Préparation des extraits de plantes
Un premier spécimen de Piper amalago var. amalago a été prélevé en février 2018 et laissé sécher à l’air libre pendant une période de 72 heures. Le spécimen a été identifié par le botaniste et le conservateur de l’herbier. Le spécimen a été monté, sous les numéros de référence 36616 et 36617, et déposé dans l’herbier de l’Université des Indes occidentales, à Mona, en Jamaïque. Des échantillons de plantes ont ensuite été prélevés pour préparer des extraits d’éthanol ou d’hexane. Les extractions ont été effectuées comme suit : les feuilles, les tiges et les feuilles et tiges séchées ont été pulvérisées, puis immergées dans 350 mL d’éthanol ou d’hexane de qualité analytique pendant 72 h. Après la période de 72 heures, chaque extrait a été filtré par aspiration à l’aide d’un entonnoir Büchner tapissé de papier filtre de 90 mm, avec une pompe à vide attachée, pour séparer les particules végétales de l’extrait. L’extrait a ensuite été concentré par évaporation rotative, décanté et placé sous une hotte pour éliminer l’excès de solvant23. La masse finale de chaque extrait a été obtenue. Pour éviter une éventuelle oxydation des extraits, du matériel végétal a été régulièrement collecté et extrait.
Élevage de moustiques
Les larves et les pupes d’Ae. aegypti ont été récoltées dans les sites de reproduction des moustiques des communautés des paroisses de Kingston et de St. Andrew (KSA), Jamaica51, initialement, en septembre 2019, et les générations suivantes (F1 à F12) ont été élevées. Les moustiques ont été maintenus à une température constante de 27 ± 2 °C et à 70 % ± 10 % d’humidité dans un incubateur. Des souches d’Ae. aegypti de la Nouvelle-Orléans (NO) ont été utilisées comme souche témoin pour toutes les expériences. Régulièrement, les larves étaient maintenues dans des plateaux et nourries avec des granulés de carpes koï jusqu’à la nymphose. Les pupes ont été retirées et transférées dans des gobelets dans des cages d’élevage d’insectes par souche. Les moustiques adultes ont reçu 10 % de saccharose à volonté. Par la suite, des collectes de moustiques ont été effectuées pour maintenir leurs populations à un niveau proche de celui des moustiques capturés sur le terrain.
Tests de résistance aux insecticides (IR)
La sensibilité de la souche KSA à la deltaméthrine a été évaluée à l’aide du dosage en bouteille 52,53,54 des Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Des bioessais en bouteille ont été effectués sur des femelles adultes âgées de 3 à 5 jours. Des adultes non nourris au sang (n = 20-25) ont été transférés de leur cage à l’aide d’un aspirateur alimenté par aspiration par inhalation dans des flacons de 250 mL, pré-enrobés de deltaméthrine à la dose diagnostique du CDC de 10 μg/flacon. Les flacons de contrôle ont été pré-enduits d’acétone. La mortalité a été enregistrée toutes les 15 min jusqu’à 2 h53,54. Les moustiques étaient considérés comme morts s’ils étaient incapables de se tenir debout53,54. L’expérience a été répétée trois fois. Les moustiques testés ont été classés comme sensibles ou résistants selon les directives53,54 du CDC.
Dosage insecticide - Application topique
Chaque extrait de plante préparé a été remis en suspension dans de l’éthanol pour obtenir une solution mère initiale (1 mg/μL), puis dilué en série (0-0,25 mg/μL) à l’aide d’éthanol. L’extrait remis en suspension a été appliqué localement sur le thorax de moustiques femelles adultes non nourries de sang âgées de 3 à 5 jours et non nourries de sang (n = 10) selon les méthodes précédemment publiées 23,24,55. Brièvement, les moustiques femelles ont été transférées de leur cage à l’aide d’un aspirateur d’inhalation à des tasses et anesthésiées/renversées sur de la glace. L’extrait remis en suspension, 0,2 μL, a été appliqué sur le thorax dorsal à l’aide d’une seringue de 10 μL de la série 700 fixée à un distributeur répétitif. Pour le groupe témoin, de l’éthanol, 0,2 μL, a été appliqué localement. Après chaque exposition au traitement, les moustiques ont été transférés dans des gobelets en papier et nourris avec une solution de saccharose à 10 %. Des changements dans le vol ou la démarche des moustiques, le cas échéant, ont été notés pendant les 5 premières heures suivant l’exposition initiale. La mortalité a été enregistrée à 24 h dans des conditions insectifiques standard. Chaque concentration d’essai a été réalisée en trois exemplaires. L’expérience a été menée deux fois.
Dosages synergiques
Pour déterminer le potentiel de l’extrait en tant que synergiste, un essai biologique modifié en bouteille avec un synergiste a été utilisé23. Des moustiques femelles non nourries de sang, âgées de 3 à 5 jours (n = 20-25), ont été exposées localement à de l’extrait de plante à la dose létale de 25 % (DL25) pendant qu’elles étaient anesthésiées/renversées, comme décrit ci-dessus. Les moustiques ont été transférés dans une tasse en filet et observés pendant 1 h. Après 1 h de vol actif, les moustiques ont été délicatement retirés des gobelets à l’aide d’un aspirateur alimenté par l’aspiration de l’inhalation55, puis transférés dans des bouteilles pré-enrobées de 10 μg de deltaméthrine (bouteilles enrobées totales = 4). L’éthanol a été utilisé comme agent de contrôle pour l’application topique. Les flacons de contrôle étaient recouverts d’acétone. Le taux de mortalité a été observé toutes les 15 minutes jusqu’à 2 h ou jusqu’à ce que 100 % de mortalité soit atteint. L’efficacité de l’extrait en tant que synergiste a été comparée à celle d’un synergiste connu, le butoxyde de pipéronyle (PBO), comme suggéré précédemment53,54. Initialement, les moustiques ont été exposés à des bouteilles traitées avec 400 μg de PBO pendant 1 h. Après 1 heure d’exposition, les moustiques ont ensuite été transférés dans des tasses en filet et nourris avec une solution de sucre à 10 %. Après 1 h, les moustiques ont été transférés doucement à l’aide de l’aspirateur dans des bouteilles enrobées de 10 μg de deltaméthrine (bouteilles enrobées totales = 4)53,54. Les moustiques ont été observés toutes les 15 minutes jusqu’à 2 heures ou jusqu’à ce que la mortalité atteigne 100 %. L’expérience a été menée trois fois.
Caractérisation d’extraits de plantes par chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse (GC - MS) et chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
L’extrait de P. amalago var. amalago a été analysé par système GC-MS couplé à un détecteur sélectif en masse avec colonne DB-5 ms (60 m × 0,25 mm ; épaisseur du film de 0,25 μm). De l’hélium pur a été utilisé comme gaz porteur à un débit de 1 mL/min. Le programme de température a été lancé à 45 °C et a augmenté à un taux de 1 °C/min à 280 °C, puis à 2 °C/min. Les températures de l’injecteur et du détecteur ont été maintenues à 210 °C et 220 °C, respectivement. Le volume d’injection de l’extrait était de 1 μL. Les indices de rétention ont été calculés à l’aide de la procédure de Kovats. Les composés de l’extrait ont été identifiés en comparant les données spectrales de masse avec celles de la bibliothèque NIST (Mass Spectral Database) 17 du National Institute of Standards and Technology, comme décrit précédemment56.
L’identification du composé présent a été réalisée par comparaison de l’extrait avec un étalon de référence à l’aide de la CLHP. La séparation de l’extrait a été effectuée à l’aide d’une HPLC en phase stationnaire. La colonne utilisée était en C-18, avec 75 % d’acétonitrile et 25 % d’eau comme solvants. L’extrait a été normalisé par rapport au principal produit phytochimique identifié avec un niveau de confiance de 99 % par l’analyse GC-MS.
Essais in vitro du CYP sur les moustiques
La cinétique de Michaelis-Menten a d’abord été calculée pour CYP9J32 (90 pmol/mL ; Km 19,52 μM), la concentration utilisée dans le dosage inhibiteur. Des dosages du CYP ont été réalisés à l’aide de l’extrait de pipérine purifié dissous à une concentration finale d’acétonitrile de 0,1 %. Le substrat fluorogénique, le DEF, a été dissous dans du DMSO. La concentration finale de DMSO était de 0,5 %. Un témoin de solvant préparé avec 0,5 % de DMSO et 0,1 % d’acétonitrile final a été testé pour corriger les effets des solvants dans toute la plage de dilution. Comme référence pour comparer la propriété inhibitrice de la pipérine, la deltaméthrine et le PBO ont été utilisés comme témoins standard. La procédure a suivi des méthodes similaires à celles décrites précédemment23. Les réactions enzymatiques ont été réalisées dans des plaques à 96 puits, dans une solution tampon de phosphate de potassium de 50 mM avec 5 mM de MgCl2, ajustée à un pH de 7,4, tout en faisant varier la concentration du composé d’essai. Toutes les réactions ont été pré-incubées à 37 °C pendant 5 min, tout en maintenant 420 tr/min sur un agitateur. Un système générateur de NADPH, composé de NADP+ (0,001 mM), de glucose-6-phosphate (0,025 mM) et de glucose-6-phosphate déshydrogénase (5 unités/mL), a été ajouté pour amorcer la réaction. Le volume final dans chaque puits était de 200 μL. Les réactions ont été suivies à 485 nm/530 nm (excitation/émission) à l’aide d’un spectrophotomètre de fluorescence avec incubateur et agitateur. Les données inhibitrices sont présentées sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne (SEM). Les analyses ont été réalisées en trois exemplaires.
Modélisation d’homologie
Des modèles structurels préliminaires pour CYP9J32 (Ae. aegypti) ont été construits à l’aide d’AlphaFold57. Le groupe hème a été positionné suite à un alignement structurel avec Homo sapiens CYP3A4 (PDB ID : 6DAA)58. Une simulation de la dynamique moléculaire des coordonnées structurelles de la CYP9J32 dans l’eau a été réalisée à l’aide des paramètresdécrits précédemment 23.
Amarrage moléculaire
Les coordonnées finales de la simulation de dynamique moléculaire décrite ci-dessus ont été utilisées pour effectuer des analyses d’amarrage moléculaire avec la pipérine en utilisant un protocole23 décrit précédemment.
Analyse des données
Les données de toxicité liées à l’utilisation d’insecticides sont présentées en % de mortalité ± d’écart-type (ET). Les essais de toxicité des extraits de plantes ont été réalisés en trois exemplaires. Les données des essais de toxicité de l’extrait de plante sont présentées sous forme de doses létales (concentration de l’extrait de plante par poids corporel d’Ae. Aegypti) à 50 % et 95 % de mortalité ± intervalle de confiance repère à 95 % (IC à 95 %) par population (R version 3.6.2). La mortalité dans le groupe témoin pour tous les essais de toxicité était inférieure à 20 %. La formule d’Abbott a été utilisée pour corriger le taux de mortalité dans chaque groupe traité lorsque nécessaire72. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de SPSS pour Windows (version 17.0). L’analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour déterminer les différences significatives (p < 0,05) entre les moyennes dans la mesure du possible.