Utilisation de la microperfusion cérébrale à flux ouvert pour la collecte longitudinale de liquide interstitiel dans un modèle animal de glioblastome

Résumé

In vivo, les communications intercellulaires à l’origine de nombreuses maladies du système nerveux central, telles que le glioblastome (GBM), sont notoirement difficiles à mesurer et à caractériser. Ici, nous décrivons les procédures de microperfusion cérébrale à flux ouvert (cOFM) qui peuvent être utilisées pour échantillonner des composants du liquide interstitiel dans un modèle animal longitudinal de GBM.

Résumé

Les maladies du système nerveux central (SNC) se manifestent par un réseau complexe et dynamique de communication intercellulaire. Le glioblastome (GBM), la tumeur cérébrale primaire la plus courante et la plus agressive, illustre cette complexité, avec sa progression rapide et un pronostic désastreux mesuré en mois plutôt qu’en années. La biologie du GBM est guidée par des échanges complexes de molécules de signalisation entre les cellules néoplasiques et stromales, qui sous-tendent une progression agressive de la maladie. Nous décrivons ici un protocole détaillé de microperfusion cérébrale à flux ouvert (cOFM) dans des modèles murins GBM, permettant une surveillance longitudinale en temps réel de la dynamique du microenvironnement tumoral au sein du liquide interstitiel (ISF). Notre approche décrit l’implantation de montages durables sur la tête de canules guides, leur utilisation pour l’engretiam intracérébrale du gliome directement à travers le guide, ainsi que la collecte d’échantillons de cOFM haute fidélité pour des analyses métabolomiques et protéomiques LC-MS. De manière cruciale, le cOFM surmonte les limites de taille moléculaire de la microdialyse traditionnelle. Au-delà de la GBM, la méthodologie cOFM promet des perspectives transformatrices sur un spectre de troubles du SNC, y compris les troubles neurodégénératifs, épileptiques et neuropsychiatriques, grâce à sa capacité à fournir des biomarqueurs étiologiques et adaptés au traitement au sein de leurs modèles animaux respectifs.

Introduction

L’étude des maladies du système nerveux central (SNC) est notoirement difficile en raison de la signalisation intercellulaire complexe et multimodale médiée par le liquide interstitiel (ISF⁾1,2,3,4. Cette complexité est particulièrement marquée dans les tumeurs cérébrales, telles que le glioblastome (GBM), où des signaux intercellulaires sont transmis entre les cellules néoplasiques et^stromales 5,6,7,8,9. Dans de nombreux cas, l’échange aberrant de biomolécules diverses, y compris les métabolites et les messagers protéés, contribue à l’étiologie sous-jacente des pathologies du SNC. Ce défi d’investigation est aggravé, notamment dans la GBM, par le fait que la composition moléculaire de l’ISF est dynamique temporellement et évolue tout au long de la progression de la maladie ainsi qu’en réponse aux traitements^{interventionnels 10,11}.

Les méthodes traditionnelles d’investigation préclinique de la GBM incluent des études in vitro et des modèles animaux à un seul objectif. La nature de ces approches limite leur applicabilité clinique plus large en raison de leur incapacité à saisir à la fois les caractéristiques du microenvironnement tumoral et les changements temporels longitudinaux. Les avancées réalisées au début des années 1980 ont surmonté ces limites contextuelles avec le développement de la microdialyse intracérébrale (cMD⁾12,13,14,15. Depuis sa création il y a 45 ans, la cMD s’est imposée comme la méthode standard pour l’échantillonnage longitudinal du liquide interstitiel (ISF) dans le cerveau^{vivant 16}. Cela est réalisé par la diffusion libre et la convection de solutés ISF à haute concentration à travers une membrane semi-perméable dans un liquide céphalorachidien (aCSF)17, généralement artificiel, à faible concentration de solutés, perfusé ^{en continu et à faible concentration de solutés17}. Ces membranes semi-perméables sont composées de divers polymères biocompatibles avec des coupures de taille de pores de poids moléculaire courantes allant de 20 kDa à 3^{MDa 18}. Cette procédure peu invasive permet la collecte longitudinale in situ d’une grande variété d’analytes, allant de petites molécules, telles que des métabolites ou des neurotransmetteurs, jusqu’à de grandes protéines, telles que les anticorps. Cependant, la porosité structurelle des membranes de cMD, couplée à la nature adsorptive de ses polymères compositionnels, peut avoir un impact significatif sur la récupération relative des analytes présentant des caractéristiques biochimiques ou dimensionnelles particulières, telles que les lipides ou les anticorps, respectivement^19,20.

Les avancées pour surmonter cette limitation des membranes cMD ont commencé au début des années 2010 avec le développement de la microperfusion cérébrale à flux ouvert (cOFM⁾²¹. Fonctionnant selon des principes généraux similaires à ceux de la cMD, la cOFM élimine les limitations biochimiques imposées par les membranes semi-perméables en les remplaçant contre une sonde en réseau plastique avec des ouvertures macroscopiques à faible adsorption d’environ 100 μm de taille²⁰. De nombreux rapports ont démontré l’utilité accrue de la cOFM par rapport à la cMD grâce à la collecte de composants détectables de l’ISF, notamment les hormones peptidiques, les nanocorps/anticorps, les petites thérapies lipophiles et les liposomes^PEGylés 19,22,23,24,25. Des rapports antérieurs examinant la réaction physiologique des tissus à l’implantation de la sonde guide cOFM montrent que l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique est rétablie 15 jours après l’implantation, et qu’aucune cicatrice gliale ne se forme jusqu’à 30 jours après^{l’implantation 26}. Grâce au remplacement des membranes de microdialyse par des ouvertures macroscopiques, les chercheurs ont également démontré la capacité innovante des sondes guides cOFM à faciliter l’injection de cellules de gliome xénogreffées dans le cerveau de rats immunodéficients, de sorte que l’implantation et la croissance tumorales atraumatiques se produisent directement autour de la zone d’échantillonnage²⁷ de cOFM.

Les considérations concernant l’utilisation de la cOFM dans l’étude des pathologies du SNC doivent néanmoins reconnaître ses limites méthodologiques. En raison de sa dépendance à la diffusion passive et à la convection des analytes ISF en un perfusat en flux, ces limitations concernent la concentration d’analytes et le volume^{d’échantillon 18}. Les composants de l’ISF échantillonnés seront dilués dans le perfusate cOFM collecté par rapport aux niveaux endogènes, ce qui conduit de nombreuses recherches à comparer les rapports relatifs d’analytes entre les conditions^{expérimentales 28}. Les débits typiques varient de 0,1 μL/min à 1,0 μL/min, ce qui équivaut à seulement 6 μL/h à 60 μL/h. En tenant compte des temps de dégagement des espaces morts des tubes, la durée totale d’échantillonnage doit également être prise en compte. Cela est particulièrement important lors de la réalisation de collectes de cOFM chez des animaux anesthésiés, où les préoccupations liées au bien-être animal doivent être prises en compte avec soin. Une description plus détaillée de ces considérations et d’autres est disponible dans un rapport de méthodes précédent de l’équipe de développement de^{cOFM 29}.

Dans ce manuscrit, nous fournissons un protocole mis à jour pour l’utilisation de l’échantillonnage longitudinal de cOFM dans l’étude des maladies neurologiques, avec un accent particulier sur la GBM. Le protocole comprend des étapes pour l’implantation de canules guidant cOFM, l’injection de cellules tumorales et l’engraftement via le guide cOFM, ainsi que deux configurations d’échantillonnage cOFM chez des animaux éveillés en mouvement libre. Nous présentons des données représentatives démontrant les effets du traitement sur les composants métabolomiques et protéomiques de l’ISF mesurés par cOFM, l’impact de la configuration de l’échantillonnage sur les concentrations d’analytes, et l’efficacité de l’implantation de cellules tumorales guidées par cOFM.

Protocole

Toutes les procédures animales relevant de ce protocole sont approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de l’Université Northwestern (ID de protocole : IS00021383) et respectent les directives des National Institutes of Health (NIH). Ce protocole a été développé pour une utilisation chez les souris C57BL/6J, mâles et femelles, avec un âge minimum de 8 à 10 semaines. La lignée cellulaire de gliome murin utilisée dans ce protocole, CT2A, a été fournie par le laboratoire Seyfried de l’Université de Boston et a été cultivée et préparée après des conditions de culture tissulaire stérile.

1. Planification et préparation chirurgicales

1. Informations animales : Pour les expériences de cOFM, utilisez des souris âgées d’au moins 8 à 10 semaines afin de permettre une croissance et un développement complets. Les implants crâniens en position fixe peuvent se déloger ou nuire à une croissance correcte du crâne et/ou du cerveau encore en développement.
2. Sélection des coordonnées chirurgicales : Utilisez un atlas cérébral animal pour localiser les coordonnées orthogonales de la région d’intérêt par rapport à la bregma. Par exemple, les implantations de cellules gliomes sont généralement réalisées dans le striatum afin de mieux répliquer les microenvironnements natifs du GBM et maximiser l’efficacité du développement tumoral ultérieur. Les coordonnées guides d’implantation du cOFM utilisées dans ce protocole sont médiolatérales (ML) = 2,5 mm, antéropostérieures (AP) = 0 mm, et dorsoventrales (DV) = 3,5 mm.
   REMARQUE : Les coordonnées stéréotaxis peuvent varier selon les souches et les âges de souris. Veuillez utiliser les coordonnées de l’atlas spécifiques à chaque espèce et souche pour garantir le placement souhaité dans le guide cOFM.
3. Sélection des configurations appropriées de composants cOFM : Ordre des composantes pour les configurations cOFM appropriées dans des longueurs totales spécifiques allant de 2 mm à 22 mm, avec des longueurs de surface ouvertes de 1 mm à 2 mm.
   REMARQUE : Les animaux peuvent déloger des montages de tête cOFM mal implantés lors de comportements de toilettage. Pour minimiser le levier mécanique sur la monture de la tête pendant cette activité, nous recommandons d’utiliser des guides ne dépassant pas 2 à 3 mm de plus que la distance de coordonnées DV prévue.
4. Planification des délais des procédures chirurgicales et d’échantillonnage pour les objectifs expérimentaux : Selon la maladie d’intérêt et les caractéristiques du modèle, planifiez soigneusement le calendrier et l’ordre des procédures liées à la cOFM afin d’étudier de manière optimale la biologie sous-jacente en question.
   1. Si vous étudiez les différences de composition de l’ISF entre un microenvironnement cérébral sain et celui des tumeurs, effectuez des procédures de prélèvement de cOFM avant et après l’implantation tumorale chez le même animal.
   2. Si vous étudiez les effets des interventions cliniques sur les pathologies du SNC, effectuer des procédures d’échantillonnage cOFM avant et après administration dans des cohortes animales parallèles recevant soit un traitement contrôle, soit expérimental.

2. chirurgie de placement de la cOFM

1. Assemblez les outils chirurgicaux pour la chirurgie de pose de la cOFM, guidez la chirurgie ( Table des matériaux) et stérilisez par autoclave si nécessaire.
2. Préparation au cabinet chirurgical :
   1. Désinfectez l’armoire de biosécurité : Réalisez les interventions chirurgicales dans une armoire de biosécurité correctement désinfectée. Activez le flux d’air de l’armoire de biosécurité et nettoyez les surfaces intérieures avec un désinfectant et une méthode d’essuyage approuvés par l’institution. Tapisser la surface inférieure de l’armoire de rideaux stériles.
   2. Préparez des instruments stéréotaxis : nettoyez le cadre stéréotaxique avec un désinfectant et placez-le dans l’armoire de biosécurité. De même, nettoyez et désinfectez la perceuse stéréotaxique et le porte-guide et placez-les dans l’armoire de biosécurité.
   3. Coussin chauffant au stade chirurgical : Utilisez un coussin chauffant au stade stéréo-tactique pour fournir une chaleur supplémentaire pendant l’anesthésie. Nettoyez et désinfectez la surface du coussin chauffant et placez-la sur le cadre stéréotaxique où l’animal sera positionné. Allumez la bouillotte à feu doux et placez 1 à 2 rideaux stériles dessus.
   4. Placez des instruments et équipements chirurgicaux supplémentaires : Placez aseptiquement du matériel stérilisé supplémentaire dans l’armoire de biosécurité.
   5. Installation de la cage de récupération : Placez une cage de récupération propre sur un coussin chauffant réglé à la température la plus basse possible. Chaque animal devra être placé dans une cage de récupération individuelle jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli, donc le nombre total de cages dépendra de la performance et des temps de récupération de la chirurgie.
3. Préparations animales préchirurgicales (résumées à la Figure 1A) :
   1. Anesthésie : Administrez des composés anesthésiques approuvés par l’institution et des doses pour atteindre une profondeur anesthésique appropriée, en utilisant le test du réflexe pincé de la patte ainsi que la profondeur/fréquence respiratoire afin d’assurer une anesthésie suffisante. Par exemple, une injection intrapéritonéale de cocktail kétamine - xylazine (100 mg/kg - 10 mg/kg, en solution saline) est suffisante pour atteindre une profondeur anesthésique appropriée pour les souris C57BL/6J.
   2. Analgésie : administrer des composés analgésiques approuvés par l’institution pour aider à la gestion de la douleur péri- et post-opératoire. Par exemple, l’injection sous-cutanée de méloxicam (20 mg/kg, dans une solution saline) est appropriée pour la gestion de la douleur périopératoire.
   3. Épilation (rasage, crème dépilatoire) : Retirez les poils du site chirurgical prévu sur le dessus du crâne à l’aide d’un rasoir électrique et/ou d’une crème dépilatoire. Si vous utilisez une crème dépilatoire, assurez-vous qu’elle ne reste pas trop longtemps sur la peau pour éviter l’irritation.
   4. Pommade ophtalmique : Utilisez un applicateur stérile à extrémité de coton pour appliquer doucement une pommade ophtalmique sur les deux yeux afin d’éviter le dessèchement cornéen lors de l’opération.
   5. Placement de l’animal dans le cadre stéréotaxique : Placez correctement l’animal dans le cadre stéréotaxique en insérant des incisives dans le bloc de morsure, en insérant fermement mais doucement des barres d’oreille dans les conduits auditifs, et en fixant la pince de nez sur l’os nasal de l’animal ( Figure 1B). Si le crâne de l’animal est bien positionné, il doit être fermement fixé sans aucun mouvement.
   6. Préparation aseptique du site chirurgical : Essuyez la peau autour de la zone chirurgicale avec trois précipitations alternées d’alcool (éthyle ou isopropylique) et d’iode de povidone pour désinfecter aseptiquement la zone en vue de l’incision.
4. Préparation de l’incision et de la surface du crâne :
   REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées de façon aussi aseptique que possible. À cette fin, le chirurgien vétérinaire principal doit porter des gants chirurgicaux stériles sur des gants de laboratoire standards avant de poursuivre vers l’incision.
   1. Emplacement et longueur de l’incision : Utilisez un scalpel stérile pour réaliser une incision sagittale en ligne médiane le long de la surface du crâne, commençant entre les yeux et s’étendant caudalement sur 8-10 mm ( Figure 1C).
   2. Rétraction cutanée : Utilisez des pinces stériles, des applicateurs à pointe de coton et/ou une lame de scalpel pour rétracter latéralement la peau de l’incision médiane. Assurez-vous que la Bregma et la Lambda sont visibles et prolongez l’incision sinon.
   3. Incision du périoste : Utilisez un scalpel stérile pour effectuer une incision dans le périoste et rétractez latéralement le tissu avec des pinces.
   4. Couvette de peroxyde d’hydrogène : nettoyez la surface du crâne avec du peroxyde d’hydrogène dilué à 1 % à 3 % appliqué à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton ( Figure 1D). Cela aide également à identifier le Bregma et le Lambda via les sutures crâniennes sagittales, coronales et lambdoïdes.
   5. Adhésif dentaire auto-gravé : Utilisez une seringue d’insuline de 0,3 mL à 1,0 mL pour appliquer uniformément 20 à 40 μL d’adhésif dentaire auto-gravé à la surface du crâne ( Figure 1D). Appliquez une lampe de durcissement dentaire pour faciliter la gravure. Une fois durci, utilisez des applicateurs stériles à extrémité de coton et du sérum physiologique pour éliminer l’excès d’adhésif.
      ATTENTION : Les adhésifs dentaires auto-gravés, tels que Bond Force, sont des substances potentiellement dangereuses : danger inflammable (GHS02 : H225), danger pour la santé (GHS07 et GHS08 : H315, H319, H317, H361fd, H336) et danger environnemental (GHS09 : H412). Veuillez suivre les directives locales et institutionnelles pour une élimination appropriée des déchets dangereux.
5. Localisation et perçage des trous de meule :
   1. Insérez un foret stérilisé de 0,7 mm dans la microperceuse et installez la perceuse dans le cadre stéréotaxique avec le support approprié.
   2. Localiser le Bregma à l’intersection des points sagittal et coronal et utiliser des micromanipulateurs stéréotaxis pour y placer le trépan à cet endroit.
   3. Repositionner la mèche selon la coordonnée guide cOFM (ML = 2,5, AP = 0,0), engager la foreuse à 15 000 tr/min, et percer soigneusement un trou de meule en ajustant le cadran micro-manipulateur DV (Figure 1E). Observez fréquemment l’épaisseur du crâne lors du forage pour éviter les dommages au cerveau sous-jacent. Utilisez du sérum physiologique lors du forage pour éliminer les débris osseux et réduire la chaleur entre la mèche et le crâne.
   4. Répétez la procédure de perçage pour chaque coordonnée de vis d’ancrage (Figure 1E). Les emplacements recommandés pour les vis d’ancrage sont ML = 2,5, AP = -2,5, et ML = -2,5, AP = -2,5.
   5. Après avoir percé les trous de meule, détachez la microperceuse et le porte-perceuse du cadre stéréotaxique.
   6. Utilisez une aiguille de 30 G pour percer doucement la dure-mère sous le trou de la meule guide du cOFM.
6. Installez des vis d’ancrage à l’aide d’une paire de pinces stériles et d’un tournevis stérile de taille appropriée (Figure 1F). Selon le pas de filetage de la vis, l’ancrage est suffisant lorsque la vis est insérée d’une à deux longueurs de filetage de profondeur. Faites attention à ne pas enfoncer trop profondément les vis d’ancrage pour éviter d’endommager le cortex.
7. Installez le guide cOFM et l’assemblage factice cOFM dans le porte-guide et le support de fixation du cadre stéréotaxique. Positionnez la pointe guide cOFM au-dessus du trou de meule (ML = 2,5 mm, AP = 0,0 mm) à une hauteur DV égale à celle de Bregma, puis descendez lentement la guide cOFM à travers le trou de meule jusqu’à la profondeur prédéterminée appropriée à un taux de 1 mm/min ( Figure 1F). Par exemple, la profondeur de placement du guide de cOFM avec l’implantation ultérieure des cellules tumorales est DV = -3,5 mm.
8. Appliquez de l’agent cimentant sur la surface du crâne, en veillant à ce qu’il couvre les zones sous et autour des vis guide et d’ancrage du cOFM en une couche fine et uniforme. Utilisez une lampe de durcissement dentaire pour durcir chaque couche d’agent cimentant avant d’appliquer les couches suivantes ( Figure 1G). Continuez à appliquer l’agent cimentant jusqu’à ce que la surface du crâne entre chaque composant soit couverte, que les vis d’ancrage soient complètement couvertes, et que la zone sous le guide cOFM jusqu’à et autour de la rainure soit recouverte. Faites attention à ne pas placer l’agent cimentant sur ou près du coin de blocage.
   ATTENTION : Les agents cimentants, tels que Tetric EvoFlow, sont des substances potentiellement dangereuses : un danger pour la santé (GHS07 : H317, H319, H335, H360). Veuillez suivre les directives locales et institutionnelles pour une élimination appropriée des déchets dangereux.
9. Détachez le porte-guide du guide cOFM et soulevez lentement le porte-guide avec le bouton de réglage DV du micromanipulateur. Retirez le micromanipulateur du cadre stéréotaxique.
10. Détachez l’animal du cadre stéréotaxique en desserrant et retirant d’abord les barres d’oreilles, en desserrant et rétractant la pince nasale, puis en soulevant les incisives de l’animal du bloc de morsure.
11. La peau de suture s’est fermée au-dessus de l’agent cimentant dentaire, garantissant que le corps guide du cOFM reste exposé. Des sutures absorbables 4-0, telles que l’acide polyglycolique (PGA) ou la polyglactine (Vicryl), sont recommandées (Figure 1H).
12. Appliquez une pommade antibiotique triple sur la zone cutanée adjacente à l’incision initiale.
13. Récupération et soutien des animaux :
    1. Transférez l’animal dans une cage de récupération isolée (un animal par cage) et fournissez de la chaleur supplémentaire grâce à une bouillotte placée à basse température.
    2. Optionnel : Administrez à l’animal un agent anesthésique inverseur pour accélérer la récupération. Par exemple, les injections sous-cutanées d’atipamézole (1 mg/kg, dans une solution physiologique séline) accélèrent les temps de récupération de l’anesthésie d’environ 1 h à environ 20 minutes.
    3. Assurez une observation et un soutien continus jusqu’à ce que l’animal ait suffisamment retrouvé conscience et la position sternale couchée. Ne laissez pas les animaux sans surveillance tant qu’ils ne se sont pas complètement remis de l’opération et de l’anesthésie.
    4. Une fois l’animal complètement rétabli, il peut être remis dans des cages de logement commun avec d’autres animaux.
    5. Un jour après l’opération, apportez un soutien analgésique supplémentaire en administrant un analgésique approuvé par l’institution, tel que le méloxicam (voir étape 2.3.2).
14. Prévoyez un délai de récupération de 14 jours après la chirurgie d’implantation du guide cOFM pour permettre la guérison complète de la barrière hémato-encéphalique avant d’effectuer d’autres interventions sur les animaux.

3. Implantation de cellules de tumeurs intracrâniennes par guide cOFM

1. Culture cellulaire et préparation :
   1. Cultiver et étendre les cellules selon des protocoles spécifiques au type cellulaire. Par exemple, des cellules de gliome de souris syngénique telles que CT2A peuvent être cultivées dans des boîtes de 10 cm ou dans des flasques T-75 contenant du DMEM avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de compléments de pénicilline/streptomycine.
   2. Préparer les cellules cultivées pour l’implantation selon des protocoles spécifiques au type cellulaire.
      1. Par exemple, avec les cellules gliomes syngéniques CT2A, retirer le milieu de croissance, laver brièvement avec PBS, et incuber les cellules pendant 5 minutes dans 0,05 % de trypsine (avec 0,53 mM d’EDTA) à 37 °C.
      2. Neutraliser la trypsine avec un volume égal de DMEM contenant 1 % de FBS, transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL, puis centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C vers les cellules à pellets.
      3. Retirez le surnageant et remettez le pellet cellulaire dans 1 mL de PBS (ou de solution physiologique). Déterminez le nombre total de cellules par mL avec un hémocytomètre manuel ou automatisé. Centrifugez à nouveau la suspension de cellules à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C, retirez le surnageant, puis resuspendez dans un volume approprié de PBS (ou solution salée) pour atteindre 50 000 cellules par μL. Placez la suspension des cellules sur glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’implantation (étape 3.5.2).
2. Assembler des outils chirurgicaux pour la chirurgie d’implantation des cellules de tumeurs intracrâniennes (Table of Materials) et stériliser par autoclave si nécessaire.
3. Préparation de l’espace de travail chirurgical
   1. Désinfecter l’armoire de biosécurité : voir l’étape 2.2.1.
   2. Préparez des instruments stéréotaxis : nettoyez le cadre stéréotaxique avec des désinfectants et placez-le dans le meuble de biosécurité. De même, nettoyez et désinfectez le porte-seringue monté stéréotaxiquement et fixez-le au cadre stéréotaxique.
   3. Exécutez les étapes 2.2.3.-2.2.5. pour les étapes préparatoires restantes.
4. Préparations animales préchirurgicales :
   1. Exécutez les étapes 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4. et 2.3.5. pour la préparation animale.
5. Implantation de cellules tumorales :
   1. Assemblage de la seringue et de l’insert d’infusion (résumé à la Figure 2)
      1. Faites tremper les connecteurs de tubes à brides dans 70 % d’éthanol pendant au moins 5 minutes.
      2. Insérez la pointe d’une seringue en verre étanche stérilique de 10 μL ou 25 μL dans une extrémité d’un connecteur de tube à bride.
      3. Placez l’entrée d’un insert d’infusion cOFM à l’autre extrémité du connecteur du tuyau.
      4. Fixez l’ensemble de l’insert seringue-infusion dans le porte-seringue stéréotaxique.
   2. Chargez l’ensemble seringue-insert d’infusion avec un volume approprié de suspension cellulaire. Par exemple, chargez 3 μL de suspension cellulaire à 50 000 cellules par μL pour une injection totale de 150 000 cellules par animal.
   3. Remplacer l’insert factice par l’insert d’infusion :
      1. Utilisez des pinces pour retirer le coin de verrouillage du guide et du montage factice cOFM, puis soulevez doucement le faux cOFM du guide.
      2. Utilisez les boutons de réglage ML et AP du micromanipulateur pour manœuvrer l’ensemble seringue-insert d’infusion au-dessus du guide cOFM. Utilisez le bouton de réglage DV pour abaisser soigneusement l’insert d’infusion dans le guide cOFM et fixez-le en position en réinsérant fermement la cale de verrouillage avec des pinces.
   4. Injectez 3 μL de suspension cellulaire à partir de la seringue à un taux de 1 μL/min. Observez attentivement la zone autour du guide cOFM et de l’insert d’infusion afin de vous assurer qu’aucune suspension de cellule ne s’échappe de l’ensemble. Après l’injection totale du volume, attendez une minute supplémentaire pour que la pression intracrânienne s’équilibre.
   5. Remplacez l’insert d’infusion par un insert factice.
      1. Utilisez des pinces pour retirer la cale de verrouillage du guide cOFM et de l’ensemble de l’insert d’infusion, puis ajustez doucement le bouton de réglage DV du micromanipulateur pour soulever l’insert d’infusion cOFM du guide.
      2. Replacez le mannequin cOFM dans le guide et fixez-le en place en réinsérant la cale de verrouillage avec une pince.
6. Détachez l’animal du cadre stéréotaxique en desserrant et retirant d’abord les barres d’oreilles, en desserrant et rétractant la pince nasale, puis en soulevant les incisives de l’animal du bloc de morsure.
7. Récupération et soutien des animaux :
   1. Transférez l’animal dans une cage de récupération isolée (un animal par cage) et fournissez de la chaleur supplémentaire grâce à une bouillotte placée à basse température.
   2. Optionnel : Fournir à l’animal un agent anesthésique de renversement (comme l’atipamezole) pour accélérer la durée de la récupération, voir l’étape 2.13.2.
   3. Assurez une observation et un soutien continus jusqu’à ce que l’animal ait suffisamment retrouvé conscience et la position sternale couchée. Ne laissez pas les animaux sans surveillance tant qu’ils ne se sont pas complètement remis de l’opération et de l’anesthésie.
   4. Une fois l’animal complètement rétabli, il peut être remis dans des cages de logement commun en compagnie d’autres animaux.
   5. Le lendemain de l’opération, apportez un soutien analgésique supplémentaire en administrant un analgésique approuvé par l’institution, tel que le méloxicam (voir étape 2.3.2).
      REMARQUE : Si l’on utilise des lignées cellulaires positives à la luciférase, l’imagerie bioluminescente (BLI) peut être réalisée 1 à 2 semaines après l’implantation cellulaire afin de vérifier le succès de l’implantation tumorale. Bien que des caractéristiques physiques telles que la fourrure animale ou la présence sur la tête puissent entraver la luminescence détectée, elles peuvent tout de même être utilisées pour faire des approximations approximatives de la présence ou de l’absence de tumeurs. Alternativement, une IRM peut être réalisée si les vis d’ancrage utilisées dans le placement du guide cOFM ne sont pas ferromagnétiques et compatibles IRM.

4. Échantillonnage cOFM du liquide interstitiel cérébral

REMARQUE : Compte tenu de sa dépendance à la diffusion passive des analytes, les échantillons de cOFM contiennent des concentrations diluées d’analytes comparées à l’environnement ISF endogène. Pour cette raison, plusieurs méthodes ont déjà été proposées pour calibrer les mesures d’échantillons afin de mieux refléter les concentrations in situ ¹⁸. Cette section décrit deux modalités d’échantillonnage différentes. Étape 4.1. décrit le mode de configuration recommandé par le fabricant (ci-dessus appelé fractionné) qui offre une plus grande sensibilité temporelle, mais au détriment de la concentration d’analyte. Étape 4.2. détaille un mode de configuration alternatif que nous avons développé (appelé ici recirculé) qui peut atteindre une concentration d’analyte plus élevée au détriment d’une résolution temporelle diminuée.

1. Échantillonnage fractionné de cOFM (résumé à la Figure 3A) :
   1. Faites tremper les connecteurs de tubes à brides dans 70 % d’éthanol pendant au moins 5 minutes pour faciliter la fixation sur les tubes et les inserts d’échantillonnage.
   2. Chargez le sac de perfusée avec suffisamment d’aCSF perfusé. Par exemple, 680 μL est minimalement suffisant pour un rinçage de 20 minutes à 10 μL/min et un échantillonnage de 8 h à 1 μL/min. Cependant, un volume minimum de 2 mL est recommandé pour éviter l’effondrement et le dysfonctionnement du sac perfusé.
   3. Préchargez les deux conduites de tube poussant et tirant avec un volume approprié d’aCSF à l’aide de seringues en verre étanches. Par exemple, le tuyau universel push-pull low-bind a un diamètre intérieur de 0,25 mm et des longueurs individuelles de 100 cm. Cela équivaut à environ 1 μL pour 2 cm, donc environ 55 μL dans le tube de poussée et 100 μL dans le tube de traction.
   4. Installer correctement la section péristaltique du tube dans la tête de pompe de la pompe à microperfusion comme illustré à la Figure 3A.
      REMARQUE : Consultez le manuel d’instructions BASi pour des instructions supplémentaires si nécessaire.
   5. Reliez le sac de perfusion à la section poussée du tube à l’aide du connecteur Luer lock (Figure 3A, composant i).
   6. Reliez l’insert d’échantillonnage aux conduites de tuyau à l’aide de connecteurs de tubes à bride. L’entrée d’insertion d’échantillonnage (longueur d’arbre plus longue) doit être fixée à l’extrémité de sortie du tube de poussée, en face de la ligne tubulaire du sac perfusé (Figure 3A, en haut à gauche). La sortie de l’insert d’échantillonnage (arbre plus court) doit être fixée à l’extrémité d’entrée du tube de traction, parallèlement à la ligne tubulaire du sac perfusé (Figure 3A, en haut à droite). Placez l’insert d’échantillonnage connecté dans un tube microcentrifuge stérile contenant 750 μL d’aCSF en préparation du rinçage du système.
   7. Reliez l’aiguille du collecteur de fractions avec un connecteur de tube à bride à la conduite de sortie du tube de traction (à l’extrémité opposée à la sortie de l’insert d’échantillonnage).
   8. Effectuez un rinçage du système de tuyauterie pendant 20 minutes à 10 μL/min pour éliminer les bulles de gaz piégées à l’intérieur du système de tuyauterie.
   9. Installation du collecteur de fractions :
      1. Identifier et mettre en valeur les tubes de collecte des fractions, en annotant chaque poids pour une comparaison et une validation ultérieures du volume d’échantillon collecté. Placez les tubes dans les fentes correspondantes du carrousel collecteur de fractions.
      2. Activez le collecteur de fractions et configurez les réglages aux valeurs souhaitées. Parmi les exemples de réglages figurent le # des échantillons, le temps d’échantillonnage (m), le délai (heures), le refroidissement du refroidissement et le mode _cannula.
         REMARQUE : La suppression du volume de fluide en espace mort dans le tube de traction qui n’a jamais touché l’ISF orthotopique est approximative par i) la longueur et le volume du tube (environ 2 cm/μL pour l’OFM-PP2-100-LB), ii) le débit, et iii) le délai (heures). Ces paramètres doivent être soigneusement pris en compte lors de la mise en place du système de collecte afin d’assurer une collecte adéquate des fractions.
2. Échantillonnage recirculé du cOFM (résumé à la Figure 3B) :
   1. Faites tremper les connecteurs de tubes à brides dans 70 % d’éthanol pour faciliter la fixation sur les tubes et les inserts d’échantillonnage.
   2. Préchargez la ligne de traction du tube avec un volume approprié d’aCSF à l’aide de seringues en verre étanches.
   3. Installez correctement la section péristaltique du tube dans la tête de pompe de la pompe à microperfusion.
   4. Reliez l’insert d’échantillonnage aux conduites de tuyau à l’aide de connecteurs de tubes à bride. L’entrée d’insertion d’échantillonnage (longueur d’arbre plus longue) doit être fixée à l’extrémité de sortie du tube de traction. La sortie de l’insert d’échantillonnage (arbre plus court) doit être fixée à l’extrémité d’entrée du tube de tirage. Placez l’insert d’échantillonnage connecté dans un tube microcentrifuge stérile contenant 750 μL d’aCSF en préparation du rinçage du système.
   5. Effectuez un rinçage du système de tuyauterie pendant 20 minutes à 10 μL/min pour éliminer les bulles de gaz piégées à l’intérieur du système de tuyauterie.
3. Installation du système de cage rotative :
   REMARQUE : Les systèmes de cages animales rotatives, tels que le système Raturn, facilitent l’échantillonnage éveillé du cOFM animal en empêchant l’hyper-enroulement et l’emmêlement des tubes push-pull. Cela peut également faciliter l’automatisation de l’échantillonnage de cOFM en éliminant le besoin de démêler manuellement les tubes lors des séances de collecte de cOFM éveillées.
   1. Placez la literie propre de la cage de façon uniforme sur le sol rotatif et équipez la cage de nourriture et d’eau facilement accessibles.
   2. Allumez le contrôleur de rotation de la cage et testez son activité en faisant tourner la corde suspendue. La cage doit tourner en contre-rotation par rapport à la direction de rotation transmise à la corde. Réglez le contrôleur de rotation en veille jusqu’à ce que l’animal soit attaché à la corde.
4. Connecter l’animal au système cOFM :
   REMARQUE : La connexion et le détachement des animaux au système cOFM sont les plus faciles à réaliser lorsque l’animal est sous anesthésie temporaire à l’isoflurane. Si elle est bien réalisée, ce processus ne prend pas plus de 5 minutes par animal ; Cependant, l’utilisation d’une pommade ophtalmique est fortement recommandée.
   1. Anesthésie animale : placez l’animal dans la chambre d’induction de l’anesthésie isoflurane. Commencez l’anesthésie avec un débit d’oxygène à 2 L/min et l’isoflurane réglé à 3 %. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il atteigne un niveau d’anesthésie approprié (immobile avec un rythme respiratoire d’environ 1 souffle/s). Transférez l’animal de la chambre d’induction vers le masque anesthésique réglé à 2 L/min d’oxygène et 3 % d’isoflurane.
   2. Enveloppe animale : Placez l’animal dans une veste de taille appropriée, en passant complètement les membres antérieurs par les emmanchures et en fixant la veste solidement le long du dos de l’animal (illustré à la Figure 3C).
   3. Remplacement de l’insert factice par un insert d’échantillonnage : Utilisez une paire de pinces pour retirer la coin de verrouillage de l’ensemble guide et factice et soulevez soigneusement le mannequin hors du guide. Installez délicatement l’échantillonnage, insérez-le dans le guide, puis réinsérez le coin de verrouillage.
   4. Retirez l’animal de l’anesthésie et placez-le dans le système de cage rotative. Attachez l’attache de la cage à la veste animale et activez le système de cage rotatif.
5. Réalisation d’échantillonnages cOFM :
   1. Réglez les pompes de microperfusion à 5 μL/min et effectuez un rinçage de 2 minutes pour éliminer toute microbulle qui aurait pu résulter de l’installation de l’insert d’échantillonnage cOFM.
   2. Modifiez les réglages de la pompe de microperfusion au débit souhaité correctement pour le mode pompe (par exemple, 1 μL/min).
   3. Activez le mode pompe. Si vous effectuez un échantillonnage fractionné cOFM, activez le collecteur de fractions.
   4. Lors des premières étapes de l’échantillonnage cOFM, observez attentivement les tubes de poussée et de traction pour garantir l’absence de bulles de gaz, car elles nuiront au bon fonctionnement de la machine et à la collecte d’échantillons et risquent de mettre l’animal en danger. Si des bulles de gaz sont observées, arrêtez les composants du système, détachez l’animal du système cOFM, et retirez les bulles de gaz par rinçage d’aCSF à travers le tube.
   5. Tout au long du processus d’échantillonnage de cOFM, faites des observations supplémentaires fréquentes du tube de cOFM et du comportement animal. Si le comportement animal indique des changements soudains de santé, arrêtez immédiatement les composants du système et traitez la préoccupation de santé animale. Consultez le personnel vétérinaire de l’institution si nécessaire.
6. Détacher un animal du système cOFM :
   1. Désactivez le système de cage rotative et détachez l’attache de la veste animale.
   2. Transférer l’animal dans la chambre d’induction d’anesthésie isoflurane, avec l’insert d’échantillonnage et le tube cOFM toujours attachés. Commencez l’anesthésie avec un débit d’oxygène à 2 L/min et l’isoflurane réglé à 3 %. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il atteigne un niveau d’anesthésie approprié (immobile avec un rythme respiratoire d’environ 1 souffle/s). Transférez l’animal de la chambre d’induction vers le masque anesthésique réglé à 2 L/min d’oxygène et 3 % d’isoflurane.
   3. Remplacer l’insert d’échantillonnage par un insert factice : utilisez une paire de pinces pour retirer le coin de verrouillage de l’ensemble guide et insert d’échantillonnage, et soulevez soigneusement l’insert d’échantillonnage hors du guide. Réinstallez doucement l’insert factice dans le guide, puis réinsérez le coin de verrouillage.
   4. Enlèvement de la chemise : Détachez les attaches à l’arrière de la veste de l’animal et retirez doucement la veste de l’animal.
   5. Récupération et observation de l’animal : Retirer l’animal de l’anesthésie à l’isoflurane et le placer dans une cage de récupération propre, en assurant une observation continue jusqu’à ce que l’animal reprenne pleinement conscience et la couche sternale. Réinstallez-le dans une cage domestique une fois que l’animal est complètement rétabli.
7. Collecte et stockage d’échantillons :
   1. Échantillonnage fractionné :
      1. Retirez les tubes de collecte de fractions du collecteur de fractions et placez-les sur la glace pour un transport à court terme.
      2. Peser chaque tube de collecte et comparer au poids avant pré-prélèvement pour vérifier le volume de l’échantillon.
      3. Procéder aux analyses en aval des échantillons de cOFM ou les placer dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme.
   2. Échantillonnage recirculé :
      1. En laissant le tube de traction attaché à la sortie de l’insert d’échantillonnage cOFM (arbre plus court), détachez-vous du reste de l’installation et placez le tube et l’insert d’échantillonnage dans un nouveau tube de microcentrifuge propre.
      2. Fixez une aiguille stérile de 18G à une seringue stérile de 1 mL à 5 mL et remplissez d’air.
      3. Insérez soigneusement l’aiguille dans le connecteur de tube à bride à l’extrémité d’entrée du tube d’extraction.
      4. En veillant à ce que l’insert d’échantillonnage cOFM reste dans le tube de la microcentrifuge, appuyez sur le plongeur de la seringue pour éjecter le volume d’échantillon recirculé de cOFM du tube d’extraction avec de l’air. Assurez-vous que l’ensemble de l’échantillon de cOFM est éjecté du tube de traction dans le tube de la microcentrifuge, en détachant la seringue et en remplissant à nouveau d’air si nécessaire.
      5. Placez l’échantillon de cOFM recirculé sur la glace pour un transport à court terme.
      6. Procédez aux analyses en aval ou placez-les dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme.
8. Stockage des fournitures cOFM si l’échantillonnage cOFM est répété sur le même animal :
   REMARQUE : La réutilisation des objets jetables cOFM, tels que les inserts d’échantillonnage et les tubes d’entrée/sortie, n’est pas recommandée par le fabricant.
   1. Rincez le tube push-pull cOFM avec environ 500 μL d’aCSF stérile ou de solution saline à un débit d’au maximum 10 μL/min. Suivez avec un rinçage similaire de 1 à 2 mL d’éthanol à 70 %. Enfin, utilisez une seringue de 5 ou 10 mL équipée d’une aiguille de 18 g et d’un connecteur de tube à bride pour rincer le tube avec de l’air.
   2. Rinçez les tubes d’entrée et de sortie de l’insert d’échantillonnage cOFM avec 50 μL d’aCSF stérile ou de solution saline à l’aide d’une seringue en verre étanche équipée d’un connecteur à tubes à bride. Ajoutez ensuite 50 μL d’éthanol à 70 %. Détachez l’insert d’échantillonnage cOFM du connecteur du tube et stockez-le dans un flacon rempli d’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’il soit prêt à être réutilisé.

Résultats

Diverses mesures évaluatives pour déterminer le succès expérimental peuvent être mises en place à des stades expérimentaux intermédiaires ou culminants, selon la nature spécifique de la pathologie sous-jacente et du modèle animal expérimental. Pour les examens de la biologie du GBM, l’imagerie bioluminescente (BLI) peut être utilisée comme mesure d’évaluation intermédiaire de l’efficacité de l’engressement cellulaire tumoral médié par guide de la cOFM (Figure 4A

Discussion

Les procédures cOFM décrites dans ce protocole ont le potentiel de révolutionner l’étude des maladies du SNC grâce à leur capacité à échantillonner longitudinalement les composants endogènes de l’ISF du tissu pathologique. Cependant, le succès de l’étude de cette méthodologie dépend de la bonne exécution de plusieurs étapes critiques. Parmi celles-ci, le placement correct et sécurisé de la canule guide cOFM est l’un des plus importants. Des interventions chirurgicales ou des stratégies d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mèche de forage de 0,7 mm	Outils scientifiques finement	19008-07	Forage par trou à meule
Seringue de 1 à 5 mL	BD	#309646	Rétreival d’échantillon de perfusate recirculé
Aiguille 18 G	BD	#305195	Rétreival d’échantillon de perfusate recirculé
Aiguille 30G	BD Ultra-Fine	328438	Ponction de la dure-dure-mère
Sutures vicryl 4-0	Dynarex	9130	La fermeture chirurgicale serait
Lingettes alcoolisées	FisherBrand	22-363-750	Désinfection cutanée du site chirurgical
Vis d’ancrage	BASi	MD-1310	Placement de la tête du cOFM
Liquide cérébra-rachidien artificiel (aCSF)	BASi (Joanneum)	MD-2400	Échantillonnage ISF
Insert factice cOFM	BASi (Joanneum)	cOFM-D- #	Placement de la tête du cOFM
Guide cOFM	BASi (Joanneum)	cOFM-GD-#- #	Placement de la tête du cOFM
Porte-guide cOFM	BASi (Joanneum)	OFM-STM-1	Placement de la tête du cOFM
Insert d’infusion cOFM	BASi (Joanneum)	cOFM-I- #	Injection cellulaire
Coin de verrouillage cOFM	BASi (Joanneum)	cOFM-LOCK	Placement de la tête du cOFM
Insert d’échantillonnage cOFM	BASi (Joanneum)	cOFM-S-X	Échantillonnage ISF
Applicateurs à pointe de coton	FisherBrane	22363160	Absorption du fluide, application de peroxyde d’hydrogène
Lignée cellulaire de gliome de souris CT2A	Laboratoire Seyfried - Université de Boston	NA	Cellules tumorales greffées
Agent cimentant dentaire	IvoClar	595953US	Placement de la tête du cOFM
Lampe de durcissement dentaire	Henry Schein	5700253	Placement de la tête du cOFM
Crème dépilatoire	Veet	3116875	Épilation du site chirurgical
Rasoir électrique	Wahl Clipper Corp.  ;	8841	Épilation du site chirurgical
Pinces à pointe fine	Outils scientifiques finement	5SF	Incision, placement de la vis d’ancrage
Connecteurs de tuyau à brides	BASi (Joanneum)	MD-1510	Injection cellulaire
Fioles de collecte de fractions	BASi (Joanneum)	MF-5281	Stockage fractionné des échantillons
Seringue en verre étanche (25 & mu ; L)	Hamilton	80465	Injection cellulaire
Peroxyde d’hydrogène (1-3 %)	Walgreens	NDC : 0363-0268-32	Nettoyage de la surface du crâne
Seringues à insuline (0,3 à 1,0 mL) avec aiguilles de 31 G	BD Ultra-Fine	328438	Administration d’anesthésie et d’analgésique
Tubes microcentrifuges	Basix	02-682-002	Rétreival d’échantillon de perfusate recirculé
Microperceuse et support stéréotaxique	Appareil de Harvard	75-1874	Forage par trou à meule
Veste de souris	Lomir	MJ 02	Connexion animale au système de cage rotative
Tube à faible fixation OFM	BASi (Joanneum)	OFM-PP2-100-LB	Échantillonnage ISF
OFM-Pompe - Pompe à microperfusion	BASi (Joanneum)	MPP102-PC	Échantillonnage ISF
Pommade ophtalmique	Dechra	211-38	Lubrification oculaire péri-sugricale
Aiguille d’échantillonnage métallique passivée	BASi (Joanneum)	MW-2310	Stockage fractionné des échantillons
Pochet à perfusion	BASi (Joanneum)	OFM-BAG	Échantillonnage ISF
Solution physiologique de solution saline	Soins médicaux en soins intensifs & nbsp ;	0990-7983-03	Nettoyage de la surface du crâne, aide au forage de trous de meule
Prélèvements de povidone-iode	PDI Healthcare	SKU B40600	Désinfection cutanée du site chirurgical
Porte-sonde	Stoelting	51633
Collecteur de fractions réfrigéré	BASi (Joanneum)	MD-1201	Stockage fractionné des échantillons
Système de cage rotative	BASi (Joanneum)	AMD-R Raturn	Boîtier automatisé pour l’échantillonnage cOFM éveillé
Lames et manches de scalpel	Fisher Scientific & nbsp ;	22079693	Incision
Tournevis			Placement de la tête du cOFM
Adhésif dentaire auto-gravé   ;	Tokuyama		Amorçage de surface du crâne pour agent de ciment
Bouchon poussoir en silicone pour fioles de collection	BASi (Joanneum)	MF-5283	Stockage fractionné des échantillons
Cadre stérotaxique	Stoelting	51725