Cette étude établit un protocole standardisé pour isoler les hépatocytes primaires des souris atteintes de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD), permettant des investigations pertinentes pour la maladie de la stéatose et du dysfonctionnement métabolique sans charge lipidique artificielle. La méthode permet d’obtenir des hépatocytes à haut rendement et à haute viabilité adaptés aux études mécanistes et thérapeutiques.
Article de méthode
Un protocole simple pour l’isolement et la culture d’hépatocytes à partir de souris MASLD
Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD), caractérisée par une accumulation pathologique de lipides (stéatose) dans les hépatocytes, représente un fardeau sanitaire mondial important et croissant. Les cultures primaires d’hépatocytes de souris servent de modèles ex vivo indispensables pour élucider la pathogenèse du MASLD et les interventions thérapeutiques. Cependant, l’isolement fiable d’hépatocytes de haute qualité à partir de foies stéatotiques reste techniquement difficile. Ici, nous présentons un protocole simple pour l’isolement efficace des hépatocytes primaires de souris MASLD en utilisant la technique de perfusion de collagénase. Ce protocole génère des hépatocytes présentant une stéatose inhérente sans nécessiter d’induction artificielle via une supplémentation en palmitate et en acide oléique, préservant ainsi un phénotype plus pertinent sur le plan physiologique. Le protocole produit des hépatocytes hautement viables et de haute pureté et est universellement applicable pour isoler de grandes quantités d’hépatocytes à partir de souris MASLD. De plus, il convient à l’évaluation pharmacologique ou aux études d’intervention génétique. En résumé, nous fournissons un protocole reproductible pour isoler des hépatocytes à haut rendement, de haute pureté et hautement viables pour des études de biologie cellulaire en aval afin de faciliter la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques et de médicaments pour la MASLD.
Introduction
La maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) est caractérisée par une accumulation pathologique de lipides dans les hépatocytes et représente la maladie hépatique chronique la plus répandue dans le monde1. On estime que la MASLD touche 38 % de la population adulte mondiale et est devenue une menace importante pour la santé humaine2. Les mécanismes de la MASLD n’ont pas été entièrement élucidés et les options de traitement sont très limitées. La découverte de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement d’agents ciblés pour la MASLD sont devenus un besoin clinique critique. Les hépatocytes, en tant que type de cellule prédominant composant le foie, sont le principal site du métabolisme hépatique du glucose, des lipides et des médicaments. Les hépatocytes primaires conservent une fonction plus complète des hépatocytes que les lignées cellulaires hépatocytaires et constituent un outil utile pour étudier les mécanismes des maladies du foie et le développement de médicaments3. L’isolement et la culture d’hépatocytes primaires de souris atteintes de stéatose hépatique sont une technique fondamentale pour étudier la physiopathologie hépatique, y compris le métabolisme des lipides, la résistance à l’insuline et les réponses inflammatoires. Un protocole antérieur établi pour l’isolement des hépatocytes à partir de modèles murins de stéatose hépatique a utilisé la centrifugation par gradient pour permettre spécifiquement la séparation des populations d’hépatocytes normaux et accumulant des lipides. Ces hépatocytes isolés chargés de lipides constituent donc un système modèle in vitro essentiel pour l’étude de la pathobiologie de la stéatose hépatique3. L’objectif principal de cette approche est d’obtenir facilement et économiquement des hépatocytes hautement viables et à haut rendement qui conservent des caractéristiques phénotypiques spécifiques à la maladie et sont donc capables d’imiter la MASLD in vitro.
La procédure générale d’isolement des hépatocytes chez la souris consiste en un processus en deux étapes qui commence par le rinçage du sang du foie avec une solution de perfusion isotonique, telle que la solution de sel équilibré de Hank (HBSS), puis la digestion du foie à l’aide d’une solution de digestion contenant de la collagénase. Les progrès récents dans les techniques de perfusion hépatique et de digestion enzymatique ont amélioré le rendement et la viabilité des hépatocytes primaires chez les souris femelles4. Les améliorations apportées aux méthodes traditionnelles de perfusion de la collagénase en deux étapes, telles que l’optimisation de la composition du tampon et la réduction des temps de digestion, ont été essentielles pour adapter les protocoles expérimentaux aux échantillons de stéatose hépatique. Les hépatocytes primaires servent de modèles indispensables pour élucider les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la MASLD et à ses complications cardiométaboliques, notamment par leur rôle dans la médiation de la diaphonie cœur-foie et des interactions de l’axe hépatique-vasculaire par le biais de médiateurs endothéliales et de facteurs angiogéniques 5,6. Ces cellules fournissent des informations essentielles sur les réseaux de communication multi-organes à l’origine de la progression de la maladie, comme en témoignent les associations cliniques entre le MASLD, l’insuffisance rénale chronique et la cardiopathie ischémique7, tout en offrant une plate-forme physiologiquement pertinente pour développer des thérapies ciblées ciblant à la fois les manifestations hépatiques et cardiovasculaires du syndrome métabolique. La recherche in vitro actuelle sur le MASLD repose principalement sur des hépatocytes normaux stimulés par l’acide palmitique/oléique (PA/OA) ou des lignées cellulaires d’hépatocytes humains (par exemple, HepG2 et Huh7), qui reproduisent de manière inadéquate les caractéristiques physiopathologiques des hépatocytes stéatotiques dans des conditions pathologiques, ce qui limite leur pertinence translationnelle pour l’étude des interactions cœur-foie-vasculaire. Cette approche ne parvient pas à saisir le dysfonctionnement métabolique chronique, le microenvironnement inflammatoire et la diaphonie interorganique spécifique à la maladie caractéristiques de la progression de la MASLD.
Ce protocole peut être utilisé pour isoler les hépatocytes de souris MASLD, sans qu’il soit nécessaire d’ajouter artificiellement des traitements à l’acide palmitique et oléique. En conclusion, nous présentons une méthode simple et reproductible pour obtenir des hépatocytes à haut rendement avec une excellente viabilité qui convient à la recherche en biologie cellulaire en aval pour soutenir la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de médicaments pour le MASLD.
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Protocole
Toutes les étapes expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université des sciences et de la technologie de Chine. Des souris C57BL/6J mâles ont été nourries avec un régime riche en graisses (HFD, #12492, Research Diet) pendant plus de 12 semaines dans cette étude.
1. Préparation d’une plaque ou d’un plat de culture enrobé de collagène
- Ajouter 15 mL d’EtOH à 100 % à 35 mL de H2O (jjH2O) doublement distillé. Préparez une solution de collagène de type I 50 μg/mL dans 30 % d’EtOH. Filtre avec un embout filtrant stérile de 0,22 μm.
- Enduire une plaque ou une boîte de culture cellulaire de 30 μL de solution de collagène parcm2. Incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
- Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette et séchez la plaque ou le plat de culture. Irradiez les boîtes revêtues avec de la lumière ultraviolette pendant 0,5 h pour la stérilisation. Conserver à 4 °C pendant moins de 1 mois.
REMARQUE : La longueur d’onde de la lampe UV est de 254 nm et l’intensité UV n’est pas inférieure à 400 mw / m2. La distance entre la source de la lampe UV et les plats recouverts de collagène est de 1 m.
2. Préparation de la solution de perfusion
- Quelques jours avant d’isoler les hépatocytes, préparer les réactifs d’isolement des hépatocytes et les milieux de culture indiqués au tableau 1. Filtrer les solutions de perfusion A et B à l’aide d’un embout filtrant stérile de 0,22 μm. Conserver à 4 °C pendant moins de 1 mois. Préparez un bain-marie et réglez la température à 37 °C.
- Préchauffer les solutions de perfusion A et B dans un bain-marie à 37 °C. Ajouter 40 mg de collagénase de type IV à 80 ml de solution de perfusion B avant la chirurgie.
- Pompez 75 % d’EtOH à un débit de 4 mL/min pendant 5 min à l’aide d’une pompe péristaltique à RT. Basculez le tube de la pompe de 75 % d’EtOH à la solution de perfusion préchauffée A.
REMARQUE : Assemblez l’unité de remplissage à circulation chauffée selon la configuration illustrée à la Figure 1A.
3. Intervention chirurgicale
- Anesthésie la souris à l’aide d’une méthode approuvée. Injecter du pentobarbital sodique (50 mg/kg) par voie intrapéritonéale. Vérifiez la perte du réflexe de virage avant de continuer.
- Fixez les membres supérieurs et inférieurs de la souris sur une planche de dissection. Stérilisez la zone chirurgicale avec de l’alcool à 75 %.
- Coupez les membranes abdominales interne et externe à l’aide d’instruments de dissection. Faites pivoter les organes viscéraux vers le côté gauche de la souris à l’aide d’un coton-tige pour exposer la veine cave inférieure (VCI) et la veine porte hépatique (PV).
- Appuyez sur la veine cave inférieure avec un coton-tige pour la gonfler. Insérez une aiguille à demeure de 22 G parallèlement à la veine cave inférieure.
- Retirez la partie en fer de l’aiguille à demeure. Laissez le cathéter dans la veine cave inférieure. Connectez l’aiguille à une ligne de perfusion à l’aide d’un embout filtrant de 0,22 μm.
REMARQUE : Une aiguille à demeure se compose d’une partie d’aiguille en fer et d’une partie de cathéter en plastique. Assurez-vous d’une insertion précise dans la veine cave inférieure et attendez que l’aiguille à demeure se remplisse de sang. Débarrassez-vous de toutes les bulles d’air de l’aiguille à demeure. Terminez rapidement l’ensemble de la procédure pour éviter la thrombose. - Régler le débit de perfusion à 5 mL/min de liquide de perfusion A. Commencer la perfusion et observer le foie jusqu’à ce qu’il apparaisse enflé. Coupez immédiatement la veine porte.
- Massez doucement le foie à l’aide d’un coton-tige pour assurer un rinçage sanguin complet. Continuez la perfusion jusqu’à ce que le foie devienne jaune terreux.
- Passez au liquide de perfusion B contenant 0,05 % de collagénase de type IV. Continuez la perfusion jusqu’à ce que le foie soit complètement digéré.
REMARQUE : Il faut au moins 10 minutes par souris pour que le foie soit digéré. Un volume de 80 ml de solution de perfusion B contenant de la collagénase est suffisant pour qu’une souris digère son foie. Le tissu hépatique subit une digestion enzymatique complète jusqu’à ce qu’il atteigne un ramollissement maximal, le parenchyme capsulaire atteignant un état d’extrême fragilité susceptible de perturbation mécanique. - Retirez le foie de l’abdomen de la souris. Placez le foie dans un plat de 10 cm contenant du DMEM.
- Procéder dans une enceinte de biosécurité. Déchiquetez le foie en poudre à l’aide d’une pince à épiler (le foie bien digéré libère facilement les hépatocytes).
- Filtrez la suspension sur un filtre à mailles de 70 μm dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Réglez le volume à 45 ml (par souris) avec le support DMEM.
- Centrifuger à 50 × g pendant 4 min. Videz complètement le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension avec du DMEM medium jusqu’à un volume final de 25 mL (par souris). Centrifuger à nouveau à 50 × g pendant 2 min.
- Videz complètement le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 25 mL de milieu de culture complété par 10 % de FBS.
- Mélangez bien la suspension. Teindre les cellules avec du bleu trypan pour compter. Procéder immédiatement à l’inoculation pour la culture.
REMARQUE : Placez 2 ml de milieu contenant 2 × 105 cellules par puits dans des plats à 6 puits enrobés de collagène. Remplacez le milieu DMEM après 2 h d’inoculation cellulaire.
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Résultats
Le protocole actuel a été mis en œuvre sur des souris mâles C57BL/6J nourries avec HFD pendant plus de 12 semaines. La morphologie et la fonction des hépatocytes primaires isolés ont été examinées. Nous avons obtenu un rendement moyen de 2 × 107 cellules par isolement à partir d’environ 40 g de foie de souris. La viabilité cellulaire a été déterminée entre 85 % et 86 % par coloration Calcein AM de cellules vivantes. Le rendement de chaque isolement de souris obèses induites par...
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Discussion
L’isolement d’hépatocytes de souris viables implique une procédure critique en deux étapes, commençant par une perfusion vasculaire complète à l’aide d’une solution isotonique pour éliminer les composants sanguins, suivie d’une digestion enzymatique contrôlée avec une solution de collagénase active 9,10. La réussite de l’isolement dépend du maintien de conditions physiologiques optimales tout au long du processus, en particulier ...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts potentiel n’a été signalé par les auteurs.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [n° 82373967].
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes à centrifuger stériles de 50 mL | |||
| Immunoway | YM8517 | ||
| Anticorps anti-IgG | Proteintech | 30000-0-AP | |
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | |
| CaCl2 | Merck (SigmaAldrich) | C5670 | |
| Centrifugeuse | Thermo ; | Sorvall ST16R | |
| Collagène de type I | Corning | 354236 | |
| Collagénase, Type 4 | Sangon Biotech | A004186-0001 | |
| Aiguille de retenue | BRAUN | 4254074B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| EGTA | Yeasen | 60339ES10 | |
| Ethanol | Merck (SigmaAldrich) | 493511 | |
| Sérum fœtal bovin | Sigma | F2442 | |
| Glucose | Merck (SigmaAldrich) | G7021 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Isoginkgetin ; | MedChemExpress | HY-N2117 | |
| K2HPO4 ; | Merck (Supelco) | PHR2900 | |
| KCl | Merck (SigmaAldrich) | P3911 | |
| Na2HPO4 · ; 12H2O | Merck (SigmaAldrich) | 04273 | |
| NaCl | Merck (SigmaAldrich) | S9888 | |
| NaHCO3 | Merck (SigmaAldrich) | S6014 | |
| Filtre à aiguille 0.22µ ; M | Millex-GP | SLGV033RB | |
| Nile Red | Invitrogen | N1142 | |
| Pénicilline/streptomycine (100X) | Gibco | 15140122 | |
| Adénovirus recombinant | Obio Technology Corp., ltd. ; | adénovirus recombinants codant pour l’IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) et l’adénovirus témoin (Ad-NC) ont été construits par Obio Technology Corp., ltd. | |
| Pentobarbital de sodium | Merck (SigmaAldrich) | P3761 | |
| Filtres à cellules stériles, 100 &mu ; m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Trypan Blue | Beyotime | ST2780-5g | |
| Pompe péristaltique à débit variable | Plus longue | BT100-1F |
Références
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