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Visualisation précise des récepteurs A et B de l’insuline dans le cerveau murin avec un test d’hybridation in situ de l’ARN

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DOI :

10.3791/68677

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15 juillet 2025

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1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

Nous avons mis au point un test d’hybridation in situ Duplex pour cartographier les isoformes IR-A et IR-B des récepteurs de l’insuline dans le plexus choroïde murin, surmontant ainsi les limites des méthodes traditionnelles. Cette approche à haute résolution révèle l’expression spécifique des isoformes, offrant de nouvelles perspectives sur la signalisation de l’insuline cérébrale et les thérapies potentielles ciblées sur les isoformes pour les troubles neurologiques.

Résumé

Les récepteurs de l’insuline (IR) sont largement exprimés dans tous les tissus et tous les types de cellules. Il existe sous deux isoformes fonctionnellement distinctes - IR-A et IR-B - différant par 12 acides aminés en raison de l’épissage alternatif de l’exon 11. Ces isoformes présentent des modèles d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules, leur abondance relative variant au cours du développement, du vieillissement et de la maladie. En raison de leur grande similitude de séquence, il a été difficile de faire la distinction entre l’IR-A et l’IR-B à l’aide de méthodes immunologiques traditionnelles. Ici, nous décrivons un nouveau test d’hybridation in situ duplex (ISH) qui permet de visualiser l’expression de l’IR-A et de l’IR-B dans les tissus. En utilisant cette approche, nous démontrons pour la première fois que si les deux isoformes sont exprimées dans le plexus choroïde murin, l’IR-A est prédominant. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la distribution spatiale des isoformes des récepteurs de l’insuline in situ dans différents tissus. Bien que la qPCR en temps réel puisse détecter les transcrits IR-A et IR-B dans les cultures monocellulaires in vitro , elle n’a pas la capacité de localisation spatiale dans les tissus complexes, ce qui souligne la nécessité et l’utilité de la technique Duplex ISH.

Introduction

Le récepteur de l’insuline (IR) est un récepteur enzymatique transmembranaire à passage unique qui médie les divers effets physiologiques de l’insuline. Il fonctionne comme une protéine dimérique, chaque monomère étant composé de deux chaînes peptidiques liées par une liaison disulfure : la sous-unité α extracellulaire, qui contient le domaine de liaison au ligand, et la sous-unité β transmembranaire, dont la séquence intracellulaire possède une activité tyrosine kinase intrinsèque1. Grâce à l’épissage alternatif de l’exon 11, la transcription du gène IR donne naissance à deux variantes d’ARNm IR. L’IR-A n’a pas l’exon 11, tandis que l’IR-B le conserve. Par conséquent, IR-A et IR-B diffèrent par une séquence de 12 acides aminés près de l’extrémité C-terminale de la sous-unité α, ce qui entraîne une liaison distincte des facteurs de croissance en plus de l’insuline mature et des propriétés de signalisation variables en aval. Alors que les deux variants présentent une affinité similaire pour l’insuline, l’IR-A a une affinité plus élevée pour le facteur de croissance analogue à l’insuline II (IGF-II) et la proinsuline par rapport à l’IR-B. Les profils d’expression de l’IR-A et de l’IR-B varient en fonction du type de tissu et de cellule, et de l’état2 de la maladie.

Leur expression différentielle dans les tissus et les maladies souligne leur contribution unique à la physiologie et à la pathologie. Le plexus choroïde (CP), une structure spécialisée qui produit du liquide céphalo-rachidien (LCR) et fait partie de la barrière hémato-LCR, joue un rôle essentiel dans le transport des nutriments, l’élimination des déchets et la neuroprotection, en particulier pendant l’inflammation. Les deux isoformes IR sont exprimées dans la CP, où elles régulent probablement le volume et la composition du LCR. L’IR-A, grâce à sa liaison de haute affinité par l’IGF-II, favorise probablement la prolifération cellulaire et la réparation tissulaire dans l’épithélium de la CP. L’IR-B, quant à lui, est impliqué dans le transport de l’insuline à travers la barrière hémato-LCR, soutenant la disponibilité de l’insuline dans le cerveau pour les astrocytes, les neurones, la glie et l’homéostasie du glucose 3,4.

Les taux d’IR prédiabétiques ont été associés à une élévation de la protéine tau du LCR chez les individus asymptomatiques présentant un risque génétique de maladie d’Alzheimer (MA)5, et les altérations du rapport IR-A/IR-B ont été associées à la résistance à l’insuline, au vieillissement et à l’augmentation de l’activité proliférative - facteurs pouvant contribuer au cancer et à d’autres pathologies6. L’identification des modèles d’expression spécifiques aux isoformes de l’IR-A et de l’IR-B représente une étape cruciale vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les troubles complexes du système nerveux central. Cependant, les approches actuelles, telles que l’immunomarquage et la qPCR, sont limitées : toutes les protéines ne peuvent pas être immunomarquées de manière fiable en raison d’un manque d’anticorps validés, et bien que la qPCR soit très spécifique, elle manque de résolution spatiale.

Pour surmonter ces limitations, nous avons utilisé l’hybridation in situ Duplex (ISH), une technologie avancée de détection d’ARN basée sur la plateforme RNAscope BaseScope. Ce test utilise une conception unique de sonde double-Z qui nécessite une liaison en tandem à l’ARN cible, ce qui permet une spécificité et une sensibilité élevées, même pour les transcrits de faible abondance. Le signal fluorescent ou chromogène est amplifié par de multiples événements de liaison à la sonde, ce qui améliore la détection et réduit le bruit de fond7. Contrairement au RNAscope standard, ce test est optimisé pour détecter de courtes séquences d’ARN (50-300 bases), ce qui le rend particulièrement adapté à l’identification d’événements d’épissage alternatifs, de variants mononucléotidiques et de transcrits rares dans des tissus complexes comme le cerveau8.

Ce test visualise les cibles simultanément sous forme de signaux chromogènes verts (C1) et rouges (C2) distincts en fond clair. Il garantit le succès en utilisant des tissus fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) ou du formol tamponné neutre à 10 % (NBF) et sectionnés à 5 μm-15 μm (congelés/FFPE), contenant de l’ARN d’abondance faible à élevée. En raison de la sensibilité à la dégradation de l’ARN, à la surfixation et aux erreurs de sonde, nous devons optimiser le prétraitement, la conception de la sonde et les contrôles pour maximiser la spécificité et minimiser le bruit de fond. Ici, nous avons appliqué ce test Duplex ISH pour caractériser les modèles d’expression de l’IR-A et de l’IR-B dans la PC murine, offrant ainsi de nouvelles perspectives sur la biologie spatiale des isoformes de l’IR et leurs rôles possibles dans la santé et la maladie du cerveau.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le National Institute on Aging (NIA), qui est entièrement accrédité par l’American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Les protocoles ont été examinés et approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux du Programme de recherche intra-muros du NIA. Les souris ont été logées dans une installation à température contrôlée selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures, avec un accès ad libitum à de l’eau et à de la nourriture standard, sauf indication contraire. Des souris mâles C57BL/6J ont été obtenues du Jackson Laboratory et utilisées pour des expériences à l’âge de 3 à 4 mois.

1. Correction de la préparation des échantillons congelés

  1. Perfuser la souris avec du PFA à 4 % fraîchement préparé dans 1x PBS et placer tout le cerveau dans du PFA à 4 % fraîchement préparé pendant 17 à 24 h à 4 °C.
    REMARQUE : Mouchoir placé dans un PFA à 4 % (10 mL pour chaque cerveau) pendant pas plus de 24 h.
  2. Immerger le mouchoir dans du saccharose à 10 % (10 ml) dans 1 PBS à 4 °C jusqu’à ce que le mouchoir coule au fond du contenant. Ensuite, transférez séquentiellement le tissu à 20 % de saccharose et enfin à 30 % de saccharose, en lui permettant de couler à chaque étape.
    REMARQUE : Le temps nécessaire au mouchoir pour couler varie selon le type et la taille du tissu. Pour le tissu cérébral, il faut environ 18 h.
  3. Congelez le tissu dans un support d’enrobage OCT et conservez les blocs de tissu dans un contenant hermétique à -80 °C.
  4. Sectionner coronalement les tissus cérébraux congelés fixés au formaldéhyde en tranches de 10 μm et les stocker à −80 °C jusqu’à l’utilisation.
    REMARQUE : Montez les sections sur des lames de microscope chargées positivement ; D’autres types de lames peuvent entraîner une perte de tissu. Si les lames ne sont pas utilisées immédiatement, conservez-les à -80 °C jusqu’à 3 mois.

2. Prétraitement de la section avant le test de détection duplex

  1. Le jour du test, lavez les lames dans 1x PBS pendant 5 min, en déplaçant doucement le support de lames de haut en bas pour éliminer tout ECT résiduel.
  2. Faites cuire les lames à 60 °C pendant 30 min.
  3. Post-fixer les lames dans du PFA pré-réfrigéré à 4 % dans 1x PBS pendant 15 min à 4 °C.
  4. Transférez les lames séquentiellement à travers une série d’EtOH : 50 % d’EtOH pendant 5 min à RT, 70 % d’EtOH pendant 5 min à RT, 100 % d’EtOH pendant 5 min à RT, 100 % d’EtOH à nouveau pendant 5 min à RT.
  5. Glissades sèches à l’air libre pendant 5 min à RT.
  6. Appliquez 2 à 4 gouttes de peroxyde d’hydrogène sur chaque section et incubez pendant 10 min à RT. Rincez une fois à l’eau distillée.
  7. Préparez 700 ml de solution fraîche 1x Target Retrieval dans un bécher. Couvrir de papier d’aluminium et porter à ébullition (99-100 °C).
    REMARQUE : Ne pas faire bouillir plus de 30 minutes avant utilisation. Pendant ce temps, préchauffez le four (voir le tableau des matériaux) à 40 °C.
  8. Plongez délicatement la grille de la lame dans la solution bouillante de récupération de la cible et incubez pendant 5 min. Maintenez la température entre 98 et 102 °C et surveillez de près.
    REMARQUE : Le temps d’ébullition peut devoir être ajusté (5 à 15 min) selon le type de tissu.
  9. Transférez immédiatement la grille de la glissière chaude dans un plat avec de l’eau distillée, en déplaçant la grille de haut en bas de 3 à 5 fois. Répétez l’opération avec de l’eau fraîche distillée.
  10. Rincez les lames avec de l’EtOH frais à 100 %, en les déplaçant de haut en bas 3 à 5 fois. Sécher les lames à l’air.
  11. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner autour de chaque section de tissu 2 à 3 fois. Laissez la barrière sécher complètement à RT.
  12. Placez les diapositives dans le bac de diapositives de traitement par lots. Ajoutez de la protéase (voir le tableau des matériaux) à chaque section, en vous assurant que le tissu est entièrement couvert. Incuber au four à 40 °C pendant 15 min.
    REMARQUE : Le temps d’incubation de la protéase peut nécessiter un ajustement en fonction du type de tissu et du gène cible.
  13. Sortez la plaque coulissante du four et placez-la dans de l’eau distillée. Lavez doucement les lames en les déplaçant de haut en bas pendant 2 min, en répétant cette étape 2 fois avec de l’eau distillée fraîche.

3. Test de détection duplex

  1. Sondes
    1. Préparez deux sections supplémentaires pour les sondes de contrôle positif et négatif.
    2. Sélectionnez des sondes de contrôle avec le même nombre de paires ZZ que la sonde cible. Pour 1 paire ZZ, utilisez une commande positive et une commande négative (voir le tableau des matériaux).
    3. Avant utilisation, équilibrez les sondes à 40 °C pendant 10 min et apportez les réactifs AMP1-12 à RT.
  2. Hybridation de sonde
    1. Faites tourner brièvement la sonde C2 et mélangez dans un rapport de 1:50 avec la sonde C1. Ajoutez suffisamment de mélange de sonde (100 à 200 μL) pour couvrir complètement chaque section et incubez les lames au four à 40 °C pendant 2 h. Lavez les lames pendant 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage à RT.
    2. Portée de base Duplex AMP1 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP1 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 30 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
    3. Application de base Duplex AMP2
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP2 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 30 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
    4. Application Duplex AMP3 de portée de base
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP3 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 15 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
        REMARQUE : Ne pas dépasser 15 min d’incubation.
    5. Portée de base Duplex AMP4 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP4 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 15 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
    6. Portée de base Duplex AMP5 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP5 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 30 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
    7. Portée de base Duplex AMP6 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP6 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 15 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
        REMARQUE : Comme pour l’AMP3, ne pas dépasser 15 min d’incubation.
    8. Portée de base Duplex AMP7 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP7 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section et incubez à température ambiante pendant 30 min.
        1. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
          REMARQUE : Incuber avec AMP7 à température ambiante (RT) pendant 30 min.
    9. Portée de base Duplex AMP8 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP8 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section et incubez à température ambiante pendant 15 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
        REMARQUE : Incuber avec l’incubation AMP8 pendant 15 min à RT.
    10. Détection du signal rouge (C2)
      1. Faites tourner brièvement le Fast Red-B et mélangez avec le Fast Red-A dans un rapport de 1:60.
      2. Appliquer sur chaque section (100 à 200 μL), couvrir le plateau et incuber pendant 10 minutes à RT dans l’obscurité.
      3. Laver 2x dans 1x tampon de lavage.
        REMARQUE : Utilisez une solution mélangée Fast Red dans les 5 min. Protéger de la lumière (soleil ou UV).
    11. Portée de base Duplex AMP9 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP9 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 15 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
    12. Portée de base Duplex AMP10 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP10 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Remettre au four et incuber à 40 °C pendant 15 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
    13. Portée de base Duplex AMP11 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP11 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Incuber à RT pendant 30 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
        REMARQUE : Incuber avec AMP11 à RT pendant 30 min.
    14. Portée de base Duplex AMP12 Application
      1. Retirez l’excès de tampon de lavage des lames et ajoutez de l’AMP12 (100 à 200 μL) pour couvrir entièrement chaque section. Incuber à RT pendant 15 min.
      2. Laver 2 x 2 min dans 1x tampon de lavage.
        REMARQUE : Ne pas dépasser 15 min d’incubation.
    15. Détection du signal vert (C1)
      1. Faites tourner brièvement le tube Fast Green-B et mélangez avec Fast Green-A dans un rapport de 1:50.
      2. Appliquez la solution GREEN sur chaque section (100 à 200 μL), couvrez le plateau et incubez pendant 10 min à RT.
      3. Laver pendant 5 minutes dans 1x tampon de lavage et rincer brièvement à l’eau distillée.
        REMARQUE : Utilisez une solution mélangée Fast Green dans les 5 min. Protéger de la lumière. Le rapport B à A vert est de 1:50. Les substrats ROUGE et VERT sont sensibles à l’alcool. N’utilisez pas de réactifs contenant de l’alcool.

4. Contre-teinture

  1. Immerger les lames dans une solution de coloration à l’hématoxyline à 50 % pendant 1 minute à RT jusqu’à ce que les sections apparaissent violettes.
  2. Rincez à l’eau du robinet 3 à 5 fois en bougeant de haut en bas. Répétez l’opération avec de l’eau fraîche du robinet jusqu’à ce que l’arrière-plan s’éclaircisse mais que les sections restent violettes.
  3. Tremper les glissières dans de l’eau d’ammoniac à 0,02 % de haut en bas 3 fois jusqu’à ce que les sections deviennent bleues.
  4. Rincer à nouveau à l’eau du robinet 3 à 5 fois.

5. Montage

  1. Sécher complètement les lames dans un four sec à 60 °C pendant ~15 min.
  2. Trempez les lames dans du xylène frais.
    REMARQUE : Comme le support de montage est assez visqueux, un bref trempage dans le xylène avant le montage facilite une répartition plus douce du milieu sur la section du tissu et réduit la formation de bulles d’air sous la lamelle.
  3. Appliquez un support de montage (voir le tableau des matériaux) sur la glissière et la lamelle, en évitant les bulles.
  4. Sécher les diapositives à l’air libre pendant au moins 5 min.

6. Évaluez les échantillons

  1. Imagez les coupes sous un microscope à fond clair standard à un grossissement de 20x ou 40x. (Figure 1).
    REMARQUE : Les commandes positives doivent afficher des points ponctués dans les cellules. Les contrôles négatifs sont acceptables s’il n’y a pas plus de 1 point par 20 cellules à un grossissement de 20x.

7. Notation (facultatif)

  1. Utilisez un logiciel d’analyse d’images (par exemple, Halo ou QuPath) pour quantifier les points d’ARN par cellule.

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Résultats

Le récepteur de l’insuline (IR) est un récepteur transmembranaire de la tyrosine kinase composé de deux sous-unités α extracellulaires et de deux sous-sous-unités β transmembranaires, formant un hétérotétramère fonctionnel. Les sous-unités α médient la liaison à l’insuline, tandis que les sous-sous-unités β possèdent une activité tyrosine kinase intrinsèque qui initie la signalisation en aval. L’épissage alternatif de l’ARNm IR de l’exon 11 génère deux isoformes de l’IR, l’IR-A et l’IR-B....

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Discussion

Au sein du cerveau, l’expression des récepteurs de l’insuline (IR) est hétérogène, avec des densités élevées observées dans des régions telles que le bulbe olfactif, l’hypothalamus, l’hippocampe et le plexus choroïde10. Une caractérisation complète des modèles d’expression des variants dans des régions cérébrales et des types de cellules spécifiques fournirait des informations cruciales, nous permettant d’étudier et de comprendre les rôles spécifiques de l’insulin...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros, le National Institute on Aging et les National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Eau d’ammoniumScience du microscope électronique  ;Référence 26754-4A
Kit de réactifs de détection BaseScope DulplexBiographie d’ACD323810
Sonde de contrôle positif BaseScope Dulplex Duplex - Souris (mm)-C1-PPIB-1ZZ/C2-POLR2A-1ZZBiographie d’ACD700121
Sonde de contrôle positif duplex BaseScope Dulplex-C1-DAPB-1ZZ/C2-DAPB-1ZZBiographie d’ACD700141
Hématoxyline I de GillSigma-AldrichGHS132-1L
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenN° A32731
HybEZ OVEN, plateau, grille et plateau de lavageBiographie d’ACD321721, 310012, 321716, 321717
Stylo barrière hydrophobe ImmEdgeLaboratoire vectorielH-4000
Sondes isoformes INSR A ET B : BA-MM-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2Biographie d’ACD717411, 717421-C2
Anticorps anti-récepteur de l’insulineSignalisation cellulaire  ;23413
RNAscope 10x Target RetrivalBiographie d’ACD322000
RNAscope Peroxyde d’hydrogène, Protéase PlusBiographie d’ACD322381
Citrate salin-sodique (SSC) 20xFisher ScientificBP1325-1
Toboggans SuperFrost PlusFisher Scientific12-550-18
Support de montage permanent VectaMountLaboratoire vectorielH-5000

Références

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Mots-clés

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