Métabolomique spatiale multimodale avec imagerie par spectrométrie de masse guidée par microscope dans l’infrarouge moyen

Résumé

Nous présentons un flux de travail métabolomique spatial multimodal qui intègre l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) et l’imagerie dans l’infrarouge moyen (MIR) sur la même section de tissu pour une analyse métabolique et biochimique résolue dans l’espace.

Résumé

La métabolomique spatiale est un domaine en évolution rapide pour cartographier la distribution des métabolites dans les tissus, les organes et même les cellules individuelles. Cette approche fournit des informations métaboliques contextuelles, ce qui est essentiel pour comprendre l’hétérogénéité biochimique des systèmes biologiques. L’imagerie dans l’infrarouge moyen (MIR) et l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) sont devenues des approches puissantes pour la métabolomique spatiale, chacune offrant des avantages uniques et complémentaires. Dans cette étude, nous présentons un flux de travail pour effectuer l’imagerie MIR et la désorption ionisation laser assistée par matrice MSI (MALDI-MSI) sur la même section de tissu, englobant les procédures expérimentales, le co-enregistrement de l’imagerie, l’intégration des données et l’analyse bioinformatique. L’imagerie MIR est utilisée comme modalité en amont, permettant une analyse biochimique non destructive des tissus. Par la suite, une matrice est déposée dans le tissu pour MALDI-MSI, guidée par les informations spatiales obtenues à partir de l’imagerie MIR. Les images sont intégrées à la suite d’un co-enregistrement, ce qui permet une analyse métabolomique spatiale multimodale à l’aide d’outils bioinformatiques avancés tels que Seurat. L’intégration de l’imagerie MIR et de la MSI représente une avancée transformatrice dans la métabolomique spatiale, offrant des opportunités sans précédent d’explorer la complexité spatiale et chimique des processus métaboliques dans la santé et la maladie. Cette approche multimodale présente un potentiel important pour stimuler les innovations dans la découverte de biomarqueurs, le diagnostic des maladies et le développement thérapeutique.

Introduction

La métabolomique spatiale consiste à cartographier les métabolites dans leur contexte tissulaire natif en intégrant l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI), ou d’autres techniques spatialement résolues, avec l’analyse métabolique, offrant des informations sur le métabolisme à une résolution sous-tissulaire, cellulaire ou subcellulaire 1,2,3,4,5,6,7,8 . Parmi ces modalités d’imagerie, la microscopie dans l’infrarouge moyen (MIR) attire de plus en plus l’attention pour sa capacité à cartographier chimiquement les biomolécules sur la base du contraste vibratoire moléculaire 4,7,9,10,11,12. La nature non destructive, sans marquage, à grande vitesse et rentable 4,7,9,10,11,12 rend l’imagerie MIR particulièrement bien adaptée à l’intégration avec MSI, formant une approche multimodale prometteuse pour une analyse spatiale complète.

La désorption par ionisation laser assistée par matrice MSI (MALDI-MSI) est l’une des techniques les plus utilisées en métabolomique spatiale (Figure 1A)¹³. Il permet la détection d’un large éventail de métabolites, y compris les lipides, les acides aminés, les sucres, les nucléotides et les métabolites secondaires, avec une sensibilité élevée¹. Les progrès réalisés dans la sélection matricielle (p. ex., l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque [DHB], la 9-aminoacridine [9AA] ou le dichlorhydrate de N-(1-naphtyl)éthylènediamine [NEDC]) et les techniques d’ionisation (p. ex., les méthodes de post-ionisation) ont encore élargi la couverture de détection, en particulier pour les espèces peu abondantes et faiblement ionisables¹⁴. Les systèmes MALDI-MSI modernes prennent en charge des vitesses d’imagerie allant généralement de 5 à 50 pixels par seconde, en fonction de la résolution spatiale et du type d’analyseur de masse utilisé (par exemple, temps de vol [TOF], Orbitrap ou résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier [FT-IRC]). Notamment, les instruments MALDI-TOF à grande vitesse ont atteint des taux supérieurs à 100 pixels par seconde, permettant une imagerie de grande surface en quelques heures¹⁵. La résolution spatiale de MALDI-MSI se situe généralement entre 5 et 50 μm, suffisante pour résoudre les structures cellulaires et même subcellulaires^16,17. Cependant, une résolution spatiale plus élevée se fait généralement au prix de temps d’acquisition plus longs, d’un rapport signal/bruit réduit et de demandes de calcul plus importantes lors du traitement des données.

Contrairement à MSI, l’imagerie MIR est une approche optique à large champ⁴, ce qui la rend intrinsèquement non destructive et à haut débit. Les progrès récents dans les lasers à cascade quantique (QCL) de haute puissance permettent un nouveau cadre connu sous le nom d’imagerie infrarouge à fréquence discrète (DFIR), qui augmente considérablement la vitesse d’imagerie jusqu’à la fréquence vidéo (Figure 1B)^12,18. De plus, les sources QCL ont rendu les détecteurs microbolométriques non refroidis viables pour l’imagerie MIR, permettant l’utilisation de détecteurs à réseau de plans focaux (FPA) plus grands¹². En conséquence, une image MIR monofréquence sur une zone de 1 cm² peut être acquise avec une résolution cellulaire (~5 μm) en quelques secondes seulement. L’imagerie MIR peut fonctionner à la fois en mode sans marquage et en mode étiqueté. Dans des études précédentes ^4,19,20, de petites sondes vibrationnelles actives IR ont été introduites pour surveiller la cinétique de diverses activités métaboliques in situ. Ces sondes permettent de suivre en temps réel les voies métaboliques en signalant les transformations chimiques mondiales via des bandes spectrales MIR uniques⁴. Ainsi, l’imagerie MIR fournit à la fois un profilage biochimique statique et une surveillance métabolique dynamique avec une résolution spatiale élevée et une vitesse d’acquisition rapide.

Dans ce manuscrit, nous présentons un flux de travail complet pour effectuer des métabolomiques spatiales MALDI-MSI guidées par MIR, démontrant ainsi la faisabilité d’acquérir les deux modalités à partir du même spécimen (Figure 2, Figure 3). En intégrant l’imagerie MIR à la MSI, nous établissons une approche multimodale qui tire parti des forces complémentaires de chaque technique. L’imagerie MIR offre une cartographie biochimique rapide et sans marquage de l’ensemble de la lame à la résolution cellulaire, servant de guide précieux pour la sélection de la région d’intérêt (ROI) lors de l’acquisition ultérieure de MSI. Cette stratégie permet un flux de travail MSI plus ciblé et plus efficace, réduisant le temps et le coût d’acquisition tout en améliorant l’interprétabilité et la pertinence biologique des données métabolomiques spatiales. À son tour, MSI fournit des annotations moléculaires très détaillées des images hyperspectrales MIR, permettant une compréhension plus approfondie de la biochimie tissulaire. Dans l’ensemble, cette approche intégrée présente un grand potentiel pour faire progresser la découverte de biomarqueurs, le diagnostic des maladies et le développement thérapeutique.

Protocole

Le protocole a été réalisé conformément au protocole expérimental sur les animaux (DSF-2024-004) approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre de ressources pour les animaux de laboratoire de l’Université Fudan.

REMARQUE : Cette étude fournit un flux de travail pour effectuer l’imagerie MIR et MALDI-MSI sur la même section de tissu. Cette approche intégrée englobe les procédures expérimentales, le co-enregistrement d’images, la fusion de données et l’analyse bioinformatique en aval (Figure 1C). L’imagerie MIR est utilisée comme modalité en amont, permettant une cartographie biochimique non destructive et sans marquage du tissu. Guidée par les informations spatiales de l’imagerie MIR, une matrice est ensuite appliquée pour l’acquisition de MALDI-MSI. Après un co-enregistrement précis, les ensembles de données sont intégrés pour une co-analyse multivariée (Figure 4), permettant une métabolomique spatiale complète grâce à des outils de calcul avancés.

1. Préparation de l’échantillon

1. Préparation d’échantillons de tissus
   1. Prélèvement de tissus de souris
      1. Souris C57BL/6J (âgées de 20 semaines, 40 g) dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS), maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ayant un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pour assurer une santé optimale avant l’expérience.
      2. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à une dose de 50 mg/kg de poids corporel pour assurer une anesthésie profonde. Surveiller l’animal et confirmer l’absence de réflexes pédalier et cornéen avant de procéder à la perfusion.
      3. Perfuser environ 20 à 30 ml de PBS froid contenant de l’héparine (5 UI/mL) à travers le ventricule gauche à une pression contrôlée de 150 mmHg pendant 6 minutes pour évacuer le sang et exsangiser l’organe avant de le retirer.
      4. Trempez immédiatement tous les tissus collectés avec de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
         REMARQUE : Une congélation rapide est essentielle pour éviter la formation de cristaux de glace, ce qui peut déformer la morphologie des tissus.
   2. Enrobage tissulaire et cryo-sectionnement
      1. Réglez le microtome à -20 °C et décontaminez la chambre et la lame avec de l’éthanol (EtOH) pour éliminer le milieu d’enrobage résiduel. Laissez les lames CaF₂ , l’enveloppe de lames, le porte-échantillon et l’échantillon de tissu s’équilibrer dans le cryostat.
      2. Coupez le tissu à environ 5 mm × 5 mm × 3 mm. Intégrez-le dans de la gélatine à 10 % dans un cryomoule standard à -20 °C, en assurant une bonne orientation pour le sectionnement. Congelez l’échantillon incrusté sur de la glace sèche et conservez-le à -80 °C jusqu’à la cryosection.
      3. Extrayez le tissu de son moule, coupez l’excès de matériau pour optimiser la section et fixez-le sur le porte-échantillon à l’aide d’eau ultrapure pour assurer une adhérence stable.
      4. Coupez des sections de 10 μm d’épaisseur et immobilisez-les sur des substrats CaF₂ pré-enduits et stockez-les à -80 °C.
      5. Placez les sections de tissu montées dans un lyophilisateur sous vide avant l’imagerie infrarouge moyen. Réglez la pression de la chambre sur 0,1 mPa et la température sur -100 °C. Sécher les échantillons pendant 30 min.
2. Préparation d’échantillons cellulaires
   1. Implanter 1,25 × 10^{cellules 5} HeLa sur des substrats circulaires CaF₂ de 13 mm de diamètre placés dans des plaques de culture standard. Utilisez du milieu modifié Dulbecco’s à haute teneur en glucose (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Incuber les cellules dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % CO₂) pendant 24 h.
   2. Après 24 h, retirez soigneusement le milieu et fixez les cellules en les incubant dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dissous dans un tampon PBS pendant 20 min à température ambiante (RT).
   3. Rincez trois fois les cellules fixes avec un tampon HBSS, puis lavez-les trois fois de plus avec du ddH₂O.
   4. Faites sécher complètement les substrats CaF₂ à l’air libre à RT avant de passer à l’imagerie MIR.

2. Acquisition d’images multimodales

1. Acquisition d’images MIR par laser à cascade quantique (QCL)
   1. Effectuez une microscopie imageuse QCL MIR à l’aide d’un microscope QCL-MIR équipé d’un microbolomètre refroidi par liquide non N₂, d’un détecteur FPA 520 × 480 et d’une technologie de réduction de la cohérence spatiale.
   2. Sélectionnez la plage spectrale de 950 ^cm-1 à 1800 ^cm-1.
   3. Utilisez un objectif 4× avec une ouverture numérique (NA) de 0,6, ce qui donne une taille nominale de pixel de 4,25 μm.
   4. Collectez un spectre de fond sur un substrat CaF₂ propre à une résolution spectrale de 4 ^cm-1 .
   5. Sélectionnez la zone d’acquisition en fonction de la morphologie des tissus et collectez des données spectrales à une résolution spectrale de 4 ^cm-1. À cette résolution spectrale, la vitesse d’acquisition de l’image est d’environ 0,3 mm²/s.
      REMARQUE : Toutes les mesures sont effectuées en mode transmission à l’aide de glissières CaF₂ , avec réglage manuel de la mise au point.
2. Acquisition d’images par spectrométrie de masse
   1. Application matricielle
      1. Utilisez les coupes tissulaires post-MIR pour MALDI-MSI, appliquez des marqueurs repères autour du tissu à l’aide d’un stylo Tippex et capturez une image optique pré-MSI avec un scanner à plat pour le recalage des images.
      2. Préparez la matrice NEDC à 7 mg/mL dans du méthanol/acétonitrile/eau désionisée (V/V/V=75:25:5), puis filtrez à travers une membrane de 0,2 μm pour éliminer les particules.
      3. Chargez les lames de tissu marquées dans un pulvérisateur matriciel automatisé. Distribuez la matrice NEDC sur l’échantillon à l’aide des paramètres prédéfinis.
   2. Mesure MALDI-MSI
      1. Déposez 0,2 μL de suspension de phosphore rouge sur la lame CaF₂ pour servir d’étalon de masse externe.
      2. Fixez la glissière revêtue de matrice dans l’adaptateur de glissière, en assurant un contact électrique optimal avec le support. Chargez la plaque dans un système MALDI-MSI.
      3. Alignez l’image optique de la diapositive avec les coordonnées du moteur XY de l’étage MALDI à l’aide de repères. Définissez des retours sur investissement pour l’analyse des tissus et incluez une zone « matricielle uniquement » comme contrôle négatif.
      4. Configurez l’instrument en mode ionique négatif avec une taille de pixel de 20 × 20 μm², couvrant une plage m /z de 50 à 1000. Effectuez l’étalonnage de masse à l’aide de la tache de phosphore rouge avant de lancer l’acquisition des données. Effectuer l’acquisition de données à l’aide d’une plateforme d’analyse de données commerciales.

3. Prétraitement et analyse des données d’image

REMARQUE : les codes personnalisés MATLAB sont téléchargés dans le fichier supplémentaire 1.

1. Prétraitement et analyse des données QCL-MIR
   1. Prétraitement des données
      1. Exportez les données hyperspectrales dans un format approprié pour une analyse plus approfondie.
      2. Effectuez le prétraitement des données à l’aide de CytoSpec et MATLAB, en suivant ces étapes 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. Importez les données spectrales MIR dans CytoSpec v2.00.07 pour le prétraitement.
      4. Évaluez la qualité spectrale à l’aide du module de tests de qualité intégré à CytoSpec. Sélectionnez le critère 2 (épaisseur de l’échantillon) pour évaluer la consistance de l’échantillon. Réglez la plage d’intégration spectrale sur 950-1800 ^cm-1. Définissez les seuils d’absorbance entre 50 et 1000 unités pour exclure les spectres provenant de régions excessivement minces ou épaisses.
      5. Réduisez le bruit à l’aide du filtrage basé sur l’ACP dans CytoSpec. Conservez les 10 premiers composants principaux (PC) pour éliminer le bruit à haute fréquence tout en préservant la variance biochimique clé.
      6. Exportez les données spectrales prétraitées de CytoSpec au format .mat pour une analyse plus approfondie dans MATLAB.
      7. Effectuez une correction de la ligne de base dans MATLAB à l’aide d’un algorithme de correction d’élastique sur la plage spectrale de 950 à 1800 ^cm-1 pour éliminer la dérive de la ligne de base et améliorer la précision spectrale.
      8. Appliquez la normalisation spectrale à l’aide d’une mise à l’échelle min-max sur la même plage spectrale afin de normaliser les intensités sur tous les spectres et d’assurer la comparabilité dans l’ensemble des données.
   2. Analyse des données
      1. Identifier les caractéristiques associées aux protéines à 1 550 ^cm-1 et 1 650 ^cm-1, correspondant respectivement aux bandes d’amide II et d’amide I. Identifier les caractéristiques associées aux lipides à 1 740 ^cm-1, représentant la vibration d’étirement de l’ester C=O.
      2. Calculez le rapport d’intensité de la bande Amide I (1650 ^cm-1) à l’étirement ester C=O (1740 ^cm-1) et générez des cartes de rapport pour visualiser la distribution spatiale des lipides aux protéines.
      3. Analyse de cluster non supervisée : effectuez une analyse de clustering hiérarchique (HCA) sur des données hyperspectrales à l’aide de la distance euclidienne et de la liaison de Ward pour classer les régions en fonction de la similarité spectrale. Générez des cartes de grappes pour identifier des régions biochimiquement distinctes et révéler les différences structurelles ou pathologiques.
2. Prétraitement et analyse des données MSI
   1. Importez les données MSI brutes dans une plateforme d’analyse de données commerciales.
   2. Effectuez une sélection de pointe avec une intensité relative > 0,01 %.
   3. Excluez les pics dérivés de la matrice de la liste des pics expérimentaux en les comparant au spectre obtenu à partir d’une région de contrôle de matrice uniquement. Supprimez tous les pics qui apparaissent dans le spectre de contrôle et dont le rapport signal/bruit (SNR) est inférieur à 3.
   4. Normalisez l’ensemble de données à la racine carrée moyenne (RMS) pour tenir compte de la variabilité de l’intensité du signal ionique entre les pixels et les échantillons.
   5. Affinez l’identification des métabolites en filtrant les caractéristiques en fonction de leur distribution tissulaire, de la correspondance avec les entrées de la base de données sur le métabolome humain (HMDB) et de l’accord avec les valeurs théoriques m/z.
   6. Sélectionnez les métabolites pertinents en fonction des objectifs expérimentaux et du contexte tissulaire.
   7. Exportez les intensités des entités sélectionnées pour tous les pixels sous forme de fichier CSV.
   8. Appliquer des techniques de réduction de la dimensionnalité (par exemple, PCA, t-SNE ou UMAP) pour réduire la complexité des données et identifier des groupes de pixels avec des signatures métaboliques similaires à l’aide d’outils bioinformatiques tels que Seurat et Banksy, facilitant ainsi la visualisation de l’hétérogénéité métabolique spatiale.

4. Co-enregistrement et co-analyse d’images multimodales

1. Sélectionnez l’image MIR acquise à 1650 ^cm-1 comme référence spatiale pour le co-enregistrement. Ce numéro d’onde spécifique met en évidence la bande protéique amide I, offrant un fort contraste tissulaire.
2. Normalisez les valeurs d’intensité des images MIR et MSI pour améliorer la comparabilité visuelle. Appliquez des techniques d’amélioration du contraste, telles que l’égalisation d’histogramme à l’aide de la fonction histeq dans MATLAB, pour redistribuer les intensités d’image et améliorer la visibilité des caractéristiques structurelles essentielles à la sélection des points de repère.
3. Chargez les images MIR et MSI dans MATLAB à l’aide de la fonction cpselect de la boîte à outils de traitement d’image. Cette fonction ouvre une interface interactive pour la sélection de points de repère.
4. Annotez manuellement cinq à dix points de contrôle anatomiquement pertinents et bien répartis sur les images MIR et MSI à l’aide de la fonction cpselect . Ces repères doivent correspondre à des caractéristiques morphologiques distinctes telles que les limites tissulaires.
   REMARQUE : Répartissez les points de contrôle uniformément sur le champ de l’image afin de minimiser la distorsion localisée.
5. Exportez et enregistrez les coordonnées des points de contrôle annotés à partir des deux images. Stockez-les sous la forme de deux tableaux correspondants pour le calcul de la transformation (par exemple, movingPoints et fixedPoints).
6. Calculez une matrice de transformation affine à l’aide de la fonction MATLAB fitgeotrans en mode Fine . Cette transformation tient compte de la mise à l’échelle, de la rotation, de la translation et du cisaillement.
7. Appliquez la transformation calculée à l’image MSI à l’aide de la fonction imwarp dans MATLAB. Cette étape génère une image MSI enregistrée spatialement qui est alignée géométriquement sur le cadre de référence MIR.
8. Inspectez visuellement l’alignement à l’aide de la fonction imshowpair en mode fusion pour superposer les images MSI et MIR et confirmer le bon repérage des caractéristiques structurelles.
9. Convertissez à la fois l’image MSI enregistrée et l’image MIR de référence en masques binaires à l’aide de la fonction imbinarize dans MATLAB.
10. Calculez le coefficient de similarité des dés (DSC) pour quantifier le chevauchement spatial entre les deux masques binaires. La DSC est définie comme suit : DSC = 2 × (aire de chevauchement)/(aire totale des deux masques). Une valeur DSC proche de 1,0 indique une superposition spatiale et une précision de recalage élevées.
    REMARQUE : Si nécessaire, affinez l’enregistrement en ajustant le nombre ou l’emplacement des points de contrôle et en répétant le processus de transformation. Envisagez des méthodes d’enregistrement non rigides si des désalignements locaux persistent.
11. Enregistrez l’image enregistrée, les paramètres de transformation et les coordonnées de repère pour l’analyse d’images multimodales en aval, telles que la corrélation spatiale des caractéristiques biochimiques et structurelles.

Résultats

Pour valider la stratégie de métabolomique spatiale multimodale décrite ci-dessus, nous l’avons implémentée dans un modèle murin de cancer. Les cellules tumorales ont été génétiquement modifiées pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP), permettant une localisation précise de la région tumorale grâce à l’imagerie par fluorescence. La figure 2A montre des résultats d’imagerie QCL-MIR sans marquage avec une couverture spectrale de 950 à 1800 ^cm-1, connue sous le nom de « ré...

Discussion

Ici, nous présentons une stratégie de métabolomique spatiale multimodale qui intègre l’imagerie MSI et MIR pour permettre un profilage métabolique moléculairement spécifique à haut débit sur les mêmes échantillons. L’imagerie MIR permet une cartographie chimique non destructive sans marquage basée sur les vibrations moléculaires, fournissant des informations structurelles et fonctionnelles détaillées sur les groupes. En revanche, le MSI offre une sensibilité et une spécificité élevées po...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4 % de paraformaldéhyde, solution de fixation	tissulaire Sangon Biotech	;
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc souris	Charles River	219
CaF2 lames	Crystran	CAFP25-1
Cryostat microtome	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	Version 2.10.01	Logiciel pour l’analyse des données MIR, y compris la correction de la ligne de base, la normalisation, la génération d’images et l’analyse hyperspectrale.
Tampon DPBS	Fisher Scientific  ;	14-190-250
Sérum fœtal bovin	Gibco	10270106
Lyophilisateurs	LABCONCO	FreeZone
Gelatin  ;	Sigma-Aldrich	G1890 Type	A, à partir de peau porcine
Tampon HBSS	Sangon Biotech	;
DMEM à haute teneur en glucose	ThermoFisher Scientific  ;
Matlab	MathWorks	Matlab R2024a	pour l’analyse des données MIR, y compris la correction de la ligne de base, la normalisation, la génération d’images et l’analyse hyperspectrale.
Système d’imagerie par spectrométrie de masse par désorption ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI-MSI)	Bruker Daltonics GmbH  ;	timsTOF fleX MALDI-2
Méthanol	Sinopharm Réactif	chimique 10014108
mMass	Institute of Entomology, Biology Centre of the Czech Academy of Sciences, Czech Republic	Version 5.5.0	Logiciels pour l’analyse des données MSI. Importez les données MSI brutes dans SCILS Lab pour le prétraitement.  ; Effectuer le pic de prélèvement en mMass avec une intensité relative > 0,01 %.
Matrice de dichlorhydrate de N-(1-naphtyl)éthylènediamine (NEDC)  ;	Sigma Aldrich	222488
Pénicilline-streptomycine	ThermoFisher Scientific  ;
Laser à cascade quantique »nbsp ; microscopie dans l’infrarouge moyen (QCL-MIR)	; Bruker Optics GmbH	LUMOS II ILIM
Phosphore rouge	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS Lab	Bruker Daltonics	SCiLS Lab 2024b	Logiciels pour l’analyse de données MSI. Importez les données MSI brutes dans SCILS Lab pour le prétraitement.  ; Effectuer le pic de prélèvement en mMass avec une intensité relative > 0,01 %.
Pulvérisateur	HTX Technologies	TM
Trypsine, 0,25 % EDTA	ThermoFisher Scientific  ;