Article de méthode

Méthode peu invasive de génération d’un modèle murin orthotopique syngénique de cancer du poumon

DOI :

10.3791/68676

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19 août 2025

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1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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L’un des principaux défis du développement de nouvelles thérapies pour le cancer du poumon consiste à modéliser le microenvironnement tumoral à mesure que la maladie régionale progresse vers une maladie métastatique. Ici, nous décrivons une méthode simple d’établissement d’un modèle syngénique orthotopique du cancer du poumon qui permet un suivi in vivo de la maladie au fil du temps.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) continue d’être la première cause de décès par cancer chez les femmes et les hommes dans le monde. Davantage d’informations doivent être recueillies pour comprendre les interactions entre les cellules cancéreuses, le système immunitaire, le microenvironnement au sein de chaque tumeur et le tissu hôte afin de développer des modalités de traitement plus efficaces. Il s’agit d’une méthode simple et reproductible pour induire le cancer dans le poumon de la souris, permettant de surveiller la croissance tumorale du stade précoce à la fin de la maladie. L’intervention chirurgicale implique une petite incision superficielle dans la peau et une injection de cellules cancéreuses à travers les muscles intercostaux dans le poumon. Les systèmes d’imagerie in vivo (IVIS), en combinaison avec des cellules modifiées pour exprimer la luciférase, offrent un moyen pratique d’évaluer la croissance tumorale et la progression de la maladie au cours d’une étude. Cette technique est facilement transférable à travers divers modèles de cancer du poumon et peut être utilisée pour tester la faisabilité et l’efficacité de nouvelles thérapies dans un modèle préclinique de cancer du poumon qui imite le microenvironnement tumoral naturel. Cela élargit la pertinence des études d’efficacité et d’innocuité/toxicité utilisant des traitements standard, y compris la résection chirurgicale, la radiothérapie et les immunothérapies en conjonction avec des thérapies expérimentales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cancer du poumon continue d’être l’un des cancers les plus diagnostiqués et la première cause de décès lié au cancer chez les hommes et les femmes dans le monde 1,2,3. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente près de 90 % de tous les cas de cancer du poumon aux États-Unis, et bien que le paysage thérapeutique se soit considérablement amélioré au cours des dernières années, il continue d’y avoir beaucoup d’intérêt pour le développement de nouvelles thérapies qui améliorent les résultats4. Bien qu’il y ait eu de nombreux progrès dans le développement de thérapies ciblées pour des mutations motrices spécifiques et d’immunothérapies pour les sous-types de CPNPC réactifs, le taux de survie global à cinq ans continue d’être faible, se situant autour de 20 % pour tous les stades du cancer du poumon 2,5,6,7. De plus, bien que l’immunothérapie ait fait d’énormes progrès dans l’amélioration de la survie à un stade avancé de la maladie, ces améliorations n’ont fait que faire passer une survie globale à cinq ans de 6,8 % à 10,7 % et augmenter la durée de survie de 7 mois à 8 mois8. Il reste encore un grand besoin de comprendre les mécanismes d’action de la maladie et de développer de nouvelles thérapies qui synergisent avec les thérapies standard actuelles. La compréhension des mécanismes à l’œuvre de la progression naturelle du CPNPC et de la réponse aux nouvelles thérapies nécessite des modèles précliniques reproductibles de manière fiable, faciles à induire et encapsulant le microenvironnement tumoral dans lequel le cancer se développe.

Au cours des dernières décennies, de nombreuses procédures différentes ont été développées pour évaluer des modèles orthotopiques de cancer du poumon chez les rongeurs. Les procédures vont de très invasives, nécessitant un haut niveau d’expertise, telles que les procédures d’implantation intrapulmonaire ou de transplantation qui ouvrent la cavité thoracique 9,10,11,12,13 ; modérément invasives comme les procédures intratrachéales et orotrachéales 14,15,16,17 ; à des procédures peu invasives, telles que les injections percutanées, la veine de la queue ou l’induction intranasale 18,19,20,21. Toutes les procédures offrent des risques et des avantages différents - avec des techniques plus invasives permettant plus de précision mais des taux d’attrition potentiellement plus élevés, et des techniques moins invasives permettant une meilleure survie mais une plus grande variabilité des sites d’implantation tumorale. Parmi ces différents protocoles, certains choisissent de ne pas suivre la croissance tumorale in vivo et de ne compléter que les évaluations des tumeurs ex vivo 9,11,12,16. Parmi les protocoles qui suivent la croissance tumorale au fil du temps, les protocoles antérieurs reposent davantage sur des systèmes tels que la tomodensitométrie (TDM)14,19, la tomographie par émission de position (TEP)18 et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)17, tandis que les protocoles ultérieurs, après que les systèmes d’imagerie par bioluminescence (BLI) et les cellules génétiquement modifiées sont devenus plus facilement disponibles, optent pour le suivi de la croissance tumorale au fil du temps avec BLI20, 21. Aéroport de Lyna

L’objectif de l’élaboration de ce protocole était de tirer les leçons de ces autres procédures et de créer une méthode simple mais fiable d’induction d’une tumeur pulmonaire solitaire pour étudier la progression du CPNPC à partir du stade précoce de la maladie, où la tumeur est confinée au poumon. L’objectif général de cet article est de décrire les méthodes permettant de générer un modèle murin orthotopique syngénique fiable et peu invasif du cancer du poumon qui peut être surveillé à l’aide de l’imagerie in vivo et peut permettre aux chercheurs d’étudier le cancer du poumon dans l’organe à partir duquel la maladie survient. Cette méthode est efficace pour générer à la fois des modèles de souris orthotopiques de xénogreffe à l’aide de lignées cellulaires de cancer du poumon humain et des modèles de souris orthotopiques syngéniques utilisant des lignées cellulaires de cancer du poumon de souris chez des souris dont le système immunitaire est intact, ce qui confère une polyvalence à la méthode d’étude des types de cancer humain et de l’interaction complexe du système immunitaire et du CPNPC.

Nous nous sommes concentrés sur l’optimisation de ce protocole dans le modèle murin de CPNPC compétent sur le plan immunitaire, le carcinome pulmonaire de Lewis (LLC), car ce modèle permet aux chercheurs de mieux comprendre la réponse du système immunitaire avec et sans thérapies actuelles telles que la chimiothérapie, la radiothérapie, l’immunothérapie et d’autres thérapies ciblées.. Le protocole génère un modèle représentatif d’une maladie à un stade précoce lors de l’inoculation (tumeur dans le parenchyme pulmonaire) et de métastases vers la fin des études, car la tumeur dépasse souvent le parenchyme pulmonaire et ensemence d’autres tissus.

Un aspect important de l’étude des modèles orthotopiques est la capacité de suivre la croissance tumorale de manière répétée, avec un stress minimal pour l’animal, et rapidement afin que chaque animal d’une étude puisse être évalué à un seul moment donné. Bien que les techniques d’imagerie telles que l’IRM ou la tomodensitométrie permettent d’améliorer la résolution de la tumeur, ces modalités d’imagerie sont coûteuses, prennent du temps et ont du mal à suivre la croissance précoce de la tumeur dans les petits modèles animaux tels que les souris 26,27,28,29,30,31. Par conséquent, nous avons choisi de surveiller la croissance tumorale par bioluminescence en utilisant des cellules cancéreuses modifiées avec de la luciférase. Dans ce protocole, nous avons injecté 25 000 à 50 000 cellules LLC modifiées avec de la luciférase de luciférase (LLC-luc) et détecté les tumeurs dès le lendemain par BLI. La réaction luciférine-luciférase est un outil utile pour suivre la croissance tumorale in vivo à l’aide d’instruments d’imagerie spectrale. En raison de la sensibilité de ces systèmes d’imagerie à suivre les photons de lumière, les cellules cancéreuses exprimant la luciférase peuvent être suivies in vivo tôt, souvent avant que les tumeurs ne puissent être détectées dans un modèle murin par IRM ou CT, et fréquemment 26,32,33,34.

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Protocole

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Toutes les procédures impliquant des animaux sont examinées et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Iowa (IACUC). Les souris C57BL6/N (âgées de 4 à 6 semaines) sont achetées et acclimatées pendant au moins 1 semaine avant les chirurgies. Tous les animaux sont sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Les animaux sont logés à 4 par cage et ont un accès complet à la nourriture et à l’eau jusqu’au moment de l’anesthésie.

1. Sélection et croissance des cellules pour l’injection

  1. Effectuez un test de luciférase pour sélectionner une lignée cellulaire comme décrit en35.
    1. Cultivez des cellules LLC-luc dans un milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de la L-glutamine et de la pénicilline/streptomycine dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C avec une humidité élevée. Effectuez le test lorsque les cellules sont confluentes à 50 % à 100 %.
    2. Avant d’effectuer le test, lavez les cellules avec 1x PBS.
    3. Ajouter 200 μL de tampon/puits de lyse (25 mM de Tris/phosphate, 4 mM d’EGTA, 1 % de Triton X-100, 10 % de glycérol) dans une plaque à 6 puits. Grattez les cellules du puits et transférez-les dans un tube de microcentrifugation. Faites tourner les cellules à 16 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Confirmez qu’une pastille de cellules compactes se forme au fond du tube et collectez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.
    4. Transférez la moitié de l’extrait cellulaire dans un nouveau tube de microcentrifugation et enregistrez-la pour la quantification des protéines. Ajouter 2 mM de dithiothreitol à la moitié restante et bien mélanger.
    5. Combinez 8 μL d’extrait cellulaire contenant 2 mM de dithiothréitol avec 42 μL de tampon de dosage (25 mM de Tris/phosphate, 20 mM de MgSO4, 4 mM d’EGTA, 2 mM d’ATP, 1 mM de dithiothréitol). Ajouter 50 μL de luciférine de 0,5 à 1 mM.
    6. Mesurez la luminescence maximale exprimée en unités de lumière relative (RLU) et évaluez la teneur en protéines à l’aide d’une méthode de quantification protéique privilégiée pour signaler la luminescence en RLU par mg de protéine (RLU/mg).
  2. Sélectionnez une lignée cellulaire avec une luminescence comprise entre 8 000 et 15 000 RLU/mg.
    REMARQUE : Évitez de choisir une expression de luciférase plus élevée (>15 000 RLU/mg) car cela pourrait saturer l’instrument BLI.

2. Préparation des cellules

  1. Cultivez des cellules LLC-luc dans du DMEM complété par 10 % de FBS, de la L-glutamine et de la pénicilline/streptomycine dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C avec une humidité élevée pendant au moins 1 semaine avant utilisation.
    REMARQUE : Surveiller la croissance pour limiter la confluence à 70 % à 80 % et diviser à l’aide de 0,25 % de trypsine-EDTA au besoin pour atteindre la quantité désirée pour les injections, comme décrit précédemment36.

3. Préparation préopératoire

  1. Pour les souris à fourrure, rasez-vous 1 jour avant l’opération.
  2. Placez la souris dans une chambre d’induction pour l’anesthésier à l’aide d’isoflurane. Réglez le débit d’oxygène à 2,0 L/min et le vaporisateur à 2 % d’isoflurane ; Ajustez-le en fonction de la taille de la souris induite.
  3. Surveillez la respiration des souris et utilisez un réflexe de retrait de la pédale pour confirmer l’anesthésie appropriée.
  4. Placez la souris dans un cône nasal en position couchée sur un appareil de réchauffement approuvé par l’IACUC. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée à l’aide du réflexe de retrait de la pédale avant de continuer.
  5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux.
  6. Lorsque la souris est correctement anesthésiée, utilisez une tondeuse électrique pour retirer une grande zone rectangulaire (2 cm x 3 cm) dans la partie dorsale gauche de la souris. Rasez jusqu’à la colonne vertébrale médialement, la table latéralement jusqu’à ce qu’aucune fourrure ne soit visible, la dernière côte (13e) vers le bas et le bord supérieur de l’omoplate vers la tête.
  7. Placez la souris dans une cage vide sur un appareil de réchauffement approuvé par l’IACUC et observez la respiration de la souris jusqu’à ce qu’elle soit réveillée et alerte. À ce moment, retournez la souris dans sa cage d’origine jusqu’à l’opération.

4. Préparation de la suspension cellulaire pour injection

  1. Le jour du prélèvement des cellules (étape 2.2), ajouter un milieu frais contenant 50 mg/mL de gentamycine 3 à 4 h avant le prélèvement pour éliminer les cellules mortes et détachées.
  2. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec 1x PBS. Ajouter la trypsine-EDTA et incuber pendant 1 à 2 minutes à 37 °C.
  3. Dispersez les cellules et ajoutez un milieu pour neutraliser la trypsine. Prélever les cellules dans un tube conique de 50 ml.
  4. Essorer à 1 200 × g pendant 3 min à température ambiante. Confirmez qu’une pastille à cellules compactes se forme au fond du tube, aspirez le surnageant et lavez la pastille avec 1x PBS. Répétez cette étape 3 fois.
  5. Remettre en suspension la pastille de cellules dans 1x PBS à environ 1-2 millions de cellules/mL pour le comptage. Filtrer à travers une crépine de 40 μm avant de compter.
  6. Combinez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de Trypan Blue et comptez à l’aide d’un hémocytomètre. Faites une suspension cellulaire 2x et comptez les deux pour vérifier le nombre de cellules. Calculez le nombre total de cellules et la viabilité.
  7. Faites tourner les cellules à 1 200 × g pendant 3 minutes à température ambiante pour les remettre en suspension dans le volume d’injection final. Aspirer le PBS.
  8. Remettre les cellules en suspension dans 0,5 mg/mL de Matrigel dans 1 PBS jusqu’au nombre de cellules souhaité par injection dans un volume de 50 μL. Maintenir la suspension cellulaire finale sur de la glace tout au long de la procédure pour éviter la solidification.
    REMARQUE : Ce protocole utilise des cellules LLC-luc. Injecter à une dose de 25 000 à 50 000 cellules dans un volume de 50 μL par souris.

5. Préparation chirurgicale

  1. Effectuez la procédure dans une salle d’opération approuvée par l’IACUC pour les procédures aseptiques. Nettoyez la table d’opération avec un désinfectant approuvé par un vétérinaire.
  2. Placez un coussin chauffant désinfecté approuvé par l’IACUC dans la zone chirurgicale. Posez un champ chirurgical stérile sur le coussin chauffant.

6. Anesthésie chirurgicale

  1. Placez la souris dans une chambre d’induction pour l’anesthésier à l’aide d’isoflurane. Réglez le débit d’oxygène à 2,0 L/min et le vaporisateur à 2 % d’isoflurane.
    REMARQUE : La concentration d’isoflurane peut être ajustée en fonction de la taille de la souris.
  2. Surveillez la respiration de la souris et utilisez un réflexe de retrait de la pédale pour confirmer l’anesthésie appropriée.
  3. Placez la souris dans un cône nasal en position couchée latérale droite sur le champ chirurgical stérile. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée à l’aide du réflexe de retrait de la pédale avant de continuer.
  4. Administrer un analgésique préopératoire, du méloxicam (2 mg/kg de poids) par voie sous-cutanée et une pommade ophtalmique dans les deux yeux.

7. Injection pulmonaire orthotopique

  1. Nettoyez le site chirurgical 3 fois en alternant entre 70 % d’éthanol et de bétadine à l’aide de gaze stérile. Placez sur la souris un champ chirurgical fenêtré stérilisé avec une ouverture de 3 cm x 4 cm. Placez des instruments stérilisés autoclavés sur le champ chirurgical.
  2. Déterminez où faire l’incision en localisant le bord crânien de l’omoplate et le bord caudal de la cage thoracique à l’aide d’une pince. Assurez-vous que la peau est tendue à l’aide du pouce et de l’index du chirurgien et faites une incision superficielle de 5 mm à travers la peau directement sous l’omoplate avec une lame de taille 10.
    REMARQUE : Le chirurgien doit porter des gants stériles.
  3. Utilisez des ciseaux droits de 115 mm pour disséquer la graisse sous-cutanée des côtes et des muscles intercostaux. Ne coupez pas les muscles intercostaux.
    REMARQUE : Veillez à ne pas endommager l’artère thoracodorsale et la branche profonde de l’artère cervicale transversale, qui sont situées près de l’omoplate. De légers saignements peuvent survenir en raison de la coupe des capillaires dans la peau et de la graisse sous-cutanée. Arrêtez le saignement en appliquant une légère pression avec un applicateur à embout de coton stérilisé.
  4. Utilisez une pince Micro-Adson pour maintenir l’incision ouverte. À partir de la septième vraie côte, utilisez une pince à pointe moyenne incurvée pour compter vers le haut afin d’identifier les côtes quatre et cinq. Notez cette zone pour l’injection.
  5. Mélangez la suspension cellulaire en inversant doucement 3-4x. Immédiatement avant l’injection, utilisez une seringue à insuline stérile de 300 μL 31 G de 8 mm pour prélever 50 μL de suspension cellulaire et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles.
  6. Ajoutez une bande de ruban métallique stérilisé de 4 mm d’épaisseur à l’aiguille, au ras de la seringue, pour agir comme un bouchon. Cela garantit que l’aiguille ne pénètre que 4 mm de profondeur dans le poumon.
  7. Injectez la suspension cellulaire de 50 μL directement en dessous de la quatrième côte dans l’espace intercostal entre les côtes quatre et cinq à un angle de 90° perpendiculaire au poumon. Après avoir injecté la suspension cellulaire, maintenez l’aiguille en place pendant 2-3 secondes pour permettre au Matrigel de durcir et empêcher les cellules de sortir du site d’injection.
  8. Retirez lentement l’aiguille dans le même angle et jetez-la dans un récipient pour objets tranchants.
  9. Suturez la peau à l’aide de 2 à 3 points de suture, en la fermant par des nœuds carrés, et ajoutez un adhésif chirurgical vétérinaire pour vous assurer que la plaie est suffisamment fermée.

8. Procédures postopératoires

  1. Placez la souris dans une cage vide sur un appareil de chauffage approuvé par l’IACUC. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie, ce qui devrait prendre 1 à 2 minutes.
  2. Une fois que la souris est alerte et en mouvement, placez-la dans une cage avec une litière fraîche. Observez fréquemment la souris au cours des 24 premières heures pour détecter tout signe de douleur ou d’infection.
  3. Administrer un analgésique AINS, le méloxicam (2 mg/kg de poids), par injection sous-cutanée pendant 2 jours après la chirurgie.

9. Suivi de la croissance tumorale par BLI in vivo

  1. Surveillez la croissance tumorale dans le poumon à l’aide de BLI dès le lendemain de la chirurgie et aussi souvent qu’une fois par jour.
  2. Réaliser une imagerie in vivo à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (IVIS).
    1. Maquiller la luciférine à 15 mg/mL dans 1x PBS sans magnésium ni calcium. Pour une souris de 20 g, cela équivaut à l’injection de 200 μL de la solution de luciférine à 15 mg/mL.
      REMARQUE : Protégez la solution de luciférine préparée de la lumière en la recouvrant d’une feuille d’aluminium lorsqu’elle n’est pas utilisée car elle est sensible à la lumière.
    2. Ouvrez le logiciel et définissez les paramètres de l’imagerie bioluminescente. Réglez le temps d’exposition sur Auto. Définissez le facteur de compartimentage sur 4.
    3. Injecter chez des souris par voie intrapéritonéale 150 mg de luciférine par kg de poids.
    4. Lorsque vous imagez pour la première fois un nouveau modèle de cellule cancéreuse, effectuez une courbe cinétique pour identifier le temps optimal d’absorption de la luciférine, qui est indiqué par le moment où la luminescence atteint son pic avant qu’elle ne commence à plafonner.
      1. Injectez de la luciférine chez des souris. Attendez 3 min pour que la luciférine pénètre.
      2. Image des souris toutes les 5 à 10 minutes pendant 60 minutes.
        REMARQUE : Le temps d’absorption optimal pour différentes lignées cellulaires varie généralement de 5 à 15 minutes.
    5. Pour toutes les séances d’imagerie ultérieures, utilisez le temps optimal d’absorption de la luciférine. Anesthésie les souris en vue de l’imagerie pendant ce temps. Placez les souris dans une chambre d’induction à 2 % d’isoflurane avec un débit de 2,0 L/min.
    6. Une fois l’adoption terminée, prenez deux images en sélectionnant Acquérir.
      1. Imaginez d’abord la souris allongée dans la position couchée latérale droite. Cela permet à la caméra de capturer le site d’injection, qui est situé sur la partie latérale gauche de la souris. Utilisez cette vue pour quantifier la croissance tumorale. Les images capturées dans cette position seront désignées à partir de maintenant comme une vue latérale gauche.
      2. Immédiatement après la fin de la première image, prenez une deuxième image de la souris en position couchée. Cela permet à la caméra de capturer les photons émis par la tumeur dans la cavité thoracique à partir de la vue ventrale. Utilisez cette vue (ci-après dénommée vue ventrale) pour estimer l’emplacement du cancer dans la cavité thoracique.
  3. Pour analyser les images, remplacez les unités Nombre par Radiance.
  4. Ouvrez la palette des outils. Allez dans Réglage de l’image, sélectionnez Manuel. Choisissez un min et un max pour la barre de couleur qui convient le mieux aux images prises.
  5. Ouvrez Outils de retour sur investissement. Sélectionnez la liste déroulante des cercles pour ajouter un cercle de région d’intérêt (ROI) à l’image. Déplacez le cercle sur l’incision pour la vue latérale gauche et sur le centre de la poitrine pour la vue ventrale.
  6. Sélectionnez Mesurer le retour sur investissement.

10. Appréciation des critères d’inclusion et d’exclusion

  1. Tout d’abord, confirmez la présence de la luminescence tumorale dans le poumon en observant l’image de la vue latérale gauche.
  2. Ensuite, confirmez la présence d’une luminescence tumorale dans la cavité thoracique gauche dans l’image de la vue ventrale. Ensuite, confirmez qu’il n’y a qu’un seul site de luminescence à partir de l’image de la vue ventrale.
  3. Si ces deux critères (étapes 10.1 et 10.2) sont respectés, il faut évaluer les critères d’exclusion en s’assurant que la luminescence ne traverse pas la ligne médiane de la cavité thoracique dans l’image de la vue ventrale. Si aucune luminescence n’est détectable dans l’image en vue latérale gauche après deux images IVIS consécutives au cours des 4 jours suivant la chirurgie, excluez cette souris des études ultérieures, car les cellules cancéreuses n’ont probablement pas pris.

11. Évaluation des tumeurs à la fin des études

  1. Lorsque le flux total de la luminescence tumorale atteint 1 × 108 photons/s (p/s) ou plus, récoltez les souris pour des évaluations des points finaux.
  2. Prélevez la tumeur pour une analyse anatomique macroscopique ou histologique en effectuant les étapes suivantes pour l’anesthésie et la perfusion du poumon, comme décrit précédemment37.
    1. Placez la souris dans une chambre d’induction pour l’anesthésier à l’aide d’isoflurane. Réglez le débit d’oxygène à 2,0 L/min et le vaporisateur à 2 % d’isoflurane. Surveillez la respiration de la souris et utilisez un réflexe de retrait de la pédale pour confirmer l’anesthésie appropriée.
      REMARQUE : La concentration d’isoflurane peut être ajustée en fonction de la taille de la souris.
    2. Placez la souris dans un cône nasal en position couchée. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée à l’aide du réflexe de retrait de la pédale avant de continuer.
    3. Ouvrez la cavité thoracique de la souris pour visualiser les poumons et le cœur derrière le diaphragme.
    4. Faites une longue coupe verticale vers le bas le long de la ligne médiane de la souris. Déplacez les intestins pour visualiser l’artère rénale gauche.
    5. Coupez à travers le diaphragme pour visualiser le cœur.
    6. Coupez l’artère rénale gauche.
    7. Injecter environ 5 à 10 ml de 1x PBS par le ventricule droit du cœur à une vitesse d’environ 5 ml/min.
    8. Faites une incision le long du cou. Éliminez toute graisse sous-cutanée située au-dessus de la trachée. Attention à ne pas couper la trachée.
    9. Percez la trachée parallèlement avec une aiguille pour injecter 10 % de formol directement dans la trachée afin de gonfler et de fixer les poumons.
    10. Procurez-vous les poumons de la cavité thoracique en coupant la trachée au-dessus de l’apex du poumon et coupez la plèvre et les ligaments attachant le poumon à la cavité thoracique.
    11. Placer dans du formol à 10 % pour fixer.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, des souris C57BL6/N ont été injectées selon le protocole présenté (Figure 1). Des cellules LLC génétiquement modifiées pour exprimer la luciférase (LLC-luc) ont été utilisées. De plus, une souris fictive a reçu une injection de Matrigel sans cellules cancéreuses. L’IRB sous IVIS peut être instauré dès 1 jour après la chirurgie. Cette étude LLC-luc a été optimisée sur BLI pour évaluer le cancer du poumon à un stade précoce. Le système BLI ut...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une procédure optimisée et peu invasive qui permet des temps de récupération rapides et une surveillance presque immédiate de la tumeur, ce qui diffère des méthodes chirurgicalement plus intenses décrites précédemment 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. et C.S.C. sont les fondateurs de Geminii, Inc. Les termes de cet arrangement ont été examinés et approuvés par le bureau de recherche sur les conflits d’intérêts de l’Université de l’Iowa. Tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier les membres des laboratoires Carter et Sheffield, Susan Walsh, Bryan Allen et Kranti Mapuskar pour leurs précieuses discussions. Nous tenons également à remercier Samantha Eckley, vétérinaire clinicienne principale au Bureau des ressources animales, pour ses conseils et ses conseils. Nous tenons à souligner l’utilisation du système d’imagerie IVIS Lumina S5 à la plateforme d’imagerie des petits animaux, une ressource essentielle soutenue par le Département de radiologie de l’Université de l’Iowa. Illustrations graphiques à partir de figures générées à l’aide de Biorender (https://biorender.com). Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), Free Radical Radiation Biology Program NCI T32CA078586 (S.C.H.), IVIS Lumina S5 Imaging System acheté le 1S10OD026835.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % de Trypsine-EDTA (1x)Gibco25200-056
Formaline tamponnée neutre à 10 %VWR16004-112
Plats traités en culture tissulaire de 100 mm x 20 mmDot Scientific Inc.667621
Éthanol pur à 190 degrésLaboratoires de décontamination2801
Seringue d’insuline 3/10 ml avec aiguille BD Ultra-Fine, 31 G x 5/16 in.Beckton Dickinson328438
Vétérinaire 3 ans3M1469SB
ATPSigmaA5394
Solution de bétadine 10 % antiseptique Povidone-iodeArvio Health L.P.67618-150-04
C57BL6/N SourisLaboratoires Charles River
Cell Strainer 40um Nylon & nbsp ;Faucon352340
Machine anesthésique compacteAnesthésie Vetamac   ;
Coussin de chauffage infrarouge lointain avec contrôleurKent Scientific Corporation & nbsp ;
Poignée de lame chirurgicale conventionnelle, taille 3Brad-Parker371030
Pinces courbes à point moyen polyvalentFisherbrand16-100-110
DithiothréitolProduits de recherche InternationalD11000
D-Luciferine (sel de sodium)Cayman Chemical14682
Drape, Chirurgical 18" x 26" Non fenestrat, stérileDealmed783410
Dulbecco » s Eagle Moyen Modifié (1x)Gibco11965-092
Dulbecco » s Solution tampon phosphate (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
Sérum fœtal bovinGibcoA5670402
Source lumineuse du microscope à fibre optique FL150Meiji & nbsp ;
Solution de sulfate de gentamycineIBI ScientificIB02030
GlycérolProduits de recherche InternationalG22025
IsofluranePrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer  ;
Logiciel d’image vivantePerkinElmer  ;
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Utilisez la lignée cellulaire cancéreuse qui correspondra le mieux aux besoins de l’étude & nbsp ;
Sulfate de magnésiumFisher ScientificM63
Matrice membranaire de socle MatrigelCorning354234
Porte-aiguille Mayo-Hegar, mâchoires dentelées de 6",Miltex8-44TC
Micro-Adson ForcepsOutils scientifiques finement10018-12
Coupe-pattes de chien N5 avec double lameOneisall  ;
Éponges en gaze non stériles à 12 contreplaquésNDCP157112
Optixcare Eye LubeAventix5914304
Pénicilline StreptomycineGibco15140-122
Suture en soie permanente à la main 6-0 1 x 18"Ethicon  ;K802H
Acide phosphorique 85 %Fisher ScientificA242
Scalpel taille 10, acier inoxydable, stérileCincinnati Surgical110
Tube à bouchon à vis conique 50 mLSarstedt62.547.100
Ciseaux de tissu 4,5" Staight PremiumOnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma BaseSigmaT1503
Trypan Blue Stain (0,4 %)Gibco15250-061
Ruban aluminium utilitaire avec linerIPGALF150L
Applicateurs en bois à extrémité de cotonNDC76200

Références

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