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Article de méthode

Génération d’organoïdes cardiaques humains à partir de cellules souches embryonnaires par induction du mésoderme par étapes et auto-organisation 3D

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DOI :

10.3791/68738

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7 octobre 2025

 , 
1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode étape par étape pour générer des organoïdes cardiaques humains fonctionnels à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Il comprend des étapes de décongélation, de différenciation et de maturation des cellules, fournissant une plate-forme robuste pour le développement cardiaque et la modélisation des maladies.

Résumé

Les organoïdes cardiaques dérivés de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des structures tridimensionnelles (3D) multicellulaires qui récapitulent les aspects clés du développement et de la fonction cardiaques humains précoces. Ces organoïdes auto-organisés présentent une contractilité spontanée, l’expression de marqueurs cardiomyocytaires et une architecture tissulaire rappelant le myocarde natif. Ici, nous présentons un protocole robuste et reproductible pour générer des organoïdes cardiaques à partir de la raie H9 hESC via une différenciation de lignée par étapes. L’induction du mésoderme est initiée par le traitement des sphéroïdes pendant 36 à 40 h avec l’activine A (50 ng/mL), la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4, 10 ng/mL), le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2, 30 ng/mL), le laduviglusib (CHIR99021, 3 μM) et un inhibiteur de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) (LY294002, 5 μM). La spécification de la lignée cardiaque est ensuite dirigée par une exposition quotidienne pendant quatre jours à BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), un inhibiteur de la voie Wnt (XAV-939, 5 μM) et à l’acide rétinoïque (0,5 μM). La différenciation et la maturation des cardiomyocytes sont davantage favorisées à partir du jour 5,5 à l’aide de BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL) et d’insuline (10 μg/mL). La validation fonctionnelle est réalisée par imagerie time-lapse et analyse d’immunofluorescence, confirmant la génération de cardiomyocytes contractiles marqués par l’expression de la troponine T cardiaque (cTnT). De plus, l’immunomarquage 3D révèle la présence de α-SMA et de CDH5, indiquant l’émergence de populations de muscles lisses et de cellules de type endothéliale. Ces organoïdes cardiaques présentent constamment des contractions rythmiques ; Cependant, aucune validation électrophysiologique directe du couplage électromécanique n’a été effectuée. Les limitations connues comprennent l’incapacité de faire passer les organoïdes et la nécrose centrale potentielle lors de cultures prolongées. En résumé, ce modèle fournit une plate-forme évolutive et physiologiquement pertinente pour l’étude de la cardiogenèse humaine, des réponses aux médicaments et des cardiopathies congénitales.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde, ce qui souligne le besoin urgent de modèles in vitro fiables qui récapitulent le développement et la fonction cardiaques humains 1,2. Les cultures monocouches bidimensionnelles (2D) traditionnelles de cardiomyocytes, bien que précieuses, ne parviennent pas à reproduire la complexité spatiale, les interactions multicellulaires et l’intégration électromécanique du cœur humain natif 3,4. Les organoïdes cardiaques 3D dérivés de cellules souches pluripotentes sont apparus comme des plateformes puissantes qui répondent à ces limitations, fournissant des structures multicellulaires auto-organisées qui imitent la morphogenèse cardiaque précoce et la maturation fonctionnelle in vitro5.

Les CSEh, telles que la ligne H9, possèdent la capacité intrinsèque de se différencier en tous les types de cellules somatiques, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes cardiaques6. Dans des conditions de culture contrôlées, les CSEh peuvent être guidées à travers les étapes séquentielles de l’induction du mésoderme, de la spécification du mésoderme cardiaque et de la différenciation des cardiomyocytes 5,7. Ce processus par étapes peut être régulé à l’aide de molécules de signalisation et d’inhibiteurs spécifiques, notamment les inhibiteurs de l’activine A, BMP4, FGF2, PI3K, CHIR99021, Wnt et l’acide rétinoïque 5,8. En imitant étroitement l’environnement de signalisation in vivo du développement cardiaque embryonnaire, ces signaux favorisent une cardiogenèse in vitro efficace et reproductible 5,7.

Contrairement à de nombreux systèmes organoïdes qui nécessitent l’intégration dans des composants de matrice extracellulaire (ECM) tels que Matrigel, les organoïdes cardiaques peuvent s’auto-assembler dans des conditions de faible adhérence sans support matriciel 5,9. L’agrégation des CSEh différenciatrices en suspension produit des structures 3D sphériques qui présentent des battements spontanés au cours de la première semaine de différenciation10. Ces organoïdes contiennent des populations de cellules cardiaques fonctionnellement pertinentes et présentent des caractéristiques telles que l’organisation sarcomérique, les transitoires calciques et les contractions rythmiques11,12, offrant un modèle physiologiquement pertinent du tissu cardiaque humain précoce.

La capacité de générer des organoïdes cardiaques dérivés de CSEh offre des possibilités intéressantes pour la biologie du développement, la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et les tests de cardiotoxicité13,14. De plus, l’intégration avec les technologies d’édition du génome et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques au patient permet une modélisation personnalisée de la maladie et une exploration thérapeutique des troubles cardiaques héréditaires.

Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé, étape par étape, pour la génération d’organoïdes cardiaques à partir de cellules souches embryonnaires humaines, en mettant en évidence les étapes clés de la différenciation, les conditions de culture et les techniques de validation. Cette plate-forme fournit un système robuste et évolutif pour récapituler le développement cardiaque humain et établir une base pour la recherche translationnelle future.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des cellules souches embryonnaires humaines (H9) ont été menées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le Comité d’éthique biomédicale de la Southwest Medical University, approbation 20241023-031. Tous les travaux de culture tissulaire détaillés ci-dessous doivent être effectués dans une hotte à flux laminaire de classe II. Assurez-vous toujours que les milieux et les réactifs sont à température ambiante et équilibrés naturellement avant utilisation. N’utilisez pas un bain-marie pour réchauffer les supports.

1. Décongélation et culture régulière des CSES (H9)

  1. Revêtement à la vitronectine des plaques de culture
    1. Décongeler le bouillon de vitronectine sur de la glace et diluer à une concentration de travail de 10 μg/mL à l’aide d’un milieu E8 froid.
    2. Ajouter 1 mL par puits de la solution diluée de vitronectine dans une plaque à 6 puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 à 4 h avant utilisation.
    3. Avant d’ensemencer les cellules, aspirez l’excès de vitronectine et ne rincez pas.
      REMARQUE : L’incubation dans l’incubateur de culture cellulaire améliore l’uniformité de l’enrobage et améliore l’attachement des cellules, particulièrement important pour les CSEh sensibles. Ne laissez pas la solution de revêtement sécher. Ce protocole utilise des plaques recouvertes de vitronectine uniquement pendant les étapes de décongélation et d’expansion des CSEh afin de fournir un substitut ECM défini et lié à la surface. Les organoïdes cardiaques sont ensuite formés par auto-agrégation dans des conditions de suspension à faible adhérence, sans avoir besoin d’ECM.
  2. Décongélation des cellules souches cryoconservées (H9)
    1. Au moins 30 à 60 minutes à l’avance, laissez tous les milieux et réactifs requis (par exemple, milieu E8, inhibiteur E8 + ROCK, PBS) s’équilibrer naturellement à la température ambiante.
    2. Récupérer un cryoflacon de cellules souches embryonnaires humaines H9 dans le stockage d’azote liquide à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié. Plongez immédiatement le cryoflacon dans un bain-marie à 37 °C. Agitez doucement le flacon et surveillez de près.
    3. Une fois qu’il reste un petit cristal de glace (~90 % décongelé, ~1-2 min), transférez rapidement le flacon dans une enceinte de biosécurité. Désinfectez l’extérieur du cryoflacon avec de l’éthanol à 75 % avant ouverture.
    4. Transférez lentement le contenu du cryoflacon goutte à goutte dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu E8 à température ambiante complété par 10 μM d’Y-27632 (inhibiteur de ROCK). Mélangez doucement en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette à large calibre.
    5. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de milieu E8 + Y-27632.
    6. Placez les cellules sur une plaque à 6 puits recouverte de vironectine (préparée à l’avance) à la densité d’ensemencement souhaitée (généralement de 150 000 à 200 000 cellules/puits). Basculez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules et transférez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 .
      REMARQUE : L’utilisation de l’inhibiteur de ROCK (Y-27632) est essentielle pendant les 24 premières heures suivant la décongélation pour prévenir l’anoikis et favoriser la survie.
  3. Maintenance de routine et passage
    1. Changer de milieu tous les jours à l’aide de 2 ml de milieu E8 frais par puits.
    2. Surveillance quotidienne sous microscope à contraste de phase ; cellules de passage lorsqu’elles atteignent ~70-80 % de confluence, généralement tous les 3-4 jours.
      1. Pour le passage : Aspirer le milieu et rincer doucement avec 1 mL de DPBS.
      2. Ajouter 0,5 mL de réactif de dissociation des cellules souches et incuber à température ambiante pendant 3 à 5 min. Tapotez doucement la plaque pour déloger les colonies.
      3. Recueillir la suspension cellulaire et la replaquer à un rapport de division 1:3-1:4 sur des puits fraîchement enrobés de vitronectine dans un milieu E8 contenant 10 μM d’Y-27632. Après 24 h, remplacez le milieu par du E8 sans ROCKi.
        REMARQUE : Pour une récupération optimale et une efficacité de différenciation ultérieure, les HESC doivent être passées sous forme de petits amas de 2 à 10 cellules.
        L’utilisation d’embouts à alésage large est recommandée pour minimiser les contraintes de cisaillement. Une pointe de pipette de 5 mL ou une pipette sérologique de 10 mL peut être utilisée pour le mélange.

2. Différenciation des CSES (H9) en lignée cardiaque

  1. Induction de la différenciation mésodermique (Jour 0-1,5)
    REMARQUE : Évitez de différencier directement les cellules souches hématopoïdes fraîchement décongelées (H9) en organoïdes cardiaques. Il est crucial que les cellules soient d’abord passées et maintenues pendant au moins un passage avant d’initier la différenciation afin d’assurer une viabilité cellulaire optimale et une différenciation saine. La différenciation des cellules immédiatement après la décongélation peut entraîner de mauvais résultats en raison d’une santé cellulaire compromise.
    1. Ensemencement pré-induction : Lorsque les hPSC atteignent environ 70 % de confluence, dissociez doucement les cellules en petits groupes à l’aide d’un réactif de dissociation approprié. Remettre les grappes en suspension dans 2 mL de milieu E8 complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632).
    2. Agrégation : Semez 200 μL de suspension cellulaire (généralement 12 000 à 15 000 cellules) dans chaque puits d’une plaque de fixation à très faible niveau de 96 puits, puis centrifugez la plaque à 200 × g pendant 3 minutes à température ambiante pour faciliter l’agrégation cellulaire au fond de chaque puits.
    3. Incubation : Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 et cultiver pendant 24 h pour permettre la formation de corps embryoïdes (EB) compacts et uniformes.
    4. Préparer le milieu de culture basal (BC-M) en combinant 50 % d’IMDM, 50 % de mélange nutritif F12, 15 μg/mL d’insuline-transferrine-sélénium (ITS-G), 450 μM de monothioglycérol et 5 mg/mL d’albumine sérique bovine fraction V.
    5. Préparez la MD-M en complétant BC-M avec l’activine A (50 ng/mL), la BMP4 (10 ng/mL), la CHIR99021 (3 μM), la FGF2 (30 ng/mL) et la LY294002 (5 μM).
    6. Induction mésodermique : Après 24 h d’agrégation, induire des EB pendant 36 h avec MD-M.
      REMARQUE : Pour assurer l’efficacité de l’induction et la cohérence des organoïdes cardiaques, nous avons strictement limité l’utilisation des CSEh H9 à moins de trois passages après la décongélation. Cette stratégie est essentielle pour maintenir une efficacité de différenciation élevée et une fiabilité expérimentale globale.
      Une manipulation en douceur lors de l’échange de fluide est essentielle pour préserver l’intégrité des agrégats formés. Évitez de perturber la morphologie sphérique des EB.
  2. Induction de la différenciation mésodermique cardiaque (jours 1,5-5,5)
    REMARQUE : L’inhibiteur de la signalisation Wnt (XAV-939) est essentiel pour supprimer les signaux mésodermiques postérieurs et favoriser la spécification de la lignée cardiaque. L’acide rétinoïque joue un rôle sensible à la dose dans la structuration antéropostérieure ; une PR excessive peut entraîner une spécification de l’intestin antérieur.
    1. Complétez BC-M (composition détaillée à l’étape 2.1) avec BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL), de l’acide rétinoïque (0,5 μM) et du XAV-939 (5 μM) pour préparer le milieu de différenciation mésodermique cardiaque (CMD-M).
    2. Après 36 à 40 h d’induction mésodermique, aspirez soigneusement le MD-M et remplacez-le par le CMD-M pendant 4 jours avec un changement moyen tous les jours.
      REMARQUE : Manipulez les agrégats en douceur lors des changements de milieu pour éviter les perturbations mécaniques ou l’apoptose induite par le stress.
      Au cours de cette période, les sphéroïdes deviennent plus compacts et organisés. Des signes précoces d’engagement de la lignée cardiaque peuvent être observés au microscope à fond clair au jour 5.
  3. Spécification des organoïdes cardiaques (jours 5.5-7.5)
    1. Compléter BC-M (composition détaillée à l’étape 2.1) avec BMP4 (10 ng/mL), FGF2 (10 ng/mL) et de l’insuline (10 mg/mL) pour préparer le milieu de spécification des organoïdes cardiaques (COS-M).
    2. Le jour 5.5, aspirez doucement CMD-M et remplacez-le par COS-M pendant 2 jours avec un changement moyen tous les jours.
      REMARQUE : BMP4 et FGF2 favorisent en synergie l’expansion des progéniteurs cardiaques et suppriment les destins non cardiaques à ce stade. L’insuline soutient l’activité métabolique et le développement structurel des cardiomyocytes différenciateurs.
  4. Maturation des organoïdes cardiaques
    REMARQUE : Évitez la dissociation complète ou le pipetage des sphéroïdes pendant le transfert. Les cardiomyocytes sont très sensibles aux contraintes de cisaillement.
    1. Compléter BC-M (composition détaillée à l’étape 2.1) avec de l’insuline (10 mg/mL) pour préparer le milieu de maturation des organoïdes cardiaques (COM-M).
    2. À partir du jour 7.5, passage à COM-M. Effectuez des changements moyens quotidiens pour maintenir les niveaux de nutriments et éliminer les déchets métaboliques tout en minimisant le stress.
    3. Du jour 8 au jour 12, recherchez des battements spontanés d’organoïdes cardiaques, qui deviennent généralement évidents au microscope optique.
    4. Au Jour 12+, confirmez que le rythme contractile est régulier et soutenu.
      REMARQUE : La fréquence de battement et la morphologie peuvent être quantifiées à l’aide de la microscopie timelapse et d’outils d’analyse d’images.
      Une analyse électrophysiologique (par exemple, l’imagerie calcique ou MEA) peut être effectuée à partir du 12e jour pour évaluer la maturité fonctionnelle.

3. Préparation à la cryoconservation

  1. Transférez soigneusement les organoïdes cardiaques de la plaque de culture à l’aide d’une pipette de gros calibre pour éviter les contraintes mécaniques. Placez-les dans un tube conique de 15 mL et laissez les organoïdes se déposer naturellement par gravité pendant 3 à 5 min sans centrifugation.
  2. Préparez un milieu de cryoconservation (Cryo-CM) avec les composants suivants (concentrations finales) : 80 % CM-M, 10 % FBS, 10 % DMSO.
  3. Remettre doucement en suspension les organoïdes cardiaques dans 500 μL de Cryo-CM par cryoflacon.
  4. Placez les cryoflacons dans un récipient de congélation à base d’isopropanol. Conserver à -80 °C pendant 12 à 24 h pour assurer un refroidissement progressif à ~1 °C/min.
  5. Après la congélation pendant la nuit, transférez les flacons dans un entrepôt d’azote liquide pour une conservation à long terme.
    REMARQUE : Nous avons cryoconservé les organoïdes cardiaques à une densité d’environ 20 à 30 organoïdes matures par cryoflan, en suspension dans 1 mL de milieu de cryoconservation.

4. Récupération et décongélation des organoïdes cardiaques

  1. Pour récupérer les organoïdes, décongelez rapidement les flacons dans un bain d’eau, transférez les organoïdes cardiaques dans un milieu CM-M, centrifugez doucement pour éliminer le DMSO et remettez les organoïdes en suspension dans du CM-M frais.
    REMARQUE : Le battage après décongélation reprend généralement dans les 24 à 48 heures, selon la maturité des organoïdes et la qualité de manipulation.

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Résultats

La différenciation réussie des CSEh H9 en organoïdes cardiaques commence par la renaissance robuste et le maintien des cellules souches pluripotentes. Lors de la décongélation, les CSEh présentent une viabilité et une adhérence élevées lorsqu’elles sont plaquées sur des plaques recouvertes de vitronectine dans un milieu E8 complété par un inhibiteur de ROCK. En 24 à 48 heures, des colonies compactes avec des bords définis et des rapports noyau/cytoplasme élevés peuvent être observées, indiquant une récupération de la mor...

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Discussion

La génération réussie d’organoïdes cardiaques à partir de CSEh H9 repose sur une régulation temporelle et spatiale précise des principales voies de signalisation pour imiter le développement cardiaque précoce. Ce protocole récapitule les étapes critiques de l’induction du mésoderme, de la spécification de la lignée cardiaque et de l’auto-organisation en structures contractiles 3D dans un système chimiquement défini. La méthode fournit une plate-forme robuste et reproductible pour la modé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions Junfeng Ji (École des sciences médicales fondamentales, Université du Zhejiang, Chine) et Tao Luo (École des sciences médicales fondamentales, Université du Zhejiang, Chine) pour leur aimable fourniture de CSEh (H9). Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° U23A20398 à C.Z.), du Programme des sciences et technologies du Sichuan (subventions n° 2022YFS0578 et 2022YFS0614 à C.Z.), de la Research Start-up Foundation de la Southwest Medical University (subvention n° 00040155 à C.Z.), de la Research Start-up Foundation de la Southwest Medical University (subvention n° 00170071 à B.W.), Les programmes de coopération stratégique scientifique et technologique du gouvernement populaire municipal de Luzhou et de l’Université médicale du Sud-Ouest (subvention n° 2024LZXNYDJ088 à B.W.), le projet de coopération stratégique scientifique et technologique de l’Université médicale du Sud-Ouest (subvention n° 2024PZXNYD01 à BW) et la Fondation de l’Université médicale du Sud-Ouest (subvention n° 2024ZKZ014 à B.W.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,02 % EDTABeyotimeRéf. C0198
6 puits  ; assietteCORNING3516
7,5 % d’albumine sérique bovineL’ACMECAC11954
Plaque de fixation ultra-basse à 96 puitsCORNING7007
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Souris IgGOuiRéférence 34106ES60
Alexa Fluor 555 Chèvre anti-lapinInvitrogenA-21428
CHIR-99021 monochlorhydrateOuiRéférence 52965ES10
DMSO  ;SolarbioD8370
Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco (D-PBS)OuiRéférence 60152ES76
FBSGibcoRéférence 10099141C
Protéine FGF2, humaine, recombinanteTargetMolTMPY-00749-50 &mu ; g  ;
Mélange nutritif F-12 de HamTechnologies du vivant11765054
hPSC-CDM (support Essential 8)Cauliscell400105
Protéine recombinante BMP-4 humaineGibcoPHC9534
IMDM, Supplément GlutaMAXTechnologies du vivant31980030
Insuline-Transferrine-Sélénium (ITS -G)Gibco41400045
LY294002SelleckS1105-50MG
MonothioglycérolSigma-AldrichRéférence M6145
Souris anti-&alpha ;SMAAbmartMN50104
Fixateur anti-effacement diamant ProLong avec DAPIInvitrogenRéf. P36966
Lapin anti-CDH5AbmartTA6265
Lapin anti-cTNTInvitrogen701620
Protéine BMP-4 humaine recombinanteOuiRéférence 92053ES20
Insuline humaine recombinante  ;OuiRéf. 40112ES25
Protéine d’activine A recombinante humaine/souris/ratOuiRéférence 91702ES10
ReLeSRCellules souches100-0483
Acide rétinoïqueSigma-AldrichR2625
VitronectineGibcoA14700
XAV-939SelleckS1180
Y-27632 2HCl (inhibiteur de ROCK)SelleckS1049

Références

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