres données, il est suggéré que la moyenne du sous-tomogramme commence à partir d’une pile de particules compartimentée et que les résultats soient surveillés de près à chaque cycle de raffinement. Si la densité des glycoprotéines n’est pas apparente dès les premiers stades, il est recommandé de cartographier les emplacements du sous-tomogramme sur le tomogramme pour vérifier le positionnement précis. Sinon, on peut modifier les paramètres d’alignement ou mettre en œuvre des étapes de classification supplémentaires pour obtenir des résultats optimaux.

Figure 1 : Pipeline global pour la moyenne sous-tomogramme de l’HA à partir de la cryoET du virus de la grippe. Le panneau supérieur représente un flux de travail récapitulatif pour les deux jeux de données utilisés pour illustrer le protocole. Le deuxième panneau correspond à la section 1 du protocole, le troisième panneau correspond aux sections 2-3 et le quatrième panneau correspond aux sections 4-5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Tomographie représentative du virus de la grippe PR8. (A) Coupe à travers un tomogramme reconstruit. La barre d’échelle est de 100 nm. (B-D) Zoom avant vue (B) sphérique, (C) cylindrique, (D) virion PR8 sans M1. Toutes les barres d’échelle en B-D correspondent à 50 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Moyenne du sous-tomogramme de PR8 HA. (A) Vue de dessus et de côté de la reconstruction HA à deux niveaux de contour ajustée de manière flexible avec une structure cryoEM à particule unique PR8 HA. (B) Vues coupées à travers la reconstruction de HA. Les flèches colorées correspondent à des cases colorées. (C) Reconstruction de l’AH montrée sur le contour inférieur pour révéler la densité des glycanes. Des vues rapprochées des glycanes dans la représentation en bâtonnet dans la carte cryoET sont également montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Estimation de la résolution de la moyenne du sous-tomogramme HA. (A) Estimation de la résolution locale de la moyenne du sous-tomogramme HA cartographiée sur la reconstruction. La barre de couleur représente 5-7 Å sur la palette bleu-blanc-rouge. (B) Courbes FSC des demi-cartes et de la résolution carte-modèle. La courbe bleue est celle de la reconstruction non masquée, et la rouge est celle du masqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Paramètres de collecte de données pour les ensembles de données cryoET du virus de la grippe PR8.

Figure supplémentaire 1 : Calcul de la moyenne du flux de travail par sous-tomogramme pour l’AH. L’alignement itératif, le calcul de la moyenne et la classification sont effectués pour les sous-tomogrammes HA par débinage progressif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.