Article de recherche

Réaction en chaîne par polymérase numérique de microgouttelettes pour la détection précise des mutations du cancer du poumon non à petites cellules

653 vues

⸱

DOI :

10.3791/68770

⸱

29 juillet 2025

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole permettant de détecter de manière sensible et spécifique les mutations EGFR T790M à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes (ddPCR), qui peut également être étendu pour identifier rapidement d’autres mutations tumorales telles que G719S, L858R, L861Q et S768I.

Résumé

À l’échelle mondiale, le cancer du poumon continue d’être le principal facteur de décès liés au cancer, sa prévalence se classant au deuxième rang après celle du cancer du rein. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente environ 80 à 85 % de tous les cas de cancer du poumon signalés. La mutation T790M du gène EGFR est un déterminant primaire largement reconnu de la résistance acquise aux inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR-TKI). La présence de cette affection a été observée chez environ 50 à 60 % des personnes atteintes d’une maladie évolutive. Par conséquent, la mise en œuvre d’une approche rapide et très réactive pour détecter les mutations T790M dans le gène EGFR est essentielle pour l’identification rapide du cancer du poumon non à petites cellules. Dans la présente étude, la ddPCR a été utilisée pour détecter la mutation T790M avec une limite de détection de 10 copies/μL, ce qui est 10 fois plus élevé que la sensibilité de la qPCR (1 × 102 copies/μL). Pour les 15 échantillons simulés, la ddPCR a été capable de détecter la présence de mutations T790M dans le gène EGFR, qui ont été observées à des niveaux réduits lors de l’analyse par qPCR. La détection des mutations T790M à l’intérieur du gène EGFR par une méthode de détection rapide est à l’étude pour déterminer sa pertinence.

Introduction

Le cancer du poumon est la principale cause de mortalité liée au cancer dans le monde, et il se situe au deuxième rang des tumeurs malignes les plus répandues dans l’ensemble. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente une grande majorité, soit environ 80 % à 85 %, de tous les cas de cancer du poumon signalés 1,2,3,4. Pour les patients diagnostiqués avec un CPNPC avancé hébergeant des mutations de l’EGFR, l’approche thérapeutique établie implique l’application d’inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK) de première, deuxième ou troisième génération du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)5,6,7. Cependant, la plupart des patients traités avec des ITK-EGFR de première ou de deuxième génération finissent par développer une résistance acquise au médicament. Cette résistance est souvent attribuée à la présence de la mutation T790M dans le gène EGFR, que l’on retrouve chez environ 50 à 60 % des patients présentant une progression de la maladie 8,9,10,11,12.

Traditionnellement, les anomalies génétiques de l’ADN tumoral à partir d’échantillons de tissus sont identifiées à l’aide de techniques telles que l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) ou le séquençage de nouvelle génération (NGS)13,14. Pourtant, les biopsies tissulaires peuvent être difficiles en raison de l’inaccessibilité de la tumeur, de la mauvaise santé du patient ou du contenu insuffisant des cellules tumorales 15,16,17. Comme alternative, les biopsies liquides, en particulier à partir de plasma, offrent un moyen moins invasif d’identifier les mutations conductrices en détectant l’ADN tumoral circulant (ADNct). Les cellules tumorales libèrent de l’ADN dans la circulation sanguine, le liquide pleural, la salive ou les matières fécales, fournissant une source précieuse pour l’analyse génétique18,19. Le profil génétique de l’ADNtc reflète souvent la constitution génétique de la tumeur, offrant une vue complète de l’hétérogénéité tumorale, un facteur crucial pour un diagnostic précis et un traitement personnalisé du cancer20,21.

Parmi les diverses techniques d’identification des mutations de l’EGFR dans le sang périphérique, notamment le séquençage, la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR), la PCR numérique, la chromatographie liquide à haute performance dénaturante (DHPLC), le système de mutation réfractaire à amplification (ARMS) et la PCR enrichie de mutants (ME-PCR), la PCR numérique des microgouttelettes (ddPCR) est apparue comme un outil très efficace pour la détection des mutations de l’ADNtc22,23. Sa sensibilité supérieure, sa précision et sa capacité à détecter des mutations de faible abondance avec une grande précision le distinguent. Contrairement à la PCR traditionnelle, la ddPCR divise les échantillons en milliers de gouttelettes, ce qui permet la quantification absolue des séquences d’ADN cibles sans courbes standard. Cela le rend exceptionnellement adapté à la détection de mutations rares comme la mutation T790M dans EGFR. Malgré les avantages de la ddPCR, son application clinique généralisée a été limitée par des défis liés à la préparation des échantillons, à l’optimisation du système et à l’analyse comparative des performances avec des techniques établies comme la qPCR. Il existe une lacune critique dans l’optimisation des protocoles ddPCR pour la détection des mutations de l’ADNct, en particulier en ce qui concerne la sensibilité, la spécificité et la reproductibilité essentielles à l’adoption clinique.

Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse que la ddPCR offre une sensibilité et une fiabilité supérieures pour détecter la mutation T790M de l’EGFR dans l’ADNtc par rapport aux méthodes traditionnelles de qPCR. Nous nous sommes concentrés sur l’optimisation du processus d’extraction des acides nucléiques pour améliorer l’efficacité, puis sur l’optimisation de la ddPCR pour la détection des mutations. De plus, nous avons comparé les performances de la ddPCR et de la qPCR en termes de sensibilité, de spécificité et de reproductibilité à l’aide d’échantillons simulés. En évaluant systématiquement le potentiel de la ddPCR, nous visons à l’établir comme une alternative viable et supérieure à la qPCR pour la détection des mutations de l’EGFR dans les biopsies liquides.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Cette étude n’a pas impliqué de participants humains, de tissus humains ou d’expériences sur des animaux vivants ; Par conséquent, aucune approbation éthique formelle n’était requise. Toutes les procédures ont été menées conformément aux directives institutionnelles et nationales. Le plasmide mutant T790M a été synthétisé commercialement. Le sang de porc utilisé pour simuler des échantillons cliniques a été obtenu auprès d’un fournisseur certifié conformément aux réglementations sur le bien-être animal, sans aucune implication d’animaux vivants. Tous les autres réactifs, y compris les billes magnétiques, les amorces, les sondes et les enzymes PCR, ont été d’origine commerciale et utilisés selon les instructions des fabricants.

Extraction d’acides nucléiques
L’extraction des acides nucléiques a été réalisée à l’aide d’un kit d’extraction par billes magnétiques et d’un instrument d’extraction d’acides nucléiques entièrement automatique. La procédure standard consistait à ajouter 200 μL d’échantillon et 20 μL de protéinase K à la colonne 1 ou 7 de la plaque à puits profonds pré-remplie. Ensuite, 15 μL de billes magnétiques fournies avec le kit ont été ajoutés à la colonne 2 ou 8. Le programme d’extraction a été lancé sur l’instrument, avec le manchon magnétique placé à l’endroit désigné. Après l’extraction, le liquide de la colonne 6 ou 12 a été transféré dans un nouveau tube sans nucléase de 1,5 mL et stocké à -20 °C.

Afin d’optimiser l’extraction d’acides nucléiques cibles à faible concentration, des expériences d’optimisation ont été menées. Les paramètres d’extraction recommandés étaient les suivants : température de lyse de 70 °C, temps de lyse de 10 min, 1 min pour chacune des trois solutions de lavage, séchage de 2 min et élution de 3 min à 56 °C. Les paramètres les plus influents ont été systématiquement optimisés : la température de lyse (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C et 78 °C), le temps de lyse (1, 3, 5, 7 et 9 min) et la taille des billes magnétiques (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm et 1000 nm). Ces optimisations ont été réalisées à l’aide du plasmide mutant T790M à 1 × 105 copies/μL. Les billes magnétiques de 100 nm ont été fournies avec le kit d’extraction, tandis que les autres tailles de particules ont été obtenues auprès d’une société de biotechnologie. L’efficacité de chaque condition d’extraction a été évaluée en analysant les courbes d’amplification de la qPCR et les valeurs Ct des échantillons extraits. L’analyse statistique de ces résultats a été effectuée à l’aide d’un logiciel statistique.

ADN plasmidique standard
Le plasmide mutant T790M du gène EGFR a été synthétisé sur mesure par une société de biotechnologie. Quatre microgrammes de poudre de plasmide sec ont été remis en suspension dans 100 μL de tampon 1x TE. La concentration plasmidique a été déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre. Le nombre de copies par microlitre a été calculé à l’aide de la formule suivante : Nombre de copies/μL = [(6,02 × 1023) × (concentration d’ADN (ng/μL) × 10-9)] / (longueur de l’ADN par paires de bases × 660). La concentration du fragment synthétisé était de 1,26 × 109 copies/μL. Ce plasmide mère a ensuite été dilué 126 fois pour obtenir une concentration de travail de 1 × 108 copies/μL.

Conception et synthèse de l’amorce
Les amorces et une sonde TaqMan pour la mutation EGFR T790M ont été conçues à l’aide de Primer 6 sur la base des principes de conception d’amorces standard. Amorce amont : 5′-CCTCACCTCCACCGTGC-3′ ; Amorce aval24 : 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′ ; Sonde : 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. Toutes les amorces et sondes ont été synthétisées par un service commercial de synthèse d’oligonucléotides.

Mise en place et optimisation du système de détection quantitative par fluorescence ddPCR et TaqMan
Un stock plasmidique T790M de 1 × 108 copies/μL a été dilué à 1 × 106 copies/μL à l’aide d’un tampon TE 1× pour une utilisation dans les expériences d’optimisation des systèmes ddPCR et qPCR.

Optimisation du système ddPCR : Le système ddPCR a été optimisé sur la base des recommandations du fabricant de l’enzyme. Le système initial recommandé comprenait : 7,5 μL de 4 mélanges PCR, 1,2 à 3 μL d’amorce en amont (10 μM), 1,2 à 3 μL d’amorce en aval (10 μM), 0,3 à 1,8 μL de sonde (10 μM), 1 à 15 μL de matrice d’ADN et de l’eau exempte de nucléases jusqu’à un volume final de 30 μL. Le cycle d’amplification recommandé comprenait un premier cycle de 10 min à 95 °C, suivi de 40 cycles de 30 s à 94 °C et de 60 s à 55-65 °C. La température de recuit (55-61,8 °C), la concentration de l’amorce (1-3 μL), la concentration de la sonde (0,75-1,75 μL) et la concentration de la matrice (3-15 μL) ont été systématiquement optimisées. Les résultats de l’optimisation ont été analysés statistiquement à l’aide d’un logiciel statistique.

Optimisation du système qPCR : Le système qPCR a été optimisé selon les recommandations du fabricant de l’enzyme. Le système initial suggéré comprenait : 5 μL de polymérase Taq, 0,45 μL de 250 mM de MgCl2, 0,5 à 2,5 μL d’amorce directe (10 μM), 0,5 à 2,5 μL d’amorce inverse (10 μM), 0,5 à 2,5 μL de sonde (10 μM), 5 μL d’échantillon d’ADN et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume final de 25 μL. Le programme d’amplification recommandé était de 5 min à 95°C ; suivi de 45 cycles de 15 s à 95 °C et de 30 s à 56-64 °C, avec collecte de fluorescence à 56-64 °C. La température de recuit (56-64 °C), la concentration de l’amorce (1-3 μL), la concentration de la sonde (0,5-2,5 μL) et la concentration de la matrice (1-5 μL) ont été optimisées. L’analyse statistique de ces résultats a été effectuée à l’aide d’un logiciel statistique.

test de sensibilité PCR quantitatif ddPCR et fluorescence Taqman
Pour évaluer la sensibilité de la ddPCR par rapport à la qPCR, le plasmide T790M de 1 × 108 copies/μL a été dilué 10 fois en série à l’aide d’un tampon TE 1x pour créer un gradient de concentration allant de 106 à 101 copies/μL. Pour la ddPCR, sept solutions réactionnelles ont été préparées selon le système ddPCR optimisé, une pour chaque concentration, y compris un contrôle négatif. Les échantillons ont été chargés sur une puce génératrice de microgouttelettes et traités avec un instrument de génération de gouttelettes pour générer des microgouttelettes. Ces gouttelettes ont ensuite été amplifiées à l’aide d’un thermocycleur PCR, puis analysées par un instrument de détection PCR numérique. Parallèlement, sept solutions réactionnelles ont été préparées sur la base du système qPCR optimisé, avec des matrices identiques. Celles-ci ont été exécutées sur un instrument de PCR en temps réel pour évaluer les sensibilités respectives des deux approches (n = 3).

Tests de répétabilité ddPCR
Pour évaluer la répétabilité, l’ADN plasmidique standard T790M à 1 × 108 copies/μL a été dilué pour générer des étalons de concentration élevée (1 × 106 copies/μL), moyenne (1 × 104 copies/μL) et faible (1 × 102 copies/μL). Six solutions de réaction ont été préparées selon le système ddPCR optimisé. Les échantillons ont été chargés sur une puce génératrice de microgouttelettes et traités à l’aide d’un instrument de génération de gouttelettes pour former des microgouttelettes. Les microgouttelettes ont ensuite été amplifiées à l’aide d’un thermocycleur et analysées par un instrument de détection PCR numérique. Un témoin négatif a été inclus. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. La reproductibilité a été évaluée en comparant les profils d’amplification et en calculant les valeurs du coefficient de variation (CV) des trois répétitions expérimentales.

Test d’échantillons analogiques
Afin de tester la fiabilité des systèmes ddPCR et qPCR de la mutation T790M, nous avons utilisé du sang de porc mélangé au hasard avec des concentrations élevées et faibles de plasmides standard de mutation T790M respectivement, et du sang de porc sans plasmides standard mélangés a été utilisé comme échantillons négatifs, et 15 échantillons simulés ont été préparés au hasard, et de l’acide nucléique a été extrait des échantillons simulés, et détecté à l’aide des méthodes ddPCR et qPCR, respectivement.

Analyse statistique
Toutes les expériences ont été réalisées dans au moins trois répétitions techniques. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET). Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 10. Les différences entre les groupes ont été analysées à l’aide du test t de Student ou de l’analyse de variance à un facteur (ANOVA), selon le cas. Une valeur p inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Optimisation de l’extraction des acides nucléiques
Le flux de travail basé sur la ddPCR pour détecter la mutation EGFR T790M est résumé schématiquement dans la figure 1. Tout d’abord, nous avons déterminé la température de lyse optimale. Comme le montre la figure 2A, une température de clivage de 66 °C a donné la plus petite valeur moyenne de Ct, indiquant le clivage le plus efficace. Par conséquent, 66 °C ont été sélectionnés pour les expéri...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le cancer du poumon, en tant que principale cause de décès liés au cancer dans le monde, a toujours été au centre de la recherche médicale. Dans cette étude, nous explorons plusieurs aspects critiques du cancer du poumon, dans le but de fournir des informations plus approfondies sur son diagnostic, son traitement et son pronostic. La pierre angulaire d’un diagnostic et d’un traitement précis du cancer du poumon est un test génétique précis. Comme l’ont démontré Zhao et ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Département des sciences et de la technologie de la province du Yunnan et projet spécial conjoint de recherche fondamentale appliquée de l’Université de médecine de Kunming, 202101AY070001-134

CONTRIBUTION DE L’AUTEUR
Youming Lei et Guoli Lv ont contribué à parts égales à ce travail et en sont les co-premiers auteurs. Youming Lei et Guoli Lv ont conçu et conçu l’étude. Qingmei Yang a contribué à la collecte et à l’analyse des données. Jin Duan et Yunfei Shi ont supervisé l’analyse et l’interprétation des données, révisé le manuscrit et approuvé la version finale à publier. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1& fois ; Tampon TESangon BiotechB548144Tampon Tris-EDTA utilisé pour la dilution de l’ADN
4&fois ; Mélange d’enzymes Unimix-UTargetingOne BioUNIMIXU-4XddPCR Mélange d’enzymes
A300 Fast Thermal CyclerLongGeneA300Amplification par PCR
Analyseur de biopucesSEED BioDigitalPCR-BiochipSystème de détection pour PCR numérique
Marqueur de goutte Instrument de préparation d’échantillonsXinyi BiotechnologyPlateforme de PCR numérique TD-2Préparation de microgouttelettes
Kit d’extraction d’acide nucléique à bille magnétiqueLemnisCare TechnologyMXP-1005Extraction d’acide nucléique
Puce génératrice de microgouttelettesTargetingOne BiotechMG-Chip-01Utilisé pour générer des microgouttelettes pour ddPCR
NanoDropAllshengNC-500Mesure de la concentration d’acide nucléique après extraction d’échantillon
Spectrophotomètre NanoDrop ND-500Allsheng InstrumentsND-500Spectrophotomètre pour la quantification de l’ADN
Instrument PCR A300 Thermocycleur rapideLongGeneA300Thermocycleur pour amplification PCR
Amorces et sonde TaqManSangon BiotechAmorces synthétisées sur mesureet sonde TaqMan pour la détection T790M
Instrument qPCR Gentier miniTianlong TechnologyGentier miniPCR en temps réel instrument
T790M mutation plasmidebiologie Tsingke T790MCourbe standard et test limite de détection

Références

  1. Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Harkati, I., Hilali, M. K., Oumghar, N., Khouchani, M., Loukid, M. Lifestyle and sociodemographic and economic characteristics of patients with lung cancer in Morocco. Can Respir J. 2020 (1), 8031541(2020).
  4. Zhang, X., Zhao, Y., Wang, M., Yap, W. S., Chang, A. Y. -c Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutations in cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 60 (2), 175-182 (2008).
  5. Hackner, K., et al. Detection of EGFR activating and resistance mutations by droplet digital PCR in sputum of EGFR-mutated NSCLC patients. Clin Med Insights Oncol. 15, 1179554921993072(2021).
  6. Hanna, N., et al. Systemic therapy for stage IV non-small-cell lung cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (30), 3484-3515 (2017).
  7. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 378 (2), 113-125 (2018).
  8. Rosell, R., Bivona, T. G., Karachaliou, N. Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment. Lancet. 382 (9893), 720-731 (2013).
  9. Ohashi, K., Maruvka, Y. E., Michor, F., Pao, W. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease. J Clin Oncol. 31 (8), 1070-1080 (2013).
  10. Simarro, J., et al. Technical validation and clinical implications of ultrasensitive PCR approaches for EGFR-Thr790Met mutation detection in pretreatment FFPE samples and in liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Int J Mol Sci. 23 (15), 8526(2022).
  11. Yu, H. A., et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 19 (8), 2240-2247 (2013).
  12. Wang, W., Song, Z., Zhang, Y. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Cancer Med. 6 (1), 154-162 (2017).
  13. Hendriks, L. E., et al. Lung cancer in the Netherlands. J Thorac Oncol. 16 (3), 355-365 (2021).
  14. Visser, E., et al. Up-front mutation detection in circulating tumor DNA by droplet digital PCR has added diagnostic value in lung cancer. Transl Oncol. 27, 101589(2023).
  15. Ilié, M., Hofman, P. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy. Transl Lung Cancer Res. 5 (4), 420(2016).
  16. Cheng, M. L., et al. Circulating tumor DNA in advanced solid tumors: clinical relevance and future directions. CA Cancer J Clin. 71 (2), 176-190 (2021).
  17. Weber, B., et al. Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays. BMC Cancer. 14, 1-6 (2014).
  18. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  19. Bruhn, N., et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 906 (1), 72-82 (2000).
  20. Kohsaka, S., Petronczki, M., Solca, F., Maemondo, M. Tumor clonality and resistance mechanisms in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: implications for therapeutic sequencing. Future Oncol. 15 (6), 637-652 (2018).
  21. Takeda, M., et al. Impact of coexisting gene mutations in EGFR-mutated non-small cell lung cancer before treatment on EGFR T790M mutation status after EGFR-TKIs. Lung Cancer. 139, 28-34 (2020).
  22. Demuth, C., et al. Measuring KRAS mutations in circulating tumor DNA by droplet digital PCR and next-generation sequencing. Transl Oncol. 11 (5), 1220-1224 (2018).
  23. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Rev Mol Diagn. 18 (1), 7-17 (2018).
  24. Yu, Q., et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Mol Med Rep. 16 (2), 1157-1166 (2017).
  25. Zhao, Y., et al. Deep learning using histological images for gene mutation prediction in lung cancer: a multicentre retrospective study. Lancet Oncol. 26 (1), 136-146 (2025).
  26. Williamson, D. F., et al. Detection of EGFR mutations in non-small cell lung cancer by droplet digital PCR. PLoS One. 17 (2), e0264201(2022).
  27. Tang, C., et al. Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients. Clin Chim Acta. 510, 88-96 (2020).
  28. Xu, S., et al. Exploring the impact of egfr T790m neighboring snps on arms-based t790m mutation assay. Oncol Lett. 12 (5), 4238-4244 (2016).
  29. Merker, J. D., et al. Circulating tumor DNA analysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists joint review. J Clin Oncol. 36 (16), 1631-1641 (2018).
  30. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  31. Newman, A., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med. 20 (5), 548-554 (2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

PCR digitalePCR en microgouttelettesmutation de l EGFRmutation T790Md tection de mutationssensibilit de la qPCRr sistance aux EGFR TKIbiomarqueurs du cancer du poumononcologie de pr cision
Vidéo bientôt disponible

Articles connexes