Création d’oscillations rapides de l’oxygène dans l’analyse de la croissance microbienne d’une cellule unique à l’aide d’un dispositif microfluidique à double couche

Résumé

Ce protocole présente une méthode de fabrication d’une puce microfluidique à double couche et d’analyse de la croissance microbienne sous des oscillations rapides de l’oxygène. Les performances de l’appareil ont été validées par la détection de l’oxygène dans les canaux fluides et la culture microbienne.

Résumé

L’analyse microbienne de cellules uniques à l’aide de la microfluidique couplée à la microscopie time-lapse est prometteuse pour l’étude du comportement de croissance microbienne dans des environnements confinés avec une résolution spatio-temporelle, offrant des informations qui ne peuvent pas être obtenues à partir de plateformes de culture et d’analyse conventionnelles. L’oxygène joue un rôle crucial dans la détermination de la croissance microbienne. Cependant, le contrôle temporel de l’ordre de quelques secondes n’a pas été mis en œuvre dans l’analyse microbienne à l’aide de la microfluidique. Nous avons récemment développé une puce microfluidique PDMS double couche permettant un contrôle temporel de l’oxygène de l’ordre de quelques dizaines de secondes. La puce comprend une couche supérieure pour le gazage et une couche inférieure pour la culture et la perfusion de fluides. Les deux couches sont séparées par une fine membrane PDMS intermédiaire, permettant un échange gazeux rapide entre les deux couches. Dans cet article méthodologique, nous expliquons la procédure de fabrication, de caractérisation et de culture microbienne de la puce à l’aide de la puce. En tant que résultats représentatifs, nous démontrons la capacité de commutation rapide de l’oxygène en quelques dizaines de secondes, la culture microbienne et l’analyse de la croissance résolue en temps dans des conditions d’oxygène constantes et oscillantes. Ce protocole vise à aider les chercheurs intéressés à mettre en œuvre le contrôle temporel de l’oxygène dans leur configuration microfluidique.

Introduction

L’oxygène est étroitement lié à la croissance microbienne et à la physiologie de divers facteurs environnementaux, affectant particulièrement les processus cellulaires tels que la réponse au stress oxydatif, l’homéostasie du fer et les infections pathogènes ^1,2,3. Traditionnellement, la culture microbienne a été menée dans des conditions ambiantes ou avec un contrôle minimal à des niveaux d’oxygène spécifiques. Dans des scénarios réalistes, en revanche, les environnements d’oxygène ne sont souvent pas constants dans de nombreux cas, mais fluctuent plutôt dans le temps. Par exemple, les microbes peuvent être exposés à des niveaux d’oxygène changeants en quelques secondes à quelques minutes dans les systèmes aquatiques lorsqu’ils se déplacent dans l’environnement en raison du mouvement des fluides et de la motilité microbienne ^4,5,6. De même, les bioréacteurs industriels créent également des environnements d’oxygène non homogènes en raison d’un mélange inadéquat, ce qui a un impact sur la croissance microbienne et le rendement final ^7,8. L’étude des réponses microbiennes à de telles conditions dynamiques est essentielle pour comprendre les processus écologiques et améliorer les applications biotechnologiques.

Les anaérobies facultatifs tels qu’Escherichia coli (E. coli) peuvent basculer entre les voies aérobies et anaérobies en fonction de la disponibilité de l’oxygène ^9,10. Bien que des recherches antérieures aient exploré cette adaptabilité métabolique, la plupart des études se concentrent sur des changements d’oxygène uniques à l’aide de systèmes de culture conventionnels, qui ne parviennent pas à reproduire les changements rapides auxquels les microbes sont souvent confrontés 9,11,12,13,14. Par conséquent, il existe une compréhension limitée de la façon dont les microbes réagissent physiologiquement aux niveaux d’oxygène qui changent fréquemment.

Comme nous l’avons mentionné, les configurations de laboratoire traditionnelles n’ont pas la précision et la vitesse nécessaires pour imiter les fluctuations rapides de l’oxygène et ne prennent pas en charge la surveillance continue à haute résolution. Pour y remédier, nous avons récemment développé une plateforme microfluidique spécialisée avec une puce polydiméthylsiloxane à double couche (PDMS), permettant un contrôle rapide de l’oxygène et l’imagerie unicellulaire¹⁵. Ici, nous fournissons des protocoles pour la fabrication d’une puce microfluidique à double couche qui crée des oscillations rapides de l’oxygène et permet l’analyse de la croissance microbienne d’une cellule unique dans des conditions d’oxygène contrôlées. La puce est composée de deux couches : une couche supérieure pour la perfusion de gaz et une couche inférieure pour la perfusion de fluides et la culture microbienne. La fine membrane intermédiaire entre les deux couches permet un échange rapide de gaz. À titre de démonstration, E. coli MG1655 a été cultivé dans la puce développée. La croissance dans des conditions d’oxygène constantes et oscillantes a été analysée.

Protocole

1. Préparation du moule

1. Préparez un moule pour la couche supérieure par impression 3D. Fabriquez le moule de la couche supérieure avec une surface lisse pour assurer une surface lisse de la couche supérieure PDMS résultante. Nous recommandons l’utilisation de l’impression 3D par stéréolithographie (SLA).
   1. Concevez le moule à l’aide d’un logiciel de CAO 3D (Figure 1A). Assurez-vous que la conception comprend des canaux de gaz qui chevauchent les canaux de liquide inférieurs. Effectuez ce processus de conception en parallèle de la conception de la couche inférieure (étape 1.2.1).
   2. Imprimez le moule à l’aide de l’impression 3D SLA. Retirez la résine restante du moule imprimé et lavez-la dans un bain d’alcool isopropylique (IPA) pendant 30 minutes (Figure 1B).
   3. Effectuez une post-polymérisation en exposant le moule à une lumière de 405 nm avec une durée et une température appropriées en fonction du type de résine et de la géométrie.
   4. Laissez le moule tremper dans de l’IPA dans un bain à ultrasons pendant 15 minutes pour éliminer la résine non polymérisée restante dans le moule, qui pourrait autrement inhiber le durcissement PDMS.
2. Préparez un moule à gaufrette de silicone pour la couche inférieure.
   1. Concevez la puce microfluidique à l’aide de l’éditeur de mise en page CAO (Figure 1C). Assurez-vous que la conception comprend des entrées, des canaux de fluide et des sorties.
   2. Créez un moule de plaquette de silicium à l’aide de la photolithographie à deux couches, comme décrit dans l’article précédent (Figure 1D)¹⁶.
      REMARQUE : Les canaux de la couche inférieure ont la taille de μm et nécessitent une fabrication précise, tandis que les canaux de la couche supérieure ont la taille de mm. Comme l’impression 3D SLA offre un temps de fabrication plus court et donc un prototypage plus rapide, l’impression SLA a été utilisée pour fabriquer des structures assez grandes pour le moule de la couche supérieure. La couche inférieure a été fabriquée par photolithographie pour assurer une fabrication précise. Si les canaux de la couche supérieure sont également de l’ordre du μm et nécessitent une précision, envisagez également de fabriquer un moule à l’aide de la photolithographie.

2. Fabrication de puces microfluidiques PDMS à double couche

1. Préparez la solution de pré-durcissement PDMS en mélangeant soigneusement la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Dégazez le mélange dans un dessiccateur pendant 1 h.
2. Nettoyez le moule de la couche supérieure avec de l’IPA et séchez-le à l’air comprimé.
3. Versez le PDMS dans le moule de la couche supérieure, suivi d’un durcissement thermique à 80 °C pendant 20 min (1ère étape^{de durcissement} , Figure 1E). La 1ère étape^{de durcissement} permet l’épluchage, la coupe et le poinçonnage du PDMS alors qu’il n’est pas complètement durci.
4. Vérifiez l’adhérence du PDMS à la main ou avec une pince à épiler après 20 min de chauffage. Si le PDMS est toujours collant, ajustez le temps de chauffage.
5. Décollez le PDMS du moule de la couche supérieure et coupez-le en morceaux uniques (ici 20 mm x 18 mm). Trous de perforation (diamètre = 0,75 mm) pour les entrées de gaz (Figure 1F). Nettoyez la surface inférieure de la couche supérieure en la rinçant avec de l’IPA, en la séchant à l’air comprimé et en fixant du ruban adhésif.
6. Nettoyez le moule de la couche inférieure avec de l’IPA et séchez-le à l’air comprimé. Fixez le moule de la couche inférieure sur une essoreuse et versez le PDMS au centre du moule. Versez le PDMS près de la plaquette pour réduire les bulles d’air. Si des bulles d’air sont trouvées après avoir versé le PDMS, déplacez-les vers l’extérieur à l’aide d’une pince à épiler ou d’aiguilles propres.
7. Appliquez le PDMS sur le moule de la couche inférieure à 1000 tr/min pendant 60 s, puis effectuez un durcissement thermique à 80 °C pendant 10 min (1ère étape^{de durcissement} , Figure 1G). Vérifiez l’adhérence du PDMS à la main ou à l’aide d’une pince à épiler après 10 minutes et ajustez le temps de chauffage si nécessaire.
8. Placez les pièces PDMS de la couche supérieure sur la couche PDMS inférieure du moule et appuyez fermement par le haut pour assurer la fixation en surface des couches supérieure et inférieure (Figure 1H).
9. Durcissez thermiquement complètement le PDMS à 80 °C pendant au moins 1 h (2^ème étape de durcissement). La 2e étape^{de durcissement} permet le durcissement final PDMS, où les couches supérieure et inférieure sont collées de manière irréversible (Figure 1H).
10. Coupez délicatement la couche inférieure du PDMS en morceaux. Décollez soigneusement l’intégralité de la puce PDMS du moule (Figure 1H).
    REMARQUE : Si les puces PDMS sont difficiles à décoller du moule, envisagez un traitement de surface supplémentaire du moule de la couche inférieure, tel que la silanisation et le revêtement de surface chimique, pour faciliter la procédure de pelage. Si les couches supérieure et inférieure se détachent lors du décollement, envisagez de raccourcir le temps pour la 1ère étape^{de durcissement} .
11. Perforations (diamètre = 0,5 mm) pour les entrées et sorties de fluide aux deux extrémités des canaux de fluide (Figure 1H). Nettoyez soigneusement la surface inférieure de la copeau en la rinçant avec de l’IPA, en la séchant à l’air comprimé et en fixant du ruban adhésif.
12. Collez la puce avec un verre de protection de 0,175 mm d’épaisseur après avoir activé la surface par oxydation au plasma (25 s, Figure 1H).
13. Après avoir placé la puce sur le substrat de verre, rincez la couche supérieure avec de l’air sous pression pour vous assurer que la couche inférieure de la membrane PDMS est correctement fixée au verre.
14. Chauffez la puce collée à 80 °C pendant 10 s à 1 min pour augmenter la stabilité de liaison.
    REMARQUE : L’étape de durcissement PDMS susmentionnée et le temps de durcissement requis peuvent être affectés par divers paramètres, tels que l’épaisseur du moule, l’équipement et les conditions ambiantes. Par conséquent, ajustez le temps de durcissement en conséquence au cas où le protocole suggéré ne conviendrait pas à l’application.

3. Dispositif expérimental

REMARQUE : Un microscope inversé équipé d’une caméra CMOS (semi-conducteur à oxyde métallique complémentaire), d’une caméra de microscopie à imagerie à durée de vie en fluorescence (FLIM) (domaine fréquentiel) et d’un incubateur de température est utilisé comme configuration expérimentale standard. Une source laser à excitation modulée (445 nm, 100 mW) est connectée à la caméra FLIM. Trois régulateurs de débit massique (azote, oxygène et dioxyde de carbone) sont utilisés pour le contrôle des gaz. Les pousse-seringues sont utilisés pour la perfusion moyenne.

1. Préparez les tubes pour la perfusion de gaz (entrée) et de fluide (entrée et sortie). Allumez l’incubateur pour atteindre la température souhaitée avant l’expérience (ici 37 °C).
2. Sélectionnez l’objectif de votre choix (ici, 20x pour la détection d’oxygène et 100x pour l’observation microbienne) et ajoutez de l’huile d’immersion si nécessaire. Fixez la puce double couche sur un porte-puce à l’aide d’adhésifs.

4. Contrôle et détection de l’oxygène sur puce

1. Préparez une solution de colorant sensible à l’oxygène avec une concentration appropriée (ici, 3 mM de tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthénium(II)hexahydraté, RTDP).
2. Calibrez la caméra FLIM à l’aide d’une diapositive de référence dont la durée de vie est connue (ici 3,75 ns). Mesurez l’intensité du signal à l’aide de la caméra FLIM et ajustez le temps d’exposition ou l’ouverture du microscope pour obtenir une intensité de signal de 0,68 à 0,72 pour un meilleur étalonnage.
3. Fixez le porte-puce sur la platine du microscope. Connectez les tubes appropriés à l’entrée et à la sortie du liquide. Commencez à perfuser une solution de colorant sensible à l’oxygène à un débit constant à l’aide d’une pompe à seringue (ici 100 nL/min).
4. Raccordez l’entrée de gaz et les régulateurs de débit massique à l’aide d’un tube approprié. Commencez à injecter le gaz avec une concentration d’oxygène contrôlée (ici 0 % ou 21 % d’oxygène, débit massique total 600 mL/min).
5. Mesurez la durée de vie de la phase en l’absence d’oxygène (τ₀) et à une autre concentration d’oxygène connue (ici à 21 %). Calculez la constante d’extinction (K_q) à l’aide de l’équation de Stern-Volmer comme suit, qui décrit l’extinction de fluorescence en présence d’oxygène. Alternativement, l’intensité de fluorescence (I) peut être utilisée ; Cependant, la mesure basée sur l’intensité peut être affectée par les variations d’intensité de la source lumineuse, le photoblanchiment, etc.
   
   REMARQUE : Il est recommandé d’attendre quelques minutes après le début du rinçage au gaz pour assurer un étalonnage précis, en particulier lorsque vous ciblez des niveaux d’appauvrissement en oxygène aussi bas que 0 %. Pour une meilleure précision, envisagez de compléter le processus avec des méthodes supplémentaires d’appauvrissement en oxygène, telles que l’utilisation de capteurs d’oxygène ou d’une configuration de chambre scellée supplémentaire.
6. Mesurez la durée de vie de la phase et calculez la concentration d’oxygène correspondante à l’aide de l’équation de Stern-Volmer. Pour créer des conditions d’oxygène oscillantes, utilisez n’importe quel système de contrôle d’instrument pour automatiser l’ajustement des débits volumiques d’azote et d’oxygène.

5. Préparation de la culture bactérienne

1. . Commencez une préculture en inoculant l’organisme de votre choix (ici, E. coli MG1655, une seule bille prête à l’emploi provenant d’un flacon cryogénique par flacon) dans le milieu de votre choix (ici, un milieu LB comprenant 10 g/L de peptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L de NaCl) et incubez pendant la nuit (ici, 37 °C à 150 tr/min).
2. Mesurez la densité optique résultante à l’aide d’un photomètre à 600 nm (OD₆₀₀).
3. Amorcez la culture suivante dans le milieu LB en inoculant la préculture (ici OD_{initiale 600} = 0,3 ou 0,0001). Incuber la culture jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase de croissance exponentielle.
   REMARQUE : Si le milieu de culture sur puce diffère du premier milieu de préculture, il est souhaitable d’effectuer une deuxième préculture avec le milieu de culture sur puce pour permettre aux organismes de se familiariser avec un nouveau milieu¹⁶.
4. Préparez une solution d’ensemencement en diluant la culture à une densité optique appropriée. Transférez la solution d’ensemencement dans une seringue de 1 mL pour l’étape suivante. Pour E. coli, la densité optique (DO₆₀₀) de la solution d’ensemencement était d’environ 0,5.

6. Culture microbienne sur puce et imagerie en accéléré dans des conditions d’oxygène contrôlé

1. Fixez le porte-puce sur la platine du microscope. Laissez le support de puce et la puce PDMS se réchauffer dans l’incubateur (ici 37 °C) pendant plusieurs heures, car cela réduira le risque de défocalisation lors de l’imagerie time-lapse en raison du déplacement associé à la température.
2. Avant de commencer la culture, commencez le gazage avec la concentration initiale d’oxygène souhaitée en ajustant le pourcentage volumétrique du débit massique d’oxygène et d’azote tout en maintenant le débit total et le débit de dioxyde de carbone constants.
3. Connectez l’entrée de gaz de la puce et les régulateurs de débit massique.
4. Ensemencez l’organisme dans la puce en connectant la seringue avec la solution d’ensemencement à la sortie du liquide et en poussant manuellement la seringue. Vérifiez au microscope si les cellules sont piégées avec succès dans les chambres de culture.
5. Après l’inoculation cellulaire, retirez la seringue et connectez une autre seringue avec le milieu frais à l’entrée du liquide. Poussez manuellement la seringue pour rincer toutes les cellules restantes dans le canal d’alimentation du fluide.
6. Commencez à perfuser le fluide à un débit constant (ici 100 nL/min) avec la pompe à seringue. Assurez-vous d’un débit suffisant, car un débit inadéquat peut entraîner l’assèchement de la chambre. Le débit suffisant peut varier en fonction de plusieurs facteurs, notamment de la géométrie du canal de fluide et du débit de gaz dans le canal de la couche supérieure.
7. Lancez l’acquisition d’images en accéléré. Pour la culture dans des conditions d’oxygène oscillant, démarrez le contrôle automatique des régulateurs de débit massique en même temps que l’acquisition de l’image. En cas de retard dans le démarrage du contrôle du gaz et de l’acquisition d’images, tenez compte du retard pour l’analyse ultérieure des données d’image.

7. Analyse des données d’image

1. Enregistrez l’image time-lapse sous la forme d’une pile d’images par position.
2. Prétraitez l’image pour faire pivoter, aligner et recadrer la colonie cultivée à l’aide de programmes d’analyse d’images. Exemples de pré-traitement . Les images TIF sont disponibles ici :^{https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747 15}
3. Segmentez les cellules et extrayez les valeurs pertinentes, telles que le nombre de cellules, la longueur, la surface, l’intensité de fluorescence, etc. Analysez davantage les comportements de croissance. Des exemples de scripts Python sont disponibles ici : https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Résultats

Fabrication de puces PDMS double couche
La puce à double couche fabriquée est représentée sur la figure 2A, avec des canaux de gaz colorés (rouge) et des canaux de fluide (bleu) pour la visualisation. La puce comporte trois canaux de fluide identiques et des canaux de gaz qui se chevauchent pour permettre des expériences parallèles. Le canal de fluide a une zone de culture avec une série de chambres de culture (Figure 2A(i)). Les cellules sont piégées à l’intérieur des chambres de culture et laissées se développer dans un format monocouche, ce qui permet une imagerie time-lapse haute résolution avec un taux d’acquisition d’images élevé. La section transversale de la puce illustre une couche supérieure de 3 mm d’épaisseur et des couches inférieures de 65 m d’épaisseur, permettant une diffusion rapide du gaz du canal de gaz au canal de fluide à travers la membrane intermédiaire PDMS (Figure 2A (ii-ii')).

Contrôle de l’oxygène sur puce
La capacité d’échange gazeux de la puce développée a été testée à l’aide de FLIM et d’un colorant sensible à l’oxygène¹⁵. Comme le montre la figure 2B, la concentration d’oxygène dans le canal fluide a montré une diminution ou une augmentation correspondante en quelques dizaines de secondes lorsque la concentration d’oxygène a été décalée entre 21 % et 0 %. Ces résultats de mesure de l’oxygène démontrent que l’oscillation rapide de l’oxygène en quelques dizaines de secondes peut être reproduite dans la puce microfluidique à double couche développée.

Culture microbienne dans des conditions d’oxygène constant
La puce a d’abord été utilisée pour caractériser la croissance facultative d’E. coli anaérobie dans des conditions gazeuses constantes avec diverses concentrations d’oxygène. Le dioxyde de carbone a toujours été ajouté au gaz d’alimentation, car nous avons observé une croissance limitée d’E. coli sous l’épuisement du dioxyde de carbone dans des expériences préliminaires (données non présentées). Les figures 3A et 3B représentent des images représentatives en contraste de phase d’E. coli dans des conditions aérobies (21 % d’apport en oxygène) et anaérobies (0 % d’apport en oxygène), respectivement. Après 3 h de culture, E. coli cultivé dans des conditions aérobies a donné lieu à des colonies plus grandes par rapport à des conditions anaérobies. L’analyse quantitative montre également différents taux d’augmentation de la taille de la colonie (_colonie A) en fonction de la disponibilité de l’oxygène, comme le montrent les courbes de croissance de la figure 3C. Notez qu’une_colonie est normalisée par la surface initiale pour permettre la comparaison sur différentes colonies et conditions. Le taux de croissance exponentiel μ peut être déterminé à partir de la courbe de croissance comme suit et résumé dans la figure 3D.

Les résultats valident la capacité de l’appareil à contrôler l’oxygène aux concentrations visées et à analyser efficacement la croissance microbienne correspondante à partir d’images accélérées acquises.

Culture microbienne dans des conditions d’oxygène oscillant
Enfin, E. coli a été cultivé dans des conditions d’oxygène oscillant, en alternant entre les phases de gazage aérobie et anaérobie avec un intervalle de commutation T'. Différents T’entre 60 min et 1 min ont été examinés pour tester la capacité d’analyse de la croissance résolue en temps en corrélation avec des conditions d’oxygène oscillant. La figure 4 illustre la croissance quantifiée d’E. coli dans des conditions d’oxygène oscillant avec T'= 60, 30, 10, 5, 2 et 1 min. En plus de la courbe de croissance basée sur une _colonie A, le taux de croissance instantané μ_Δt est également déterminé pour acquérir des informations résolues en temps comme suit.

Les taux de croissance dans des conditions aérobies et anaérobies constantes sont également indiqués par des lignes pointillées (μ_{21 %,} μ_{0 %)} sur la figure 4 comme références de croissance. La croissance d’E. coli présentait une dynamique distincte en réponse à des conditions gazeuses oscillantes. Par exemple, après que la phase de gazage soit passée de conditions aérobies à des conditions anaérobies (T'= 60 min), la croissance a montré (i) une phase de réponse : diminution soudaine du taux de croissance, suivie (ii) d’une phase de récupération : augmentation progressive du taux de croissance, et (iii) une phase de stabilisation : stabilisation de la croissance autour de μ_{0 %.} La dynamique de croissance d’E. coli a été résolue temporellement avec succès sous divers T’aussi courts que 1 min, où E. coli a montré un taux de croissance monotone à la hausse et à la baisse en raison du temps limité pour adapter la croissance aux conditions gazeuses changeantes. De plus, le comportement de croissance peut être analysé non seulement au niveau de la colonie, mais aussi au niveau de la cellule unique. La figure 5 illustre le développement de l’aire d’une seule cellule sous les oscillations de l’oxygène à divers intervalles de commutation T'. La croissance unicellulaire peut être déduite en suivant les parcelles voisines, sans analyse de suivi. Le comportement de croissance au niveau de la cellule unique ressemble à ce qui a été observé au niveau de la colonie dans la figure 4 ; une augmentation plus rapide de la surface pendant la phase de gazage aérobie et un changement clair de la vitesse de croissance lors de l’événement de commutation de gaz. Les résultats démontrent ici la capacité de cultiver des microbes dans des conditions gazeuses oscillantes et d’analyser la croissance microbienne en corrélation avec la disponibilité de l’oxygène de manière résolue dans le temps.

Figure 1 : Procédure de fabrication de puces à double couche. La procédure commence par (A, C) la conception du moule, (B, D) la fabrication du moule, (E-G) le moulage PDMS et (H) l’assemblage de la puce. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Puce à double couche fabriquée et sa capacité de contrôle de l’oxygène. (A) L’image représentative de la puce fabriquée est présentée, avec des canaux de gaz colorés (rouge) et des canaux de fluide (bleu) pour la visualisation. L’image MEB est illustrée en (i), représentant une série de chambres de culture reliées à des canaux de fluide des deux côtés (barre d’échelle de 100 μm). La section transversale de la puce est illustrée en (ii-ii'), représentant la couche supérieure de 3 mm d’épaisseur et la couche inférieure de 65 μm d’épaisseur. (B) La concentration d’oxygène mesurée dans le canal fluide après le passage entre les conditions aérobies (21 % d’oxygène) et anaérobies (0 % d’oxygène). Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Culture d’E. coli dans des conditions d’oxygène constant. (A) Les cellules sont cultivées en aérobie (21 % d’apport en oxygène) pendant 3 h, et des images en accéléré sont acquises à l’aide de la microscopie à contraste de phase. (B) Les cellules sont cultivées en anaérobie (0 % d’apport en oxygène) et des images en accéléré sont acquises pendant 3 h. (C) La croissance cellulaire dans diverses conditions d’oxygène constant est tracée sur la base de la_colonie A. (D) Le taux de croissance exponentiel est calculé et résumé. Toutes les barres d’échelle = 5 μm. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type n = 35 colonies (0 %), 27 (0,1 %), 21 (0,5 %), 16 (1 %), 13 (5 %), 13 (10 %), 29 (21 %). Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Culture d’E. coli dans des conditions d’oxygène oscillant. La croissance cellulaire dans diverses conditions d’oxygène oscillant est examinée (T', intervalle de commutation entre les conditions aérobies et anaérobies). La croissance cellulaire basée sur une_colonie est tracée dans le temps (en haut), et μ_Δt est tracée dans le temps pour permettre une interprétation des données résolues en temps (en bas). Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type n = 5 colonies (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min). Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Zone unicellulaire (une _{seule cellule}) d’E. coli cultivé dans des conditions d’oxygène oscillant. Les données proviennent d’une colonie représentative de chaque intervalle de commutation T'. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole de fabrication et d’exploitation d’un système microfluidique à double couche a été fourni pour observer la croissance microbienne dans des conditions d’oxygène oscillant rapidement avec une résolution spatio-temporelle élevée. Couplée à l’imagerie en accéléré, cette plate-forme permet la culture sur puce et la surveillance en temps réel des micro-organismes dans des conditions d’oxygène contrôlées, permettant l’analyse de la croissance microbienne en corrélation avec la disponibilité de l’oxygène.

Dans ce protocole, les couches supérieure et inférieure sont préparées séparément, puis assemblées en une seule puce. Ce concept modulaire permet différentes conceptions de puces en remplaçant simplement les configurations à deux couches. Différentes méthodes de fabrication ont été utilisées pour les moules des couches supérieure et inférieure - impression 3D SLA pour le haut et photolithographie pour le bas - en fonction de leur taille et de leurs exigences de précision respectives. Cette approche améliore l’efficacité globale du processus de fabrication. L’assemblage des deux couches est réalisé par un processus de durcissement PDMS en deux étapes. Il est essentiel d’optimiser le temps de chauffage pour la première étape de durcissement en fonction de la conception, car l’épaisseur du moule et les conditions de chauffage locales peuvent avoir un impact sur les résultats de durcissement PDMS.

Nous tirons parti de la nature du PDMS qui est très perméable à l’air pour réaliser une commutation rapide de l’oxygène. D’autre part, la précision du contrôle de l’oxygène peut également être affectée par la diffusion passive de l’oxygène à travers le PDMS, en particulier à des niveaux d’oxygène plus faibles. Pour compenser cette limitation, d’autres améliorations peuvent être ajoutées au protocole. Par exemple, la méthode d’étalonnage du capteur d’oxygène présente des possibilités d’amélioration. Dans le protocole démontré, le capteur est étalonné à deux points de référence, à 0 % et 21 % d’oxygène, à l’aide de la puce PDMS à double couche. Par conséquent, la précision de la détection de l’oxygène repose sur la capacité à créer des conditions précises d’appauvrissement en oxygène pour l’étalonnage. Comme mentionné dans le protocole, il est recommandé d’attendre quelques minutes après le début du rinçage au gaz pour assurer un étalonnage précis, en particulier lorsque l’on cible des niveaux d’appauvrissement en oxygène aussi bas que 0 %. Néanmoins, cette tâche est difficile en raison des fuites potentielles ou de la rétention d’air dans la puce PDMS perméable à l’air. La précision de l’étalonnage peut être encore améliorée en utilisant des produits chimiques piégeant l’oxygène ou en enfermant la puce dans une chambre étanche et appauvrie en gaz^17,18. Ces suppléments pourraient permettre une analyse plus robuste et plus précise du comportement microbien dans des conditions strictement anaérobies et à faible teneur en oxygène.

Le dispositif démontré serait d’intérêt pour divers domaines de recherche. Par exemple, il serait utile de reproduire les conditions d’oxygène dans les bioréacteurs industriels, où la disponibilité de l’oxygène est supposée être spatio-temporellement inhomogène 7,8,19,20. L’utilisation de la puce à double couche permet aux chercheurs de caractériser et de comprendre le comportement microbien dans des environnements d’oxygène fluctuant rapidement, ce qui n’était pas possible dans les installations de culture conventionnelles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Clewin 5	WieWeb software, Pays-Bas	N/A	Éditeur de mise en page
Caméra CMOS	Nikon, Japon	DS-QI2
Verre de protection	Schott AG, Allemagne	Biographie de D263	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Nettoyeur plasma femto	Diener Electronics, Allemagne	-	Liaison plasma de la puce
Formulaire 3B	Formlabs, États-Unis	-	Imprimante 3D
Référence à vie	Starna Scientific, Royaume-Uni	UMM-SFG
Régulateur de débit massique	Vö ; gtlin Instruments GmbH, Suisse	GSC-A9SA-BB22	azote, oxygène
Régulateur de débit massique	Vö ; gtlin Instruments GmbH, Suisse	GSC-A9SA-BB21	dioxyde de carbone
Modèle v3 résine	Formlabs, États-Unis	RS-F2-DMBE-03	Résine d’impression 3D
NaCl	Carl Roth, Allemagne	3957.1	Composant moyen LB
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Japon	-	Microscope inversé
Caméra pco.flim	PCO AG, Allemagne	-
Laser pco.flim	Omicron-Laserprodukte GmbH, Allemagne	-
Peptone	Carl Roth, Allemagne	8986.1	Composant moyen LB
Plan Apo & lambda ;	Nikon, Japon	-	100x huile, 20x
Polydiméthylsiloxane (PDMS)	Dow Chemical Company, États-Unis	Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone
Outil de poinçonnage, &Phi ; 0,50 millimètre	World Precision Instruments, États-Unis	504528
Outil de poinçonnage, &Phi ; 0,75 millimètre	World Precision Instruments, États-Unis	504529
Flacon cryogénique ROTI Store	Carl Roth, Allemagne	-
Solidworks 2016 x64 Édition	Dassault Systems, France	N/A	CAO 3D
Revêtement par centrifugation de substrat	APT Automation, Allemagne	CÔNE150i	Revêtement par centrifugation PDMS
Pousse-seringue	CETONI, Allemagne	neMESYS
Incubateur de température	Okolab, Italie	-	Équipement de microscope
tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthénium(II)hexahydraté, (RTDP)	Acros Organics, Belgique	208750010
Tubage	Saint-Gobain, France	Tygon F-4040-A	Tube d’entrée de gaz
Tubage	Saint-Gobain, France	Tygon AAD04103	Tubes fluides
Extrait de levure	Carl Roth, Allemagne	2363.3	Composant moyen LB