Method Article

Technologie de tri de cellules tumorales circulantes à haut débit et de séquençage de cellules uniques basée sur la microfluidique

DOI:

10.3791/68708

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November 14th, 2025

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1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont essentielles pour l’étude de la progression du cancer et des métastases. Cet article présente un protocole intégré à haut débit pour l’enrichissement des CTC et le séquençage d’un seul CTC, améliorant l’efficacité de capture et la pureté des CTC tout en réduisant les coûts de contamination et de séquençage, faisant ainsi progresser la recherche en oncologie de précision et les applications cliniques.

Abstract

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Les cellules tumorales circulantes (CTC) servent de biomarqueur prometteur pour le suivi des métastases, de la progression et de la récidive du cancer. Les techniques de biopsie liquide centrées sur la détection des CTC ont démontré un potentiel considérable en raison de leur nature non invasive et de leur capacité à fournir une surveillance en temps réel de la dynamique tumorale. Cependant, les analyses conventionnelles des CTC en vrac ne parviennent pas à saisir l’hétérogénéité intrinsèque entre les populations de CTC, obscurcissant ainsi des informations cruciales sur la biologie des tumeurs. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) permet une caractérisation à haute résolution de l’hétérogénéité des CTC, offrant de nouvelles opportunités pour l’oncologie de précision et les études mécanistes de la progression tumorale. Malgré ces avantages, les méthodologies existantes pour le séquençage à CTC unique ont tendance à souffrir d’inefficacités, notamment de faibles taux de récupération, des flux de travail à forte intensité de main-d’œuvre et des risques de contamination associés à plusieurs étapes de manipulation manuelle. Pour remédier à ces limitations, nous présentons un protocole microfluidique intégré qui consolide l’enrichissement, la purification et le séquençage de cellules uniques CTC dans un flux de travail unifié. La méthode utilise une capture magnétique contrôlée dynamiquement au sein d’une puce structurée en chevrons, où le mélange de vortex et la liaison cumulative de billes immunomagnétiques permettent une isolation CTC robuste et à haut débit avec des dommages cellulaires minimaux. La purification ultérieure à l’aide d’une puce microfluidique enrobée d’anticorps leucocytaires élimine efficacement les cellules non cibles, améliorant ainsi la pureté du CTC grâce à la sélection négative. Enfin, une puce de séquençage unicellulaire de haute précision, conçue sur la base de principes de résistance à l’écoulement différentiel, facilite la capture efficace des cellules uniques et l’appariement avec des microbilles à code-barres uniques. Cette nouvelle plateforme surmonte les limites des méthodes basées sur la distribution de Poisson, améliorant l’utilisation des CTC tout en minimisant la consommation de microbilles et les coûts de séquençage. Notre protocole intégré améliore considérablement l’efficacité de la capture CTC, la pureté et le débit de séquençage de cellules uniques, ce qui le rend bien adapté aux applications cliniques et à la recherche sur le cancer à grande échelle. En permettant une analyse plus précise et évolutive de l’hétérogénéité des CTC, cette méthode a le potentiel d’affiner le diagnostic précoce du cancer, le suivi du traitement et les études mécanistes des métastases, faisant ainsi progresser le domaine de l’oncologie de précision.

Introduction

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La métastase tumorale est un processus complexe et en plusieurs phases qui commence par sa dissémination, puis subit une dormance et une colonisation par des cellules tumorales au sein de la tumeur primaire. Ces cellules envahissent progressivement la membrane basale dans les tissus plus profonds, puis s’injectent dans les vaisseaux sanguins ou lymphatiques. Une fois dans la circulation, ces cellules deviennent des cellules tumorales circulantes (CTC), qui peuvent se déplacer vers des organes distants1. L’émergence des CTC est une étape critique dans la cascade métastatique, car elles servent de graines pour les métastases à distance1. Au cours des dernières années, la technologie de biopsie liquide basée sur la CTC a suscité beaucoup d’attention en raison de ses mérites, notamment la nature non invasive et pratique de la procédure, ainsi que la capacité de surveillance dynamique en temps réel. Cette technologie facilite l’évaluation précise, en temps réel et complète de la biologie tumorale, offrant des avantages uniques dans la surveillance de l’efficacité du traitement, la prédiction de la récidive et l’orientation du traitement 2,3,4. De plus, des études ont montré que les CTC sont présents dans le sang périphérique même pendant les stades de faible charge tumorale, tels que le cancer précoce, les métastases précoces ou la récidive 5,6. Par conséquent, la biopsie liquide CTC surmonte les limites des biopsies tissulaires traditionnelles, qui sont confinées aux tumeurs solides détectables par imagerie7. Il offre une nouvelle perspective et un soutien technologique pour le diagnostic précoce du cancer, la surveillance des récidives et des métastases, l’orientation du traitement, ainsi que l’élucidation des mécanismes d’initiation, de progression et de métastase des tumeurs. Par exemple, il a été démontré que le nombre de CTC dans le sang périphérique sert de prédicteur indépendant de la survie sans progression et de la survie globale chez les patients atteints de cancer, un nombre plus élevé de CTC indiquant un pronostic plus sombre8. Les changements dynamiques du nombre de CTC sont également étroitement associés à la progression de la maladie et à la charge tumorale après le traitement 9,10.

Des études récentes ont mis en évidence les technologies microfluidiques comme outils de transformation pour l’isolement des CTC. Ces technologies peuvent être classées en deux grandes catégories : approches physiques et biologiques, chacune offrant des avantages distincts tout en faisant face à des défis spécifiques. Les méthodes physiques s’appuient sur les différences de taille et de déformabilité pour séparer les CTC, ce qui permet un tri sans étiquette avec un débit élevé. Cependant, cette stratégie de séparation non spécifique peut compromettre à la fois l’efficacité et la pureté de la capture en raison de l’hétérogénéité inhérente des CTC. Par exemple, Lu et al. ont rapporté une puce microfluidique qui intégrait une conception de séparation de foyer et de réduction de vitesse avec des réseaux de pièges, qui surpassait la plupart des techniques physiques conventionnelles en termes d’enrichissement et de purification de CTC11. Néanmoins, la puce n’a atteint qu’une déplétion de 3 à 4 log des globules blancs (GB), ce qui reste insuffisant pour les applications cliniques. D’autre part, les stratégies d’isolement des CTC basées sur l’immunoaffinité offrent généralement un taux de récupération et une pureté des cellules cibles plus élevés. Cependant, l’interaction de liaison entre les molécules de capture et les CTC limite souvent le débit de telles approches12,13. Par conséquent, une méthode d’isolement qui équilibre à la fois l’efficacité d’enrichissement élevée et le débit est essentielle pour traiter efficacement les échantillons cliniques avec des populations de CTC rares.

De plus, l’hétérogénéité substantielle entre les CTC pose un défi important pour les analyses en aval 10,14,15, car les analyses conventionnelles des CTC en vrac obscurcissent souvent les distinctions cellulaires individuelles. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) facilite la caractérisation complète au niveau moléculaire de l’hétérogénéité de l’expression des gènes CTC, en fournissant des informations sur la classification, l’état et la fonction des CTC. Cette technologie offre de nouvelles approches pour l’oncologie de précision et facilite la recherche sur l’initiation, la progression et les mécanismes de métastasedes tumeurs 16. Par exemple, Fan et al. ont construit un atlas transcriptomique à CTC unique à partir de divers sites vasculaires chez des patients atteints de carcinome hépatocellulaire, révélant l’hétérogénéité spatiale entre les CTC et identifiant les médiateurs clés de l’évasion immunitaire17. Parallèlement, Miyamoto et al. ont identifié des mutations du gène du récepteur des androgènes et des variantes d’épissage dans les CTC de patients atteints de cancer de la prostate, élucidant ainsi les mécanismes sous-jacents à la résistance aux médicaments18.

Cependant, le développement du séquençage transcriptomique à CTC unique progresse lentement. Les méthodologies existantes souffrent de déficiences en matière d’automatisation et d’intégration, ce qui se traduit par une faible efficacité de récupération des CTC, des procédures complexes et de faibles taux de réussite expérimentale19. Par exemple, les protocoles actuels nécessitent un processus séquentiel impliquant l’enrichissement des CTC, la purification, l’isolement d’une cellule unique et l’amplification des acides nucléiques. Ces étapes sont effectuées dans des tubes de centrifugation séparés, ce qui nécessite plusieurs étapes de pipetage et de transfert. Les procédures à forte intensité de main-d’œuvre réduisent non seulement l’efficacité, mais augmentent également le risque de perte et de contamination de CTC20. Les approches conventionnelles, telles que la sélection de cellules par capillarité, limitent encore le débit et l’efficacité analytique lors de l’isolement d’une seule cellule21. De plus, les méthodes traditionnelles sont également limitées par la distribution de Poisson, qui est un phénomène statistique décrivant l’encapsulation aléatoire des cellules. Il en résulte une forte proportion de gouttelettes vides ou de plusieurs cellules par gouttelette, ce qui limite l’efficacité de la capture. Pour relever ces défis, les chercheurs ont mis au point des puces microfluidiques intégrées pour l’analyse transcriptomique CTC sur cellule unique. Ces plateformes regroupent plusieurs étapes dans un flux de travail sur une seule puce, ce qui réduit les risques de contamination et améliore l’efficacité analytique. Par exemple, Euisik Yoon et al. ont développé la méthode Hydro-Seq, qui utilise la sélection de taille basée sur la dynamique des fluides pour isoler les CTC dans des microchambres et apparier efficacement les CTC individuels avec des microbilles à code-barres uniques22. Cependant, cette méthode repose sur la séparation des CTC en fonction de la taille, ce qui entraîne souvent une faible pureté des CTC et un débit limité (10 μL/min), ce qui la rend inadaptée au traitement d’échantillons cliniques de grand volume. Par conséquent, il est urgent de développer un système d’analyse CTC unicellulaire intégré, à haut débit, à faible volume et résistant à la contamination.

Nous décrivons ici un protocole efficace et à haut débit pour l’enrichissement des CTC et le séquençage de cellules uniques, comprenant trois composants principaux : le tri des CTC, la purification et une puce de séquençage de cellules uniques (Figure 1). La puce microfluidique de tri CTC est conçue sur le principe des forces de capture magnétique régulées dynamiquement (Figure 2A). Il permet l’enrichissement à haut débit des CTC par mélange de vortex au sein de la structure à chevrons, ainsi que la capture cumulative par des billes immunomagnétiques. La libération non destructive des CTC est ensuite obtenue grâce à une modulation précise du champ magnétique. Une puce de purification est ensuite utilisée, où des microcanaux enrobés d’anticorps leucocytaires sont utilisés pour la sélection négative, produisant des CTC hautement purifiés (Figure 2B). Enfin, une plate-forme de manipulation de cellules uniques à haut rendement basée sur la résistance différentielle à l’écoulement a été utilisée, surmontant avec succès les limites de la distribution de Poisson et permettant un appariement et une capture efficaces de microsphères monocellulaires et codées (Figure 3A). Il améliore considérablement l’utilisation du CTC tout en réduisant la consommation de microbilles et les coûts de séquençage.

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Figure 1 : Schéma de la technologie de tri CTC et de séquençage de cellules uniques basée sur la microfluidique. Ce flux de travail illustre le processus par lequel les cellules tumorales se détachent des lésions tumorales, pénètrent dans la circulation sanguine et forment des CTC. Des échantillons de sang périphérique ou de leukopak contenant des CTC sont traités séquentiellement par le biais des puces de capture, de purification et de séquençage de l’ARNsc, ce qui permet finalement le séquençage transcriptomique et l’analyse bioinformatique des CTC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

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1. Méthode 1 : Isolation CTC basée sur la microfluidique

  1. Fabrication d’éclats à chevrons (copeaux HB)
    1. Préparation du moule maître
      1. Préparez une plaquette de silicone propre et faites-la cuire à 135 °C pendant la nuit pour éliminer l’humidité. Après refroidissement à température ambiante, traitez la plaquette à l’aide d’un nettoyeur plasma à oxygène à 150 W pendant 1 min pour activer la surface.
      2. Modélisez la première couche de la puce pour former un réseau de piliers de support (28 colonnes × 7 rangées, numérotées de #1 à #28 le long de la direction d’écoulement) à l’aide de la résine photosensible SU-8. Réglez la machine de spin pour qu’elle fonctionne séquentiellement à 500 tr/min pendant 10 s, 2350 tr/min pendant 55 s et 500 tr/min pendant 10 s. Assurez-vous que la hauteur de cette couche est de 50 μm.
      3. Faites cuire doucement la première couche à 65 °C pendant 1 min, puis à 95 °C pendant 20 min pour évaporer le solvant. Refroidir à température ambiante.
      4. Exposez la première couche à l’aide d’un photomasque avec le motif de pilier de support correspondant. Régler la dose d’exposition à 130 mJ/cm2.
      5. Effectuer la cuisson post-exposition à 65 °C pendant 1 min, puis à 95 °C pendant 6 min.
      6. Après refroidissement, versez le révélateur SU-8 sur la surface de la plaquette pour éliminer la résine photosensible non réticulée et obtenir la couche inférieure. Laissez-le s’accumuler pendant 30 s, puis rincez à l’eau déminéralisée.
      7. Appliquez une couche de centrifugation sur la deuxième couche SU-8 au-dessus de la première couche en utilisant les mêmes paramètres d’essorage qu’à l’étape 1.1.1.2. Modelez la deuxième couche pour former des structures à chevrons à un angle de 45° par rapport à la paroi du canal, avec une largeur de rainure de 100 μm, un pas de 200 μm et six crêtes par cycle. Assurez-vous que la hauteur de cette couche est également de 50 μm.
        REMARQUE : La figure supplémentaire 1 présente un schéma de principe illustrant toutes les dimensions pertinentes des caractéristiques de la microstructure (y compris le réseau de piliers de soutien et les rainures à chevrons).
      8. Faites cuire doucement la première couche à 65 °C pendant 1 min, puis à 95 °C pendant 20 min pour évaporer le solvant. Refroidir à température ambiante.
      9. Exposez la deuxième couche à l’aide d’un photomasque avec le motif à chevrons. Régler la dose d’exposition à 130 mJ/cm2.
      10. Effectuer la cuisson post-exposition à 65 °C pendant 1 min, puis à 95 °C pendant 6 min.
      11. Après refroidissement, utilisez le révélateur SU-8 pour éliminer les régions non réticulées et révéler la microstructure complète à deux couches.
    2. Préparation de la réplique PDMS
      1. Formuler le mélange PDMS en combinant le prépolymère et l’agent de réticulation à un rapport de poids de 10:1. Préparez 10 à 15 ml du mélange pour une seule chips.
      2. Versez le mélange dans le moule maître et éliminez l’air emprisonné par dégazage. Durcissez le PDMS en plaçant le moule dans un four à 95 °C pendant 30 min.
      3. Retirez la réplique PDMS durcie du moule. Créez une entrée et une sortie à l’aide d’un perforateur PDMS de 1 mm de diamètre.
    3. Assemblage de la puce HB
      1. Réglez le nettoyeur plasma à oxygène sur une puissance de 150 W pendant 3 min. Activez les surfaces en traitant à la fois la réplique PDMS et la couche PDMS pré-collée sur une lame de verre propre.
        REMARQUE : En raison de l’abondance de liaisons Si-O dans les chaînes polymères PDMS, l’activation plasma permet la liaison covalente entre PDMS et des substrats tels que le verre, le silicium, facilitant ainsi l’étanchéité des puces.
      2. Alignez les structures PDMS traitées et collez-les fermement. Vérifiez que le réseau de piliers de support et les éléments à chevrons sont complètement intégrés au substrat de verre pour finaliser la puce HB.
  2. Préparation de billes immunomagnétiques (BMI)
    1. Incuber 25 μL de billes magnétiques modifiées à la streptavidine (SA-MBs) lavées et remises en suspension (1 μm) (≈4 × 108 billes par mL) avec 1 μg d’anticorps EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) biotinylé à température ambiante avec rotation à 20 tr/min pendant 40 min pour préparer les IMBs.
    2. Après séparation magnétique sur un support magnétique, retirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 25 μL de tampon d’isolement (1 % BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Fonctionnement de la puce d’isolation
    1. Pipette 20 μL de suspension à billes magnétiques en 1 à 2 s, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite.
    2. Placez immédiatement la puce verticalement sur un aimant et laissez les billes se déposer pendant 5 min sans être dérangées.
    3. Prélevez l’échantillon de sang (sang périphérique ou échantillons expérimentaux de leukopak) et prélevez immédiatement 4 ml dans une seringue, en veillant à ce que les bulles d’air soient éliminées. Scellez l’entrée et la sortie de la puce avec du liquide pour éliminer les bulles d’air. Insérez les tubes d’entrée et de sortie de l’échantillon dans la puce.
      REMARQUE : Assurez-vous que des mesures de protection individuelle de base sont en place lors de la manipulation d’échantillons biologiques.
    4. Injecter l’échantillon à l’aide d’une pompe à seringue avec un débit de 1,5 mL/h.
    5. Après le chargement de l’échantillon, injectez 60 μL de D-PBS dans la puce HB à un débit de 0,2 mL/h pour éliminer les cellules non liées.
    6. Retirez l’aimant et injectez manuellement 1,5 ml de BSA (5 % p/v dans le D-PBS) pour laver la puce et libérer les cellules tumorales capturées de la puce HB.

2. Méthode 2 : Purification CTC basée sur la microfluidique

  1. Modification de la puce HB
    1. Préparez une solution de triméthoxysilane (3-mercaptopropyl) (MPTS) dans de l’éthanol avec une fraction volumique (v/v) de 10 %. Introduire immédiatement 20 μL de solution MPTS dans la puce HB et incuber à température ambiante pendant 1 h.
    2. Rincer une fois avec de l’éthanol anhydre et sécher à 100 °C pendant 1 h.
    3. Préparer une solution d’ester de N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide (GMBS) dans de l’éthanol à une concentration de 0,5 mg/mL. Refroidissez la puce à 37 °C, introduisez la solution GMBS et incubez à température ambiante pendant 30 min.
      REMARQUE : Lors de l’utilisation de MPTS et GMBS, portez toujours des gants, une blouse de laboratoire et un masque. Ces réactifs possèdent des propriétés toxiques et irritantes pour les muqueuses et doivent être manipulés avec précaution dans un endroit bien ventilé.
    4. Rincer deux fois avec du ddH2O, suivi de deux rinçages avec du D-PBS.
    5. Ajouter immédiatement 15 μg/mL de streptavidine (SA), incuber à température ambiante pendant 1 h ou toute la nuit à 4 °C.
    6. Rincez deux fois avec du D-PBS.
    7. Préparez le tampon d’anticorps CD45 : 0,2 % (p/v) de BSA et 20 μg/mL d’anticorps CD45 biotinylés, dilués au trait avec du D-PBS.
    8. Injectez 20 μL du tampon d’anticorps CD45 dans la puce HB pour la sélection négative des globules blancs. Incuber à température ambiante pendant 1 h, puis rincer au D-PBS.
    9. Ajouter une solution bloquante contenant 3 % (p/v) de BSA et 0,05 % (p/v) de Tween-20, incuber à température ambiante pendant 1 h. Rincer au D-PBS avant le chargement de l’échantillon.
  2. Chargement de l’échantillon
    1. Aspirez l’échantillon à l’aide d’une seringue, en veillant à ce que les bulles d’air soient éliminées. Scellez l’entrée et la sortie de la puce avec du liquide pour éliminer les bulles d’air. Insérez les tubes d’entrée et de sortie de l’échantillon dans la puce.
    2. Injecter l’échantillon à l’aide d’une pompe à seringue et régler le débit à 0,6 mL/h.
    3. Collectez les cellules tumorales purifiées à la sortie pour le comptage et le séquençage de cellules uniques.

3. Méthode 3 : Technologie de codage à barres et de séquençage à cellule unique basée sur des micropuits

  1. Préparation des réactifs et des matériaux
    1. Prétraitement des copeaux
      1. Ajouter 200 μL de 1x D-PBS et 0,5 % de solution F-68 à l’entrée de la puce.
      2. Effectuez la sonication au bain-marie tout en tenant la puce. Lorsque des bulles sont visibles dans toute la région microporeuse, poursuivre la sonication pendant 30 s pour éliminer les bulles des puits doubles.
    2. Préparation des billes à code-barres
      1. Mélangez soigneusement la solution mère de billes magnétiques à code-barres et transférez 200 μL dans un tube à centrifuger. Appliquez une séparation magnétique jusqu’à ce que la solution clarifie et jetez le surnageant.
      2. Lavez les billes à code-barres deux fois avec 500 μL de TE-TW (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01 % Tween-20).
      3. Lavez et mettez en suspension les billes à code-barres dans 200 μL de 20x TE (10 mM de Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM d’EDTA) et 50 mM de solution DTT, puis placez-les sur de la glace.
    3. Préparation de suspension unicellulaire
      1. Transférez les cellules tumorales purifiées dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et centrifugez à 400 × g pendant 3 min à température ambiante. Lavez et remettez en suspension la pastille dans 1 mL de 1x D-PBS.
      2. Effectuez le comptage des cellules et préparez la suspension unicellulaire en conséquence. Le volume de chargement de l’échantillon doit être de 200 μL, avec un total de 80 000 cellules (400 cellules/μL).
    4. Préparez le tampon de lyse cellulaire, qui comprend 1 citrate de sodium salin (SSC), 0,5 M LiCl, 0,6 % de Triton X-100, 10 mM d’EDTA, 5 mM de DTT et 1 inhibiteur de RNase U/μL.
  2. Fonctionnement de la puce microfluidique
    1. Capture de cellules
      1. Injecter 200 μL de suspension de cellules tumorales dans la puce (60000 puits doubles), puis agiter à 10 tr/min sur un agitateur décolorant pendant 5 min pour permettre aux cellules de s’installer dans les puits de capture par gravité.
      2. Pipetez doucement la suspension cellulaire dans la puce vers le haut et vers le bas deux fois. Ensuite, placez la puce sur un agitateur décolorant à 10 tr/min pendant 5 min pour remettre en suspension les cellules non capturées et leur permettre de se déposer à nouveau.
      3. Ajouter 200 μL de solution 1x D-PBS et 0,5 % de F-68 par l’entrée et aspirer la solution par la sortie. Répétez deux fois pour un total de trois lavages de la puce.
    2. Capture de billes par code-barres
      1. Remettez en suspension la suspension à billes à code-barres, puis injectez immédiatement 200 μL de la suspension dans la puce par l’entrée. Agiter à 10 tr/min pendant 20 s.
      2. Pipetez doucement la suspension de la bille deux fois, puis agitez à 10 tr/min pendant 20 s. Répétez cette étape une fois.
      3. Retirer la suspension de billes à code-barres de la sortie, ajouter 200 μL de solution de DTT 20x (pH = 7,5) et 50 mM, puis retirer le liquide de la sortie. Répétez cette étape deux fois, pour un total de trois lavages.
    3. Lyse cellulaire et capture de l’ARNm
      1. Ajoutez lentement 200 μL du tampon de lyse cellulaire à la puce par l’entrée. Immédiatement après, ajoutez lentement 200 μL d’huile minérale pour sceller les puits doubles.
        REMARQUE : Le scellement doit être effectué immédiatement pour éviter toute contamination.
      2. Retirez la solution qui s’écoule de la sortie des copeaux dans le réservoir à déchets. Placez les chips horizontalement et laissez-les reposer à température ambiante pendant 5 min.
    4. Récupération des billes de code-barres
      1. Après la lyse, ajoutez lentement 200 μL de SSC 6x par l’entrée, retirez les déchets liquides et aspirez la solution restante par la sortie des copeaux.
      2. Ajoutez lentement 200 μL de 6x SSC pour remplir la puce. Tenez un aimant près de la surface de la puce et déplacez-le lentement de l’entrée à la sortie pour recueillir des billes de code-barres des puits de capture. Ensuite, aspirez rapidement la solution ainsi que les billes de code-barres de la puce dans un tube à centrifuger préchargé avec 6x SSC.
      3. Laver trois fois avec 200 μL de 6x SSC, suivi d’une fois avec 1x tampon RT (voir tableau des matériaux).
  3. Transcription inverse (RT), traitement par exonucléase I et PCR
    1. RT
      1. Remettre en suspension les billes de code-barres dans 100 μL de mélange réactionnel de transcription inverse, contenant 1× tampon RT, 1 mM GTP, 1 mM dNTP, 5 % de PEG 8000, 2,5 μM Template Switch Oligo (voir le tableau des matériaux), 1 inhibiteur de RNase U/μL et 10 U/μL de transcriptase inverse. Incuber la solution à 42 °C pendant 120 min.
    2. Traitement à l’exonucléase
      1. Après la transcription inverse, laver les billes une fois avec 200 μL de 1x TE-SDS (10 mM de Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM d’EDTA, 0,5 % SDS), une fois avec 200 μL de 1x TE-TW et une fois avec 200 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Remettre les billes en suspension dans 100 μL de mélange d’exonucléases, contenant 1 tampon d’exonucléase I et 1 U/μL d’exonucléase I, et incuber à 37 °C pendant 45 min.
    3. Synthèse du deuxième brin
      1. Lavez les billes une fois avec 200 μL de 1x TE-SDS. Remettre les billes en suspension dans 200 μL de NaOH 0,1 M et incuber pendant 5 min à température ambiante avec rotation à 30 tr/min pour dénaturer le produit hybride ARNm-ADNc. Ensuite, lavez les billes une fois avec 200 μL de 1x TE-TW et une fois avec 200 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Remettre les billes en suspension dans 100 μL du mélange réactionnel, contenant 1x tampon RT, 1 mM de dNTP, 5 % de PEG 8000, 0,5 μM d’amorce de synthèse de second brin (voir le tableau des matériaux) et 0,125 U/μL de fragment de Klenow. Incuber la solution à 37 °C pendant 60 min.
    4. Amplification de l’ADNc
      1. Lavez les billes une fois avec 200 μL de 1x TE-SDS, une fois avec 200 μL de 1x TE-TW et une fois avec 200 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Remettre les billes en suspension dans 150 μL de mélange PCR comprenant 1x mélange de réaction PCR et 0,8 μM d’oligo ISPCR (voir tableau des matériaux). Réglez le programme PCR comme suit : 95 °C pendant 3 min ; quatre cycles de 98 °C pendant 20 s, 65 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 3 min ; huit cycles de 98 °C pendant 20 s, 67 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 3 min ; 72 °C pendant 5 min.
      3. Purifier le produit PCR deux fois avec des billes magnétiques d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI) 0,6x pour la purification de l’ADN selon les instructions du fabricant et éluer en 20,5 μL de H2O. Mesurer la concentration du produit PCR purifié à l’aide d’un test de quantification de l’ADN basé sur la fluorescence.
      4. Effectuez une deuxième amplification du produit PCR purifié à l’aide d’un mélange PCR contenant 1x mélange réactionnel PCR et 0,8 μM d’oligo ISPCR (voir Tableau des matériaux). Réglez le programme PCR comme suit : 98 °C pendant 3 min ; cinq cycles de 98 °C pendant 20 s, 67 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 3 min ; 72 °C pendant 5 min.
      5. Purifier le produit PCR deux fois avec des billes magnétiques SPRI 0,6x pour la purification de l’ADN conformément aux instructions du fabricant et éluer dans 20,5 μL de H2O. Mesurer la concentration du produit PCR purifié à l’aide d’un test de quantification de l’ADN basé sur la fluorescence23.
    5. Construction de banques d’ADNc
      1. Construisez la bibliothèque avec un kit de préparation de banque d’ADN standard (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
      2. Amplifier la bibliothèque par PCR à l’aide de la paire d’amorces N70X / P5 (voir tableau supplémentaire). Réglez le programme PCR comme suit : 72 °C pendant 3 min ; 98 °C pendant 30 s ; douze cycles de 98 °C pendant 15 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 3 min ; 72 °C pendant 5 min.
      3. Purifier la bibliothèque avec des billes magnétiques SPRI 0,6x pour la purification de l’ADN selon les instructions du fabricant et éluer en 20 μL de H2O. Mesurer la concentration du produit PCR purifié à l’aide d’un test de quantification de l’ADN basé sur la fluorescence.
        REMARQUE : En général, une concentration finale de la banque d’ADN de ≥ 2 ng/μL et une quantité totale de ≥ 50 ng sont considérées commeacceptables 24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’assemblage et le relâchement de l’interface de capture CTC peuvent être évalués par microscopie. Une distribution uniforme des billes magnétiques (MB) au bas de la puce HB sous un champ magnétique indique un assemblage réussi, tandis que des MB résiduels minimes ou nuls confirment une libération réussie (Figure 2C). Cette étape est essentielle pour déterminer le rendement et la pureté des CTC capturés. Pour valider l’efficacité de capture de la puce d’isolation CTC, nous avons réalisé une expérience de pointe. Un petit nombre de cellules tumorales avec une expression élevée d’EpCAM (PC3 ou LNCaP) ont été dopées dans du PBS contenant une grande population de cellules Jurkat, qui présentent une faible expression d’EpCAM, simulant la présence de cellules sanguines abondantes en circulation. La puce d’isolement CTC a capturé efficacement les cellules tumorales à partir d’échantillons de 1 mL et de 10 mL, démontrant ainsi son débit élevé et sa capacité de tri efficace des CTC (Figure 2D). Pour évaluer la spécificité de la capture basée sur l’IMB, nous avons utilisé une puce de contrôle modifiée avec des SA-MB dépourvus de conjugaison d’anticorps EpCAM. L’absence de capture significative des cellules tumorales a confirmé la spécificité de l’isolement des CTC médié par l’IMB (Figure 2D).

Outre l’efficacité de capture, la pureté est un autre paramètre critique pour l’évaluation des plates-formes d’isolement CTC. Nous avons comparé la pureté des cellules tumorales isolées à l’aide de la puce de capture ou de la puce de purification seule, ainsi que la pureté obtenue par sélection positive et négative séquentielle (Figure 2E). Les deux puces ont considérablement amélioré la pureté des cellules tumorales par rapport au groupe témoin, démontrant leur efficacité dans l’isolement des CTC. Plus important encore, l’utilisation combinée de la sélection positive et négative a encore amélioré la pureté et le rendement des cellules tumorales par rapport à l’utilisation d’une seule méthode.

Pour évaluer davantage les performances des puces de capture et de tri CTC en milieu clinique, nous avons collecté des échantillons de sang périphérique (PB) de six donneurs sains et mené des expériences de dopage. Étant donné l’abondance extrêmement faible de CTC dans les échantillons cliniques, environ 500 à 1000 cellules LNCaP ont été enrichies dans chaque échantillon de 10 mL de PB. Le nombre de globules blancs dans tous les échantillons de PB prélevés se situait dans la plage normale (4-10 × 106 cellules/ml). Les résultats ont démontré que le système de tri CTC maintenait une efficacité de capture et une pureté élevées des cellules tumorales, même lors du traitement d’échantillons cliniques (Figure 2F-G et Figure supplémentaire 2).

figure-results-1
Figure 2 : Plateforme de capture et de purification de CTC à structure en chevrons. (A) Flux de travail de la puce d’isolation CTC. Tout d’abord, un champ magnétique stable et des IMB conjugués aux anticorps EpCAM assemblent l’interface de capture. Ensuite, le mélange de vortex au sein de la puce HB améliore l’efficacité du transfert de masse entre les CTC et les IMB, facilitant ainsi la capture accumulée. Enfin, la libération douce des CTC est obtenue en supprimant le champ magnétique. (B) Flux de travail de la puce de purification CTC. La puce HB est modifiée avec des anticorps à sélection négative, et le mélange vortex facilite davantage les interactions leucocytes-anticorps, produisant finalement des CTC hautement purifiés. Barre d’échelle, 100 μm. (C) L’imagerie microscopique démontre l’assemblage et la libération réussis de la puce de capture. (D) Les diagrammes à barres comparent l’efficacité de capture CTC de la plate-forme d’isolement sur différents volumes d’échantillons, en utilisant des SA-MB non fonctionnalisés comme contrôle. Barres d’erreur, moyenne ± écart-type, n = 3. (E) Des diagrammes à barres comparent la pureté des CTC obtenues à l’aide d’une seule puce HB par rapport à celles subissant une capture et une purification séquentielles. Le groupe témoin représente la pureté du CTC non traité. Barres d’erreur, moyenne ± écart-type, n = 3. (F) Identification des cellules dans la puce d’isolement CTC. Les cellules LNCaP ont été colorées avec Hoechst et Calcein AM, tandis que les cellules sanguines ont été colorées avec Hoechst uniquement. Barre d’échelle, 100 μm. (G) Pureté des cellules tumorales et efficacité de capture dans les expériences de dopage utilisant 1 mL ou 10 mL de sang périphérique. Barres d’erreur, moyenne ± écart-type, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les cellules tumorales isolées ont ensuite été soumises à un séquençage unicellulaire à haut débit. Notre protocole intègre un système de codage à barres à cellule unique composé de 60 000 micropuits imbriqués (figure 3A-B). Les micropuits inférieurs, de forme carrée, servent à capturer des cellules individuelles, tandis que les micropuits supérieurs sont conçus pour le chargement de billes. Chaque micropuits inférieur mesure 25 μm de longueur, de largeur et de hauteur, ce qui convient à la plupart des types de cellules. Les puits hexagonaux supérieurs ont un diamètre de cercle inscrit et une hauteur de 50 μm pour accueillir des billes allant généralement de 30 à 50 μm. Le système améliore l’efficacité de la capture des cellules sur la base de la capture cumulative tout en évitant les doublets de cellules grâce aux micropuits d’exclusion de taille. Pour optimiser le protocole de chargement des cellules, nous avons étudié l’efficacité de capture des cellules et le taux d’occupation des micropuits dans différentes conditions d’entrée de cellule (Figure 3C). Les résultats ont montré que l’augmentation de l’entrée de la cellule ne diminuait pas l’efficacité de la capture ; au contraire, il a considérablement amélioré le taux d’occupation. Pour la puce de capture de 60 000 puits, le taux d’occupation des micropuits s’est stabilisé lorsque l’entrée de la cellule a atteint 80 000, ne montrant aucune augmentation supplémentaire avec une entrée supplémentaire. Pour minimiser l’apparition de doublets dus à une charge cellulaire excessive, nous avons sélectionné 80 000 cellules comme entrée optimale. Comme le montre la figure 3D, la puce de code-barres à cellule unique a atteint un taux d’occupation des billes de 85,6 % et de 95,7 %, ce qui a donné un taux d’appariement de 81,9 %. De plus, plusieurs débourtisages ont été effectués conformément au protocole, ce qui a considérablement amélioré l’efficacité de capture et le taux d’appariement grâce à l’effet de capture cumulatif (figure 3D). Notamment, la différence observée dans les rapports d’occupation entre les cellules et les billes est attribuée à la densité et à la masse plus grandes des billes par rapport aux cellules, ce qui leur permet de s’installer plus efficacement dans les micropuits sous l’effet de la gravité. Par conséquent, dans des conditions de charge optimisées, un taux d’occupation d’appariement d’environ 80 % est généralement considéré comme idéal.

figure-results-2
Figure 3 : Technologie de codage à barres et de séquençage à cellule unique à haut débit basée sur Microwell. (A) Flux de travail du protocole de séquençage à CTC unique. (B) La microcopie démontre les structures de puits de capture microfluidique à cellule unique/à code-barres. Les processus de capture de cellules, de capture de billes et de récupération de billes sont illustrés de gauche à droite. Barre d’échelle 30 μm. (C) Les tracés linéaires illustrent l’efficacité de capture de cellules et le taux d’occupation des micropuits de la puce de codage à barres à cellule unique (60000 puits doubles) dans différentes conditions d’entrée de cellule. (D) Taux d’occupation des cellules et des billes de code-barres dans des conditions d’entrée de cellule optimisées, ainsi que le rapport d’appariement cellule-bille correspondant. Les panneaux de gauche et de droite montrent l’approche de capture utilisant respectivement plusieurs tentatives de décantation et une seule décantation. Barres d’erreur, moyenne ± écart-type, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, pour valider le protocole intégré pour le tri CTC et le scRNA-seq, nous avons mélangé des cellules PC3, LNCaP et Jurkat à un rapport estimé de 1:3:4000 et les avons chargées sur les puces microfluidiques pour la capture, la purification et le séquençage des cellules tumorales. Grâce à la plateforme efficace d’isolement de cellules tumorales, nous avons obtenu des cellules tumorales positives à l’EpCAM très pures (Figure 4B). Parallèlement, la puce scRNA-seq basée sur la microfluidique a démontré une capacité de profilage précis du type de cellule, les résultats étant visualisés par l’analyse t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) (Figure 4A). Nous avons réussi à identifier trois populations cellulaires distinctes, chacune d’entre elles pouvant être distinguée par des marqueurs uniques (Figure 4C). De plus, les proportions de cellules dans la sortie finale correspondaient étroitement à celles de l’entrée purifiée, confirmant que le processus de codage à barres à cellule unique était non biaisé et exempt de contamination (figure 4B). Un groupe a été identifié comme étant des cellules Jurkat sur la base de l’expression spécifique de TRBC1, IGLL1, CD1E et CD3D (Figure 4D). L’analyse de l’enrichissement des voies a confirmé la robustesse de cette classification (figure 4E). De plus, les deux lignées cellulaires du cancer de la prostate ont été distinctement séparées en grappes individuelles selon des gènes exprimés différentiellement (DEG) (Figure 4F-G). L’amas PC3 a été caractérisé par une forte expression de microséminoprotéine (MSMP), également connue sous le nom de microprotéine sécrétée par PC3. D’autre part, le cluster LNCaP a exprimé de manière unique des marqueurs liés à l’adhésion, à la prolifération et à la pluripotence cellulaires, tels que NEDD4, CTNNA1 (α-caténine 1) et RBBP7.

figure-results-3
Figure 4 : Validation du tri CTC et du séquençage de cellules uniques à l’aide d’une expérience de pointe. (A) Graphique t-SNE montrant le profilage du type cellulaire des cellules capturées et purifiées. (B) Diagramme à barres représentant les proportions des trois types de cellules à trois étapes : entrée initiale, post-purification et sortie finale du séquençage. (C) Graphique à points illustrant l’expression de gènes marqueurs uniques dans différents groupes de cellules. (D) Niveaux d’expression de TRBC1, IGLL1, CD1E et CD3D dans toutes les cellules. (E) Analyse de l’enrichissement des voies GO et KEGG des gènes exprimés différentiellement (DEG) dans le cluster Jurkat. (F) Profils d’expression de NEDD4 et MSMP dans toutes les cellules. (G) Graphique du volcan montrant les DEG entre les amas PC3 et LNCaP. Les points rouges représentent les gènes régulés à la hausse dans PC3 ; les points bleus représentent ceux régulés à la hausse dans LNCaP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Mixage principalRéactifDilution finaleType de tampon
0,5 % F-68F-680.50%Eau traitée au DEPC
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH = 8,0)10 millions d’eurosEau traitée au DEPC
EDTA1 million d’euros
Préadolescent-200.01%
20× ET (pH = 7,5)Tris-HCl (pH = 7,5)200 millions d’eurosEau traitée au DEPC
EDTA20 millions d’euros
TE-SDSTris-HCl (pH = 8,0)10 millions d’eurosEau traitée au DEPC
EDTA1 million d’euros
SDS0.50%

Tableau 1 : Composition du mélange de réactifs pour la préparation de séquençage à CTC unique. On y trouve des parties des réactifs nécessaires au scRNA-seq, qui peuvent être préparés avant le fonctionnement de la puce pour garantir un processus rapide et fluide.

Figure supplémentaire 1 : Conception de la puce HB. (A) Schéma de principe de la structure microfluidique à deux couches. Dessus : Couche supérieure avec la structure à chevrons. Un encart agrandi montre la géométrie détaillée du chevron, qui est orienté à un angle de 45° par rapport à la paroi du canal, avec une largeur de rainure de 100 μm et un pas de 200 μm. Fond : Couche inférieure composée d’un réseau de piliers de support (28 colonnes × 7 rangées), numérotés de #1 à #28 le long de la direction de l’écoulement. (B) Vue latérale de l’éclat à chevrons. Les rainures à chevrons ont une largeur de 100 μm. La hauteur des structures à chevrons et des piliers de support est de 50 μm. (C) Vue de dessus de l’éclat à chevrons. Chaque pilier de support mesure 500 m de largeur et 1150 m de longueur, avec un espace de 550 m entre les piliers adjacents. (D) Photographie de la puce HB fabriquée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Image représentative montrant des cellules tumorales et des cellules sanguines colorées par fluorescence présentes dans le liquide résiduel collecté à la sortie de la puce d’isolement CTC. Les cellules LNCaP ont été colorées avec Hoechst et Calcein AM, tandis que les cellules sanguines ont été colorées avec Hoechst uniquement. Barre d’échelle 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire : Séquences d’oligonucléotides utilisées dans la transcription inverse et la préparation de banques Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les CTC servent de biomarqueurs précieux pour le diagnostic du cancer, l’orientation du traitement et les études sur l’initiation, la progression et les métastasestumorales 25. Cependant, les méthodes d’isolement CTC existantes ne permettent pas d’atteindre à la fois un rendement élevé et un débit élevé26. De plus, la faible efficacité de libération des CTC entraîne souvent une faible pureté et des dommages cellulaires élevés, ce qui limite leur compatibilité avec les analyses en aval27. Ici, nous avons proposé un protocole intégré pour le tri CTC à haut débit et le séquençage CTC unique, composé de trois procédures principales : la capture CTC, la purification et le scRNA-seq.

Cette plateforme basée sur la microfluidique offre flexibilité et évolutivité. Le nombre de canaux parallèles dans les puces HB, ainsi que le nombre de puits de capture dans la puce de code-barres, peuvent être ajustés en fonction des différentes exigences d’échantillonnage, répondant ainsi aux demandes de débit élevé. Dans la puce de capture CTC, les IMB peuvent être optimisés en fonction du type de cancer spécifique. Par exemple, dans des échantillons de patients atteints d’un cancer de la prostate, les IMB peuvent être fonctionnalisés avec un cocktail d’anticorps EpCAM et PSMA pour améliorer l’efficacité de la capture. De plus, le fait de s’appuyer uniquement sur la capture basée sur EpCAM peut entraîner la perte de CTC mésenchymateux qui ont subi une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Pour résoudre ce problème, des anticorps supplémentaires contre la protéine de choc thermique 70 (HSP-70) ou la vimentine de surface cellulaire (CSV) peuvent être incorporés pour capturer les CTC à différents stades de l’EMT.

Étant donné que les puces HB pour la capture et la purification des CTC sont basées sur la microfluidique, une manipulation soigneuse est essentielle pendant les expériences. Avant d’introduire des réactifs dans l’entrée de la puce, toutes les bulles d’air doivent être éliminées, et l’entrée et la sortie peuvent être scellées pour éliminer l’air emprisonné. De plus, les réactifs doivent être introduits rapidement (dans un délai de 1 à 2 s), car les bulles d’air piégées peuvent obstruer le passage des IMB et des cellules, réduisant considérablement l’efficacité et la pureté de la capture. De plus, comme nous l’avons mentionné précédemment, la répartition uniforme des BMI est essentielle à la réussite de la capture des CTC. Après avoir chargé les IMB, la puce doit être placée verticalement sur l’aimant et fixée en position pendant au moins cinq minutes pour éviter que les changements dans le champ magnétique ne perturbent la distribution des IMB. Notamment, le débit de charge des cellules spécifié dans le protocole doit être optimisé en fonction de différents types d’échantillons. Par exemple, les échantillons de leucocytes présentent des niveaux élevés de concentration et de viscosité des leucocytes. Si le débit est trop rapide, il peut entraver les interactions efficaces entre les CTC et les IMB, empêchant la capture magnétique accumulée et réduisant ainsi la pureté des CTC. Pour évaluer la performance de notre plateforme d’isolement et de purification des CTC dans le traitement des échantillons de sang cliniques, nous avons collecté de la PB auprès de plusieurs donneurs sains et avons injecté un petit nombre de cellules LNCaP (environ 50 à 100 cellules par ml) dans les échantillons. Notamment, bien que la plate-forme ait montré une efficacité de capture et une pureté élevées pour les cellules tumorales dans les échantillons de PB, ses performances étaient légèrement inférieures à celles observées dans les échantillons de cellules basées sur le PBS (Figure 2D, Figure 2E et Figure 2G). Nous supposons que cet écart est dû à la viscosité plus élevée du sang et à la présence de globules rouges et de plaquettes abondants par rapport au PBS. Par conséquent, lors de la manipulation d’échantillons de sang cliniques, des étapes de prétraitement telles que la lyse des globules rouges ou l’extraction de PBMC peuvent être envisagées pour améliorer les performances.

Semblable aux puces HB, la puce de code-barres à cellule unique basée sur la microfluidique nécessite une manipulation soigneuse pour éviter la formation de bulles d’air. Étant donné la variété des réactifs impliqués, certains réactifs peuvent être préparés à l’avance avant de lancer les opérations sur puce (tableau 1). Lors du chargement des cellules et des billes, un contrôle minutieux de la vitesse d’injection est nécessaire pour assurer une distribution uniforme, car les cellules ont une densité plus faible tandis que les billes à code-barres sont plus denses. En règle générale, la suspension cellulaire doit être ajoutée lentement sur 3 ~ 5 s, suivie de l’ajout rapide de la suspension de billes en 1 ~ 2 s. Après avoir chargé les cellules et les billes, effectuez deux cycles d’aspiration et de distribution, puis placez la puce sur un agitateur pour terminer le processus de capture cumulative. Cette étape est essentielle pour améliorer le taux d’occupation et le taux d’appariement. Au cours de la lyse cellulaire, une méthode d’étanchéité à l’huile est utilisée pour isoler les surfaces des micropuits, empêchant ainsi la contamination croisée entre les puits. Notamment, l’huile minérale doit être ajoutée immédiatement après la lyse sans délai. Après la lyse, la récupération du cordon par code-barres est effectuée en déplaçant lentement l’aimant de l’entrée à la sortie pour assurer un taux de récupération élevé du billet. Si nécessaire, cette étape peut être répétée plusieurs fois. Enfin, les billes magnétiques récupérées dans le tube à centrifuger subissent une RT, une synthèse sur second brin, une amplification par PCR et la construction d’une banque, suivie d’un séquençage de nouvelle génération (NGS).

Cette plateforme microfluidique intégrée présente un potentiel important pour des applications cliniques. En améliorant l’efficacité et le débit de l’isolement des CTC, il augmente la détection des CTC aux stades de faible charge tumorale, ce qui permet d’établir un modèle de classification reliant le nombre de CTC à la stadification tumorale. Cette avancée offre une nouvelle approche pour le diagnostic du cancer, la surveillance du traitement, l’évaluation du pronostic et la prédiction de la récidive. De plus, l’analyse transcriptomique unicellulaire des CTC permet d’identifier des caractéristiques moléculaires clés, notamment les voies génétiques essentielles, les réseaux d’interaction et les gènes biomarqueurs. Cette analyse donne un aperçu des facteurs critiques à l’origine des métastases cancéreuses précoces et dévoile les mécanismes moléculaires sous-jacents à la formation de lésions métastatiques, offrant des cibles thérapeutiques potentielles pour les patients atteints d’un cancer récidivant ou métastatique. De plus, cette plateforme est hautement évolutive. Il peut être adapté pour répondre à des exigences analytiques spécifiques et étendu pour prendre en charge les analyses multiomiques, y compris la transcriptomique et la génomique.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Mercaptopropyl) triméthoxysilane  ;Sigma Aldrich175617-100GSolution MPTS
20 et fois ; Tampon SSCSangon BiotechB548109-0200
5 et fois ; Tampon RTSangon BiotechB610020-0500
Anticorps monoclonal biotinylé CD45eBioscience13-0459-82Stockage à 2°Deg ; De C à 8°C ; C  ;
Anticorps monoclonal EpCAM biotinyléeBioscience13-9326-82Stockage à 2°Deg ; De C à 8°C ; C  ;
Albumine sérique bovine (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Stockage à 2°Deg ; De C à 8°C ; C  ;
Décodeur Puce cartoucheBiosystèmes dynamiques2203106Stockage à 2°Deg ; De C à 8°C ; C  ;
Kits de réactifs pour cartouches décodeursBiosystèmes dynamiques2203206Stockage à 2°Deg ; De C à 8°C ; C  ;
Eau traitée par le DEPCSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Contient : NaCl 136,89 mM ; KCl 2,67 mM ; Na2HPO4 8,10 mM ; KH2PO4 1,47 mM. pH=7,2-7,4  ;
TDTThermo ScientificR0861Stockage à 2°Deg ; De C à 8°C ; C  ;
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MBs, 1 & MU ; m
EDTASangon BiotechB540625-05000,5 M, pH=8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012 et fois ; Mélange de réactions PCR
Précipitation au chlorure de lithium Soln.InvitrogenAM94800,2 & micro ; Filtré M
N-&gamma ;-ester de maléimidobutyryl-oxysuccinimideThermo Scientific22309Solution GMBS
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Qubit 1 et les fois ; Kit dsDNA HS AssayThermo ScientificQ33231
SDS SolutionSangon BiotechB648118-010010 % SDS
StreptavidineSigma Aldrich189730Stockage à 2°Deg ; De C à 8°C ; C  ;
Photorésine SU-8MicroChemSU-8 3050
Kit d’élastomère silicone SYLGARD 184Dow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7,5)LEAGENENR00721 mol/L, pH = 7,5, sans RNASE
Tris-HCl (pH 8,0)LEAGENENR00731 mol/L, pH = 8,0, sans Rnase
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Trueprep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina  ;VazymeTD502Kit de préparation de bibliothèque ADN
Préadolescent-20Sangon BiotechA600560-0500
Billes d’ADN propres VAHTSVazymeN411Billes magnétiques d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI) pour la purification de l’ADN

References

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