Mise à jour du Protocole pour l’assemblage et l’utilisation du réseau de minibioréacteurs (MBRA)

Summary

Le minibioréacteur (MBRA) est un système de culture à flux continu, personnalisable et à haut débit qui permet de cultiver des communautés microbiennes complexes, soutenant des expériences parallèles pour étudier la dynamique du microbiome, les interactions thérapeutiques et les réponses microbiennes aux facteurs environnementaux.

Abstract

Le microbiome humain comprend des communautés microbiennes diverses et dynamiques qui jouent un rôle essentiel dans la santé de l’hôte. Il est essentiel de comprendre ces communautés et leurs réponses aux facteurs environnementaux pour faire progresser les thérapies basées sur le microbiome. Les modèles in vitro traditionnels de culture du microbiote d’origine humaine manquent souvent d’évolutivité et nécessitent une expertise technique approfondie, ce qui limite leur accessibilité et leur débit. Pour remédier à ces limitations, nous avons développé le système MBRA (Minibioreactor Array), une plate-forme modulaire, à un étage et à flux continu pour la culture à haut débit de communautés microbiennes. Ce système permet la culture parallèle de jusqu’à 48 communautés microbiennes distinctes, ce qui favorise la flexibilité expérimentale tout en maintenant la croissance stable d’écosystèmes complexes. Ce protocole fournit des conseils détaillés sur la fabrication, l’assemblage, la stérilisation et le fonctionnement du MBRA. La conception modulaire du système permet une intégration facile dans les chambres anaérobies et prend en charge la personnalisation pour un large éventail d’applications expérimentales. Il a été utilisé pour étudier les réponses microbiennes aux antibiotiques, aux composés alimentaires et à l’invasion d’agents pathogènes, et pour dépister les communautés résistantes aux agents pathogènes. Grâce à son accessibilité, son évolutivité et sa reproductibilité, le MBRA représente un système modèle puissant pour étudier les interactions microbiennes et faire progresser la recherche sur le microbiome.

Introduction

Le microbiome humain est un écosystème complexe de micro-organismes qui joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et a un impact profond sur la santé humaine. Le microbiome humain s’étend sur de nombreux sites anatomiques dans tout notre corps, chacun contenant des communautés microbiennes dynamiques qui interagissent activement d’une manière que nous ne comprenons pas encore pleinement¹. L’élargissement de nos connaissances sur l’implication des communautés microbiennes dans la santé et la maladie dépend de notre compréhension des interactions microbiennes qui se produisent dans ces environnements¹. Pour étudier et manipuler efficacement ces systèmes complexes à des fins thérapeutiques, une approche réductionniste est nécessaire. L’exploration des interactions microbiennes individuelles à l’aide de systèmes modèles simplifiés facilite une meilleure compréhension de toute la complexité du microbiome².

Une grande variété de systèmes modèles sont disponibles pour faire croître des communautés microbiennes d’origine humaine. Ces systèmes ont fait progresser notre compréhension des communautés microbiennes associées à l’homme et vont de la culture par lots en une seule étape à des systèmes plus complexes à flux continu à plusieurs étapes. Des systèmes modèles, tels que le simulateur de l’écosystème microbien intestinal humain³, le système de chémostat à un seul étage à deux vaisseaux⁴ et le système de contrôle de l’environnement pour le microbiote intestinal⁵ , reproduisent les conditions physiologiques de sites anatomiques spécifiques et fournissent des approximations in vitro proches des environnements microbiens. Cependant, leur adoption par les microbiologistes est limitée car ils sont coûteux, nécessitent une expertise technique de haut niveau pour fonctionner et assurer leur maintenance, et leur débit est limité.

Pour relever ces défis, nous avons développé le système MBRA (Minibioreactor Array), un système de culture à flux continu en une seule étape conçu pour faciliter la croissance stable de communautés microbiennes à partir de sources diverses dans un environnement contrôlé ^6,7,8. Le système MBRA se distingue des autres modèles d’intestins par sa simplicité d’assemblage et de fonctionnement, combinée à des capacités à haut débit qui permettent la culture simultanée de plusieurs communautés microbiennes, augmentant ainsi l’efficacité expérimentale. De plus, la nature simple et compacte de ce système permet son fonctionnement dans des chambres anaérobies et microoxiques pour faciliter la croissance des bactéries à partir de sites anaérobies et hypoxiques, tels que le tractus gastro-intestinal et vaginal. La nature polyvalente de ce système a été mise à profit pour le dépistage des communautés gastro-intestinales résistantes à Clostridioides difficile ⁹, ainsi que pour tester les effets des antibiotiques^10,11 et des substrats alimentaires¹² sur les communautés microbiennes.

Les MBRA sont fabriqués par impression 3D ou par fabrication additive, en privilégiant la clarté et la résistance à l’eau dans notre choix de matériaux (voir le tableau des matériaux pour plus d’informations sur les polymères). Chaque réseau contient six chambres individuelles, toutes équipées de ports pour l’importation de supports, l’exportation de déchets et la collecte d’échantillons. Le fluide frais est alimenté en continu dans le système pendant que les déchets sont extraits simultanément, avec des débits contrôlés avec précision par deux pompes péristaltiques. Le contenu du système est constamment agité à l’aide de barres d’agitation et d’une plaque d’agitation à 60 points pour faciliter des cultures homogènes. Le protocole décrit ici est optimisé pour un volume de travail de 15 ml par chambre, bien que chaque bioréacteur puisse accueillir une plage de 1 à 20 ml en fonction des exigences expérimentales. La pompe péristaltique et le tube de la pompe peuvent supporter des débits allant de 0,016 à 2,9 mL/min, ce qui correspond à des taux de renouvellement d’environ 15,63 à 0,09 h, respectivement. Bien que le système soit compatible avec une large gamme de formulations de fluides et d’ajouts diététiques ou nutritionnels, certaines considérations pratiques doivent être prises en compte : les fluides très visqueux peuvent nécessiter un réétalonnage des débits, et la présence de particules non dissoutes ou de composants insolubles peut obstruer le tube de la pompe ou les connecteurs étroits, en particulier à des débits plus faibles. La modularité du système permet d’adapter rapidement et facilement les expériences en ajustant le choix des milieux, la collecte des échantillons, les débits et le volume de travail. En conjonction avec quatre pompes péristaltiques à 24 canaux et deux plaques d’agitation à 60 points, le système peut faire fonctionner 48 chambres distinctes par expérience dans une seule chambre anaérobie, ce qui permet un criblage anaérobie à haut débit.

Ce protocole sert de guide visuel et de version mise à jour d’une méthode d’assemblage et d’opération MBRA précédemment publiée et développée par notre laboratoire⁴. Plusieurs améliorations clés ont été apportées pour améliorer la reproductibilité, rationaliser le flux de travail et minimiser la contamination. Tout d’abord, les pailles en PTFE sont maintenant gravées chimiquement pour éviter qu’elles ne se détachent et ne tombent dans les chambres du bioréacteur. Deuxièmement, une paille de média a été ajoutée aux lignes d’alimentation pour diriger le flux de média dans le fond des chambres, empêchant ainsi le média de s’égoutter le long des parois de la chambre. Il s’agissait d’une source connue de formation de biofilm. Troisièmement, les longueurs de tube C-flex ont été normalisées et raccourcies, et un support de tube imprimé en 3D a été conçu pour créer une configuration plus compacte et organisée. Enfin, les bioréacteurs ne sont plus entièrement démontés entre chaque utilisation, ce qui réduit considérablement le temps et les coûts matériels associés aux expériences répétées. Ces améliorations et d’autres améliorations incrémentielles reflètent une optimisation itérative basée sur une utilisation intensive du système dans plusieurs projets de notre laboratoire.

Protocol

REMARQUE : Ce protocole concerne la préparation et l’assemblage d’une seule bande MBRA (Figure 1). Chaque MBRA se compose d’un bioréacteur imprimé en 3D, d’un tube pour faciliter l’afflux d’un milieu de croissance et d’un tube pour faciliter l’efflux des déchets des chambres du bioréacteur. Une liste complète des parties d’un seul MBRA, y compris des images, se trouve dans le tableau 1. L’équipement supplémentaire requis comprend deux pompes péristaltiques et une plaque d’agitation (voir le tableau des matériaux pour les spécificités de l’appareil ).

1. Préparation du prémontage

1. Gravure en polytétrafluoroéthylène (PTFE)
   REMARQUE : Bien que les propriétés chimiques du PTFE le rendent idéal pour une utilisation dans ce système MBRA, son pouvoir lubrifiant rend impossible la liaison à d’autres pièces de bioréacteur en utilisant uniquement de l’époxy. Pour fixer le tube en PTFE dans les luers mâles filetés, il doit d’abord être gravé chimiquement pour permettre le collage de l’époxy. Un décapant fluorocarbone est utilisé (voir Tableau des matériaux). La figure 2A sert de guide visuel pour coller le tube en PTFE afin de faciliter ce processus de gravure.
   1. Coupez douze longueurs de 25 mm de tubes en PTFE. Six d’entre eux seront coupés en deux après gravure pour servir de pailles pour les lignes d’alimentation (« paille de média »).
      REMARQUE : Seule la section à coller doit être gravée. Pour éviter la gravure de la surface intérieure et les zones indésirables, le tube doit être scellé et scellé aux deux extrémités.
   2. À l’aide d’un ruban d’étiquetage de laboratoire à usage général (largeur de 19 mm), enroulez complètement le ruban sur le dessus, couvrant ~5 mm du tube en PTFE (Figure 2A). Appliquez une autre section de ruban adhésif autour du bas, couvrant ~10 mm du tube en PTFE (Figure 2A).
   3. Pincez fermement les extrémités du ruban pour éviter que la solution de gravure n’atteigne l’intérieur du PTFE (Figure 2A). Cela devrait laisser ~10 mm de tube PTFE exposé pour la gravure.
   4. Préparez quatre solutions : la solution de décapant fluorocarboné chauffée à 55 °C (voir le tableau des matériaux pour les détails de la solution de décapant fluorocarboné), l’éthanol à 100 % (EtOH), le H₂O distillé chauffé à 70 °C et le H₂O distillé + 2 à 5 % d’acide acétique chauffé à 70 °C.
      ATTENTION : La solution de gravure au fluorocarbone est très corrosive. Effectuez toutes les étapes dans une hotte avec un EPI. Éliminer les produits chimiques conformément aux directives institutionnelles.
   5. Chauffer toutes les solutions aux températures indiquées à l’étape 1.1.4. La solution de gravure au fluorocarbone doit être chauffée au bain-marie, les autres solutions peuvent être chauffées sur une plaque chauffante. Versez les solutions dans 4 récipients en verre séparés suffisamment profonds pour immerger complètement le tube scellé.
   6. Immergez tous les tubes en PTFE dans la solution de mordançage au fluorocarbone. Tourbillonnez pour assurer une exposition uniforme de la surface. Faire tremper pendant 1 min, jusqu’à ce que la surface dépolie devienne brune.
      REMARQUE : Une cuillère de crépine en métal peut être utilisée pour transférer des tubes en PTFE entre les solutions.
   7. Transfert de la tubulure dans le bain EtOH pendant 5 à 20 s.
   8. Transfert de la tubulure dans le bain à 70 °C H₂0 pendant 15 à 30 s.
   9. Transférer la tubulure dans le bain d’acide acétique à 70 °C H₂0 + 2-5 % pendant 1 min.
   10. Retirez le tube et placez-le sur un tampon absorbant à l’intérieur de la hotte. Laissez le tube dépoli sécher pendant la nuit (au moins 16 h). Après séchage, retirez le ruban du tube gravé.
   11. Le PTFE dépoli est prêt à être collé et restera collable pendant plusieurs mois s’il est stocké à température ambiante. Une fois que la coloration brune sur les surfaces de gravure s’estompe, il n’est plus collable.
       REMARQUE : N’exposez pas le PTFE gravé à la lumière UV, car cela dégraderait la gravure.
   12. Coupez 6 des tubes en PTFE gravés en deux pour servir de pailles pour les conduites d’alimentation (Figure 2A).
2. Pailles pour déchets et médias époxy
   1. Insérez chacune des 6 pailles de déchets en PTFE gravées et des 6 pailles de média en PTFE gravées dans leur luer mâle fileté respectif. Assurez-vous que les surfaces gravées sont alignées avec le bas du luer mâle (Figure 2).
   2. Mélangez la résine époxy et le durcisseur dans un rapport de 1:1 dans un bateau de pesée ou une boîte de Pétri. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml, appliquez de l’époxy autour de la base du luer mâle fileté à l’endroit où il rencontre le tube en PTFE.
   3. Positionnez chaque pièce verticalement et laissez l’époxy durcir pendant 24 h.
      REMARQUE : Une boîte d’embout de pipette vide de 1 mL fonctionne bien pour les maintenir debout.

2. Assemblage MBRA

1. MBRA et préparation des pièces
   1. Assurez-vous que les bandelettes du réseau de minibioréacteurs sont imprimées en 3D (voir Fichier supplémentaire 1) et contiennent 6 chambres de bioréacteur indépendantes. Chaque chambre contient trois orifices de 1/4 de pouce, qui doivent être filetés pour insérer les raccords. Faites le filetage avec un taraud de fraction de 1/4 pouce-28NF avec une clé à tarauder à poignée en T.
      REMARQUE : L’utilisation d’un guide de taraudage est recommandée lors de l’enfilage des ports pour assurer un filetage d’aplomb.
   2. Une fois fileté, lavez chaque chambre du bioréacteur avec de l’eau pour éliminer tout résidu de plastique. Ajoutez un barreau d’agitation magnétique de 10 x 3 mm et 1 mL d’eau distillée dans chaque chambre. L’eau facilitera le processus de stérilisation pendant l’autoclavage.
   3. Placez une rondelle en caoutchouc sur chaque orifice du bioréacteur. Pour chaque chambre, vissez 1 Luer mâle fileté en paille usée, 1 Luer mâle fileté en paille et 1 Luer mâle fileté vide dans chacun des orifices, comme indiqué sur la figure 2B.
   4. Insérez 6 septa en caoutchouc sur des barbes Luer femelles de 3/32 de pouce. Repliez le haut de la manche du septa vers le bas pour couvrir le cou. Fixez-les aux orifices de chaque chambre indiqués à la figure 2B.
   5. Coupez des bandes de tubes C-flex de la longueur suivante : 2 3/8 pouces, 3 11/16 pouces, 5 1/4 pouces, 6 1/2 pouces, 7 13/16 pouces, 9 pouces et 9 pouces (deux de chaque longueur seront nécessaires pour les conduites de déchets et les conduites d’alimentation). Une fois coupé, fixez un raccord Luer femelle de 1/8 de pouce à une extrémité et un connecteur Luer lock mâle à l’extrémité opposée de chaque longueur de tube.
      REMARQUE : Les longueurs utilisées ici sont optimisées pour réduire l’encombrement et pour les pompes placées à ~1 pouce de la plaque d’agitation. Selon la configuration souhaitée, des longueurs plus longues peuvent être nécessaires.
   6. Insérez une barbe Luer femelle de 1/16 de pouce à chaque extrémité du tube rouge à 2 arrêts E-lab (1,14 mm de diamètre intérieur) et du tube orange à 2 arrêts de l’E-lab (0,89 mm de diamètre intérieur). Répétez ce processus six fois pour chaque bande MBRA.
      REMARQUE : Pour faciliter l’insertion de l’ardillon Luer femelle de 1/16 de pouce, immergez brièvement les extrémités du tube E-lab dans de l’eau presque bouillante pour ramollir le plastique.
   7. Connectez la tubulure E-lab à la tubulure C-flex préparée à l’étape 2.1.5. Chacune des 6 longueurs de tube C-flex doit être connectée à une ligne E-lab rouge et à une ligne orange par des luers femelles.
   8. Coupez vingt et un morceaux de 1 pouce, un morceau de 2 pouces, trois morceaux de 3 pouces et un morceau de tube C-flex de 12 pouces. Fixez un raccord Luer barbe femelle de 1/8 de pouce et un connecteur Luer lock mâle aux extrémités d’un morceau de 3 pouces et du morceau de tube de 12 pouces. Sur le tube restant, fixez les connecteurs Luer Lock mâles aux deux extrémités. Ces pièces comprendront les assemblages de la conduite de déchets et de l’arbre de la ligne d’alimentation.
2. Ensemble d’arbre de ligne de déchets
   1. Suivez le schéma 3D illustré à la figure 3B pour assembler l’arbre des conduites de déchets.
   2. Fixez les extrémités exposées du tube E-lab rouge à 2 arrêts (1,14 mm de diamètre intérieur) aux verrous Luer mâles terminaux sur l’arbre de conduite de déchets assemblé. Fixez-les dans l’ordre croissant en fonction de la longueur du tube C-flex fixé au tube E-lab à 2 arrêts. Fixez le tube C-flex de 3 pouces avec l’ardillon Luer femelle de 1/8 pouce et le connecteur Luer Lock mâle au sommet de l’arbre de la conduite de déchets.
3. Ensemble d’arbre de ligne d’alimentation
   1. Suivez le schéma 3D illustré à la figure 3A pour assembler l’arbre de la ligne d’alimentation.
      REMARQUE : Les arbres de conduite d’alimentation n’intègrent pas les connecteurs Luer mâle à mâle utilisés dans l’arbre de conduite de déchets. D’après notre expérience, ces connecteurs sont sujets aux fuites et peuvent facilement se desserrer, ce qui augmente le risque de contamination à la fois dans les chambres du bioréacteur et dans les bouteilles du média. Pour atténuer ce problème, l’arbre de la ligne d’alimentation est construit sans ces composants.
   2. Fixez les extrémités exposées de la tubulure E-lab orange à 2 arrêts (0,89 mm de diamètre intérieur) aux verrous Luer mâles terminaux sur l’arbre de la conduite d’alimentation assemblé. Fixez-les dans l’ordre croissant en fonction de la longueur du tube C-flex fixé au tube E-lab à 2 arrêts. Fixez le tube C-flex de 12 pouces au sommet de l’arbre de la conduite d’alimentation.
4. Assemblage complet : Combinez les composants préparés dans le système de culture MBRA.
   1. Fixez le tube C-flex de longueur variable à l’extrémité de l’arbre de la conduite d’alimentation au bioréacteur, par ordre croissant, avec la ligne la plus courte sur le côté gauche de la bande du bioréacteur et la plus longue sur la droite.
   2. Fixez le tube C-flex de longueur variable à l’extrémité de l’arbre de la conduite de déchets à la bande du bioréacteur par ordre décroissant, avec la ligne la plus longue à gauche et la plus courte à droite. La conduite de déchets la plus courte est située sur le côté droit de la bande du bioréacteur car elle est la plus proche de la pompe à déchets. En revanche, la conduite d’alimentation la plus longue se trouve sur le côté droit car la pompe d’alimentation est située sur la gauche (Figure 1).
5. Stérilisation des matrices assemblées : Préparez le système assemblé pour la stérilisation.
   1. Regroupez toutes les conduites d’alimentation C-flex sur le côté gauche du MBRA et fixez-les à l’aide d’une attache torsadée. Faites de même pour les conduites de déchets sur le côté droit de la bande.
   2. Formez une boucle avec le tube orange E-lab à 2 arrêts entre les conduites C-flex. Fixez la boucle à l’aide de ruban adhésif autoclave. Faites de même pour la tubulure rouge E-lab à 2 arrêts du côté des déchets de la bande du bioréacteur. Cela permettra de gagner de la place lors de l’autoclavage.
   3. Couvrez le luer femelle à l’extrémité de la conduite de déchets et de l’arbre de la ligne d’alimentation avec un morceau de papier d’aluminium pour éviter la contamination après l’enlèvement de l’autoclave. Desserrez les luers filetés mâles avec les septa sur chaque chambre du bioréacteur pour permettre à la vapeur de s’échapper pendant l’autoclavage.
      REMARQUE : Cette étape est essentielle pour s’assurer que la vapeur peut s’échapper du bioréacteur pendant l’autoclavage. S’ils ne sont pas correctement ventilés, des fissures dans les chambres du bioréacteur peuvent se produire.
   4. Placez le MBRA dans un bac d’autoclave et étirez les arbres de la conduite d’alimentation et de la ligne de déchets dans des bacs séparés adjacents au bac contenant les MBRA. Si le tube E-lab près de l’ardillon Luer femelle de 1/16 de pouce ou toute section du tube C-flex est plié pendant l’autoclavage, le tube peut se boucher, entraver l’écoulement des fluides ou des déchets.
   5. Autoclave à 121 °C, ≥ 15 psi pendant 25 min. Utilisez un programme d’évacuation lent typique des cycles liquides. Laissez le bioréacteur refroidir à température ambiante après le cycle de l’autoclave. Une fois que le MBRA a suffisamment refroidi, resserrez les luers mâles filetés avec les septa.
      REMARQUE : Les bandelettes de bioréacteur autoclavées deviennent malléables et sujettes à la fissuration si elles sont comprimées. Laisser refroidir suffisamment avant de serrer les raccords.
      REMARQUE : Le tube orange à 2 arrêts E-lab est sujet à la fissuration pendant le processus d’autoclave et peut se séparer de l’ardillon Luer femelle de 1/16 de pouce. En cas de fissuration, vaporisez les deux extrémités avec de l’éthanol à 70 %, puis coupez l’extrémité fissurée avec un rasoir stérile et rattachez le tube à l’ardillon Luer. Alternativement, un tube E-lab supplémentaire avec des luers femelles de 1/16 de pouce attachés peut être stérilisé séparément dans un sac d’autoclave, et l’ensemble du tube peut être remplacé.

3. Assemblage des supports et des bouteilles de déchets

1. Assemblage de la bouteille de support
   REMARQUE : Dans l’exemple présent, l’ensemble du système est alimenté avec une seule bouteille de 2L. Reportez-vous à la Figure 4A pour une image de l’ensemble du bouchon de la bouteille.
   1. Vissez les adaptateurs Dibafit (adaptateurs de bouchon de bouteille) dans les deux ports filetés situés sur le dessus du bouchon de bouteille de la série Q. Ajoutez une section de 3 pouces de tube C-flex à l’un des adaptateurs et une section de 12 pouces de tube C-flex à l’autre. À l’extrémité de chaque section de tube, ajoutez un connecteur Luer Lock mâle.
      REMARQUE : La longueur du tube nécessaire pour atteindre l’arbre de la ligne d’alimentation du MBRA peut varier et peut être ajustée en conséquence.
   2. Coupez un morceau de tube en PTFE de 12 pouces pour servir de paille à partir de laquelle tirer le média. Coupez l’extrémité à un angle de 45° à l’aide d’une lame de rasoir pour éviter le colmatage de la paroi latérale de la bouteille. Insérez le PTFE dans le petit trou au bas du bouchon de la bouteille relié à la section de 12 pouces du tube C-flex.
   3. Coupez un morceau de tube C-flex de 2 pouces et fixez un raccord Luer barbelé femelle à une extrémité et un connecteur Luer lock mâle à l’autre. Fixez ce tube à la section de 12 pouces du tube qui finira par se connecter à l’arbre de la conduite d’alimentation. Fixez le morceau de 2 pouces avec un robinet à pince. Placez la boucle du Pinchcock autour du tube de 3 pouces du bouchon de la bouteille. Celui-ci servira de bouchon temporaire pour éviter les fuites de fluide pendant et après l’autoclavage.
   4. Préparez le support souhaité. Installez le bouchon de la bouteille entièrement assemblé sur la bouteille de support. Enroulez le tube C-flex de 12 pouces autour de la bouteille et fixez l’extrémité avec le Pinchcock sur le tube de 2 pouces, comme décrit ci-dessus. Ne vissez pas trop le bouchon, mais desserrez-le légèrement pour éviter l’accumulation de pression pendant l’autoclavage.
   5. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir l’extrémité du tube de 3 pouces partant du bouchon de la bouteille. Autoclave pour un temps adapté au protocole du média. Après la stérilisation, retirez la feuille du tube de 3 pouces et vissez un filtre de seringue de 0,22 μm dans le connecteur Luer Lock mâle. Cela permettra à l’air de circuler dans le flacon de média pendant le pompage, mais empêchera la contamination.
      REMARQUE : Avant utilisation, assurez-vous que les bouchons de bouteilles de la série Q sont bien scellés sur les bouteilles, car une mauvaise étanchéité peut empêcher un bon écoulement.
2. Assemblage des bouteilles de déchets : Pour éviter de changer de bouteilles de déchets tous les jours, le laboratoire a créé un système de collecte des déchets à plusieurs niveaux (figure 4B) qui permet de remplir plusieurs bouteilles de 2 litres de déchets pendant l’expérience. La configuration de ce système de déchets étagés est la suivante :
   1. Vissez les adaptateurs de bouchon de bouteille dans les deux ports filetés sur le dessus d’un bouchon de bouteille de la série Q. Répétez l’opération pour 2 à 4 bouchons de bouteilles, en fonction du nombre de bouteilles de stockage de déchets nécessaires.
   2. Coupez un morceau de PTFE de 2 pouces pour chaque bouchon de bouteille. Insérez cette pièce à l’intérieur du bouchon de la bouteille dans le trou désigné pour évacuer les déchets vers la bouteille suivante dans le système.
   3. Coupez une longueur de tube C-flex suffisamment longue pour s’étendre entre l’arbre de la conduite de déchets partant de la pompe et l’emplacement du système de bouteilles de déchets. Installez un connecteur Luer Lock mâle à l’extrémité adjacente à l’arbre de la conduite de déchets et connectez l’autre extrémité à l’adaptateur de bouchon de bouteille sans le tube en PTFE sur le bouchon de la bouteille.
   4. Coupez une deuxième longueur de tube C-flex pour relier les bouchons des première et deuxième bouteilles usagées. Fixez le tube de l’adaptateur de bouchon de bouteille avec la paille en PTFE sur la première bouteille et sur l’adaptateur de bouchon de bouteille sans la paille en PTFE sur la deuxième bouteille.
      REMARQUE : Chaque bouteille de la cascade de bouteilles de déchets à plusieurs niveaux doit être placée au-dessus de la première pour permettre à la gravité de faciliter l’écoulement d’une bouteille à l’autre (figure 4B). Il est recommandé de placer toutes les bouteilles dans un contenant secondaire (p. ex., un bac de rangement en plastique ouvert) et de les ranger par ordre décroissant à l’aide de contremarches, comme des contenants pour objets tranchants inversés.
   5. Continuez cette chaîne pendant autant de bouteilles que vous le souhaitez. Sur la bouteille finale, fixez un segment de tube C-flex de 3 pouces avec un connecteur Luer Lock mâle à l’adaptateur de bouchon de bouteille libre. Connectez ensuite une seringue de 20 mL pour appliquer un vide et faciliter la cascade de déchets.

4. Connexion, fonctionnement et démontage MBRA

1. Fixation sur pompes
   1. Retirez le ruban adhésif de l’autoclave qui maintient la tubulure E-lab ensemble pour les conduites de déchets et d’alimentation. Dénouez les faisceaux de tubes C-flex.
   2. Placez le MBRA entre les deux pompes sur le dessus de la plaque d’agitation. Il peut être fixé sur la plaque à l’aide des supports imprimés en 3D (voir Fichier supplémentaire 2). Assurez-vous qu’il est aligné avec les positions d’agitation indiquées sur la plaque d’agitation.
   3. Fixez le tube E-lab de la conduite d’alimentation aux cartouches de la pompe péristaltique. Positionnez les butées de la tubulure E-lab dans les fentes des cartouches. Faites de même pour le tube E-lab de la conduite d’évacuation sur la pompe à droite de la plaque d’agitation.
   4. Verrouillez les cartouches de la pompe péristaltique dans la pompe. Assurez-vous que les cartouches sont bien en place contre la pompe et que le tube se trouve à l’intérieur du canal des cartouches.
      REMARQUE : Ne verrouillez les cartouches en place sur les pompes que si vous avez l’intention de démarrer le débit dans les 24 heures. S’ils sont laissés serrés sans écoulement de fluide pendant plus de 24 h, les tubes peuvent se comprimer et se boucher. Si cela se produit, il suffit de retirer la pince et de masser doucement la tubulure au point de compression.
   5. Rangez le tube C-flex à l’aide des supports de tubes imprimés en 3D (Dossier supplémentaire 3).
   6. Fixez l’extrémité de l’arbre de la conduite de déchets au tube menant aux bouteilles de déchets.
      REMARQUE : Lors de l’exécution de plusieurs MBRA, les arbres de ligne de déchets devront être divisés ensemble avant de se fixer au tube menant aux bouteilles de déchets. Cela peut être fait en créant une simple arborescence de branches pour chaque MBRA supplémentaire.
   7. Fixez le luer femelle sur le tube d’entrée de la conduite d’alimentation au connecteur mâle sur le tube de 12 pouces à partir du bouchon de la bouteille de support.
      REMARQUE : Les deux extrémités doivent être stériles à ce stade. Évitez de les toucher avec une source potentielle de contamination. Si une contamination est suspectée, trempez chaque extrémité dans de l’eau de Javel à 10 % pendant 10 minutes avant de vous connecter.
   8. Allumez les deux pompes pour commencer l’écoulement du fluide. Assurez-vous que les pompes s’écoulent dans la bonne direction (les deux réglées dans le sens des aiguilles d’une montre (« CW ») si les déchets sont à droite des pompes).
   9. Observer la taille et la cadence des gouttelettes de média tombant dans chaque chambre de bioréacteur ; Toute différence importante dans ce domaine peut indiquer une variabilité du débit. Si une variabilité est observée, il est recommandé de remplacer tout tube d’alimentation E-lab orange à 2 arrêts connecté à la chambre du bioréacteur incriminé. Cela permettra de limiter la variabilité du débit au cours de l’expérience.
      REMARQUE : C’est le moment de diagnostiquer et de réparer toute fuite dans le système, alors surveillez de près le processus de remplissage initial.
   10. Une fois que les chambres du bioréacteur atteignent leur capacité, arrêtez les deux pompes et laissez les bioréacteurs reposer pendant 24 à 48 heures. Cette étape est essentielle pour vérifier l’absence de contamination potentielle dans les chambres avant le début de l’expérience.
2. Inoculation MBRA
   REMARQUE : Nous décrivons ici le protocole de base pour la stérilisation des septa et l’injection d’un inoculum.
   1. Préparez l’inoculum selon les spécifications souhaitées.
   2. Appliquez une solution d’eau de Javel à 10 % fraîchement préparée sur le dessus des septa de chaque chambre de bioréacteur à l’aide d’un compte-gouttes en plastique. Déposez suffisamment d’eau de Javel pour recouvrir complètement le haut des septa. Laissez reposer pendant 10 min. Séchez les septa à l’aide d’une lingette de laboratoire stérile.
   3. À l’aide d’une aiguille de 22 G de 3 pouces de long et d’une seringue contenant l’échantillon, percez le centre des septa. Assurez-vous que l’aiguille touche le milieu à l’intérieur de la chambre, puis injectez l’inoculum dans la chambre du bioréacteur. Rincez la seringue en retirant le support et en le réinjectant dans la chambre. Retirez les aiguilles des septa et jetez-les dans un récipient pour objets tranchants.
   4. Laisser l’inoculum se développer pendant une période appropriée, selon le plan expérimental, avant de commencer l’écoulement. Par exemple, les communautés bactériennes fécales nécessitent une croissance initiale de 4 à 16 h pour augmenter la^{biomasse 8}.
   5. Allumez les deux pompes au débit souhaité, en fonction du temps de rotation requis. Voir le manuel de la pompe péristaltique pour plus d’informations sur les débits.
      REMARQUE : Quel que soit le débit souhaité, la pompe à déchets doit toujours fonctionner à une vitesse supérieure à celle de la pompe de fluide pour s’assurer que les chambres du bioréacteur ne débordent pas. Pour la culture de notre communauté bactérienne gastro-intestinale, nous utilisons un taux de renouvellement de 1,92 ml/h, obtenu en réglant la pompe de média à 1,0 tr/min et la pompe à déchets à 2,0 tr/min.
   6. Encore une fois, observez la taille et la cadence des gouttelettes de média tombant dans chaque chambre de bioréacteur, toute grande différence dans ce domaine peut indiquer une variabilité du débit. Si une variabilité est observée, il est recommandé de remplacer tout tube d’alimentation E-lab orange à 2 arrêts connecté à la chambre du bioréacteur incriminé. Cela permettra de limiter la variabilité du débit lors des essais expérimentaux.
3. Échantillonnage MBRA
   1. Appliquez une solution d’eau de Javel à 10 % sur le haut des septa de chaque chambre de bioréacteur, suffisamment pour recouvrir complètement la surface. Laissez reposer pendant 10 min. Après 10 min, séchez les septa à l’aide d’une lingette de laboratoire stérile.
   2. À l’aide d’une aiguille et d’une seringue de calibre 22 de 3 pouces de long, percez le centre des septa et insérez complètement l’aiguille dans la chambre du bioréacteur. Tout en tenant la seringue, tirez sur le piston pour retirer l’échantillon de la chambre.
      REMARQUE : Évitez de retirer plus de 20 % du volume total de la chambre du bioréacteur à la fois. L’élimination d’une quantité supérieure peut perturber la communauté microbienne, car l’efflux de déchets est interrompu jusqu’à ce que le milieu frais remplisse la chambre jusqu’au niveau de la paille de déchets de PTFE.
   3. Retirez l’aiguille et distribuez l’échantillon dans un récipient approprié. Jetez l’aiguille dans un contenant pour objets tranchants.
4. Démontage et remise à neuf MBRA
   REMARQUE : Après les expériences, le MBRA devra être stérilisé et préparé pour les expériences futures.
   1. Remplacez l’entrée du support par 1 L d’eau de Javel à 10 % dans de l’eau désionisée (DI). Augmentez le débit des deux pompes au maximum pour déplacer le contenu des chambres du bioréacteur avec la solution d’eau de Javel.
   2. Une fois que les chambres sont dégagées (tous les supports ont été remplacés par de l’eau de Javel), inversez le MBRA pour désinfecter au-dessus de la ligne de remplissage pendant 5 min. Après 5 min, redressez la bandelette et attendez 5 min supplémentaires pour la stérilisation.
      REMARQUE : Ne laissez pas l’eau de Javel reposer au-delà des 10 minutes décrites ci-dessus, car cela provoquerait une décoloration du plastique et un affaiblissement du support et des tubes de déchets.
   3. Remplacez la solution d’eau de Javel à 10 % par 1 L d’eau DI. Rincez le système avec de l’eau DI jusqu’à ce que toute l’eau soit passée. Débranchez la tubulure E-lab du bioréacteur des pompes et retirez les MBRA.
   4. Pour remettre à neuf, retirez les septa usagés et tout l’eau sauf 1 ml de chaque chambre.
   5. Remplacez le septa et la tubulure E-lab orange à 2 vitesses et suivez les étapes précédentes pour vous préparer à l’autoclave (étapes 2.5.1 à 2.5.5) jusqu’à 3 fois. Après la troisième réutilisation, le MBRA doit être complètement démonté, le tube C-flex remplacé et chaque pièce individuelle stérilisée avec 70 % d’EtOH ou remplacée si elle est cassée. L’époxy contenant les déchets et le PTFE d’alimentation deviendra cassant après plusieurs cycles d’autoclave et devra être réappliqué.
      REMARQUE : La tubulure orange à 2 arrêts E-lab est remplacée entre chaque passage pour limiter la variabilité du débit causée par l’usure et les cycles répétés de l’autoclave.

Results

Pour faciliter la croissance des bactéries anaérobies, telles que celles que l’on trouve dans le tractus gastro-intestinal, le MBRA peut être installé et exploité à l’intérieur de chambres anaérobies. Pour démontrer la capacité de développer des communautés bactériennes complexes directement à partir de sites pertinents dans le corps humain, un échantillon de matières fécales humaines a été préparé et cultivé dans ce système. Tous les travaux ont été effectués dans une chambre anaérobie réglée à 37°C, et les cultures ont été cultivées dans notre milieu de bioréacteur, BRM3⁷.

La boue fécale a été préparée en décongelant des selles humaines de manière anaérobie, puis en la mélangeant avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à une concentration finale de 25 % p/v. Après avoir confirmé la stérilité, neuf chambres de bioréacteur ont été inoculées chacune avec 3 ml de la même boue fécale. Les communautés microbiennes ont été cultivées pendant la nuit sans apport de milieu ni enlèvement des déchets, ce qui a donné lieu à des cultures par lots distinctes sur une période de 16 heures. Ensuite, les pompes d’alimentation ont été mises en marche et réglées à un débit de 1,92 mL par h. Après quatre jours de flux continu, des échantillons ont été prélevés dans les bioréacteurs et analysés pour la composition de la communauté microbienne à l’aide du séquençage du gène de l’ARNr 16S, suivi d’un débruitage avec Deblur et d’une classification taxonomique avec la base de données SILVA 138 SSU dans QIIME 2¹³. Au total, 65 genres ont été détectés dans les neuf répétitions, mais les bioréacteurs n’étaient dominés que par 18 genres, chacun présentant une abondance d’au moins 2 % dans l’une ou l’autre des neuf répétitions (figure 5). Les bioréacteurs ont montré une reproductibilité élevée, de sorte que 22 des 65 genres ont été détectés dans les neuf répétitions, et 17 autres genres ont été détectés dans au moins la moitié des répétitions. La majorité des genres absents d’au moins un réacteur (37 sur 43 genres) étaient des espèces rares, chacune ayant une abondance relative inférieure à 2 % dans les bioréacteurs. En résumé, les cultures MBRA à flux continu ont soutenu des communautés microbiennes complexes et reproductibles dérivées du même échantillon de selles, même après des cultures par lots distinctes pendant 16 h dans chaque chambre du bioréacteur.

Figure 1 : Le réseau de minibioréacteurs (MBRA). MBRA entièrement assemblé, y compris les étiquettes pour l’arbre de tuyauterie des conduites d’alimentation et de déchets, les chambres du bioréacteur et la bande du bioréacteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Guide de gravure du PTFE et disposition des ports MBRA. (A) Organigramme à suivre pour la gravure des médias et des déchets de pailles en PTFE. (B) Chaque chambre de bioréacteur contient un orifice pour une paille de média + luer mâle fileté, une paille de déchets + luer mâle fileté, et un septum + luer mâle fileté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Arbres des lignes d’alimentation et de déchets MBRA. Images représentatives à suivre dans l’assemblage de (A) arbre de ligne d’alimentation et (B) arbre de ligne de déchets. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Bouchon de bouteille de support et système de niveau de déchets. (A) Un exemple de bouchon de bouteille assemblé de la série Q utilisé pour tirer les supports dans les MBRA. (B) Une image du système de collecte des déchets à plusieurs niveaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Abondance relative des genres bactériens. (A) Le graphique à barres empilées montre l’abondance relative de tous les genres qui comprennent au moins 2 % d’abondance dans l’un ou l’autre des échantillons présentés. (B) Métriques de diversité alpha des UTO observées et diversité de Shannon entre les neuf chambres de bioréacteur. Les neuf chambres du bioréacteur ont été inoculées avec la même boue fécale préparée à partir de selles humaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composantes de la MBRA. Des images et des descriptions de toutes les pièces individuelles nécessaires à l’assemblage complet du MBRA, ainsi que la quantité nécessaire pour chaque composant. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Guide de dépannage. Problèmes courants rencontrés lors de l’exécution du MBRA, ainsi que leurs causes potentielles et les solutions recommandées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Dossier supplémentaire 1 : Fichier STL pour l’impression 3D des bandes Minibioreactor Array. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Fichier STL pour l’impression 3D des supports de bioréacteur utilisés pour ancrer les bioréacteurs aux plaques d’agitation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3. : Fichier STL pour l’impression 3D des supports de tubes utilisés pour organiser les tubes de déchets et d’alimentation C-flex s’étendant des MBRA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole décrit l’assemblage complet et le fonctionnement de base d’un réseau de minibioréacteurs (MBRA) pour la culture à haut débit de communautés bactériennes, en incorporant plusieurs améliorations clés à la méthode précédemment publiée. Le système MBRA reste un outil polyvalent et rentable qui permet aux chercheurs de cultiver des écosystèmes microbiens complexes tout en soutenant de nombreuses répétitions expérimentales en parallèle. Dans cette version mise à jour, nous introduisons des améliorations qui améliorent la reproductibilité, rationalisent le flux de travail et réduisent le risque de contamination. Il s’agit notamment de pailles en PTFE gravées chimiquement (Figure 2) pour éviter le détachement, d’une paille d’alimentation sur la ligne de média (Figure 2) pour minimiser la formation de biofilm, de longueurs de tubes normalisées avec un support de tube imprimé en 3D (Fichier supplémentaire 3) pour une configuration plus compacte et organisée, et d’un protocole de réutilisation optimisé qui élimine le besoin de démontage complet entre les expériences. Ensemble, ces améliorations représentent des améliorations itératives développées grâce à une utilisation intensive du système MBRA dans diverses applications expérimentales dans notre laboratoire. En abordant à la fois les étapes d’assemblage critiques et les améliorations pratiques, cette discussion souligne l’utilité de la MBRA en tant que système modèle en constante évolution pour la recherche sur le microbiome.

Le succès du système MBRA repose en grande partie sur l’assemblage et la stérilisation précis des composants pour garantir un fonctionnement sans contamination. Les étapes clés comprennent le montage correct des capuchons, des tubes et des connecteurs de la série Q, qui facilitent l’assemblage modulaire et permettent l’entrée de fluides et la collecte des déchets. Il est essentiel d’assurer une étanchéité parfaite entre les bouteilles de fluide, les réservoirs de déchets et les chambres du bioréacteur pour prévenir les fuites et maintenir des conditions stériles. Une autre étape critique est la vérification des débits de pompe péristaltique avant l’expérimentation, car les incohérences peuvent entraîner une distribution inégale du milieu et affecter la dynamique de croissance microbienne. La plupart des pompes péristaltiques multicanaux qui utilisent des cassettes comprennent un mécanisme de réglage de l’occlusion, qui doit être utilisé pour affiner le débit de chaque canal. Même avec un étalonnage approprié, la tubulure E-lab reste une source principale de variabilité. Pour atténuer ce phénomène, il est important de surveiller visuellement la fréquence et la taille des gouttelettes de média entrant dans chaque chambre de bioréacteur pendant le remplissage initial et au début des expériences. Ces contrôles visuels permettent de détecter rapidement les incohérences de débit qui pourraient autrement compromettre la reproductibilité expérimentale. Le tableau 2 fournit des stratégies de dépannage pour les problèmes courants rencontrés lors de l’assemblage et de l’utilisation des MBRA. Ces étapes de dépannage garantissent la reproductibilité d’une expérience à l’autre et évitent les interruptions lors de la culture à long terme.

Malgré ses points forts, le système MBRA présente certaines limites qui doivent être prises en compte lors de la conception d’expériences. Contrairement aux systèmes plus avancés, le MBRA ne dispose pas de capacités de surveillance active, telles que les mesures de densité optique (DO) en temps réel, le contrôle du pH et la régulation de la température. Cette absence de mesure active limite la capacité du système à surveiller les changements dynamiques de la croissance microbienne et de l’activité métabolique en temps réel. De plus, bien que le système prenne en charge la culture anaérobie à l’intérieur des chambres, il n’inclut pas de contrôle intégré des gaz, ce qui peut limiter les applications nécessitant des environnements microaérophiles ou enrichis en CO₂ précis. Pour les études nécessitant un tel contrôle, d’autres systèmes avec régulation intégrée des gaz peuvent être plus appropriés.

Le système MBRA offre des avantages clés par rapport aux modèles de bioréacteurs existants, notamment un débit élevé, une évolutivité et une rentabilité, tout en conservant la capacité de cultiver des communautés bactériennes complexes sous flux continu pour imiter des environnements dynamiques comme le tractus gastro-intestinal humain ^6,8,10. Sa conception compacte et modulaire permet le fonctionnement simultané de plusieurs bioréacteurs, ce qui le rend idéal pour les études à haut débit telles que le criblage des communautés dérivées de matières fécales pour la résistance à l’invasion d’agents pathogènes⁹. Cette conception modulaire offre une grande flexibilité expérimentale : chaque bandelette peut être alimentée par une seule bouteille de milieu, comme démontré dans ce protocole, ou par un maximum de six sources de média distinctes, une pour chaque chambre de bioréacteur. Le volume de travail est régi par la longueur d’une fine paille de déchets en PTFE insérée dans l’orifice de déchets de chaque chambre, ce qui définit la hauteur du liquide ; dans ce protocole, les pailles de 25 mm maintiennent un volume de travail de 15 ml, mais des volumes compris entre 1 et 20 ml peuvent être obtenus en taillant ou en allongeant la paille. De plus, des pailles d’alimentation plus courtes sont insérées dans l’entrée du média pour diriger l’entrée vers la base de la chambre, empêchant ainsi le média de s’égoutter le long des parois de la chambre et réduisant la formation de biofilm au-dessus de la ligne de remplissage. La vitesse de la pompe ou le diamètre du tube de la pompe peuvent également être ajustés pour modifier le taux de rotation du système. À ce jour, le système MBRA a été largement utilisé pour étudier les changements fonctionnels et de composition des communautés microbiennes en réponse à une variété de facteurs, y compris les antibiotiques¹⁰, les médicaments anticancéreux¹⁴ et divers composés alimentaires 12,15,16,17 . Sa conception simple et modulaire le rend idéal pour s’adapter à divers besoins expérimentaux. Par exemple, le MBRA a été modifié pour étudier les biofilms dans des conditions similaires à celles du chimiostat18, démontrant ainsi sa polyvalence pour les études d’écologie microbienne au-delà des cultures planctoniques.

Les futures itérations du système MBRA pourraient bénéficier de mises à niveau techniques supplémentaires qui élargissent ses fonctionnalités, sa précision et son potentiel de débit. L’une de ces améliorations est l’incorporation de ports supplémentaires dans chaque chambre de bioréacteur. Ces ports pourraient être utilisés pour prendre en charge la surveillance active de paramètres environnementaux tels que le pH, la température, le gaz ou la densité optique. Cela permettrait de remédier à l’une des limites les plus importantes du modèle en permettant une rétroaction et une surveillance en temps réel. L’amélioration de la géométrie de la chambre ou de l’orifice pourrait faciliter un nettoyage plus approfondi et plus accessible, réduire l’accumulation de résidus et la décoloration et améliorer la réutilisation à long terme. L’intégration de pompes péristaltiques supplémentaires avec des minuteries programmables permettrait des entrées de milieux pulsés ou diurnes, simulant mieux les environnements associés à l’hôte tels que les cycles d’alimentation dans l’intestin humain. Enfin, l’impression 3D avec des matériaux alternatifs, tels que des polymères autoclavables résistants aux produits chimiques, peut permettre une plus grande durabilité et une compatibilité avec une plus large gamme de réactifs. Ensemble, ces améliorations pourraient élargir considérablement la portée expérimentale et la fidélité de la plateforme MBRA.

En conclusion, le MBRA fournit une plate-forme puissante et à haut débit pour la culture et l’étude des communautés microbiennes dans des conditions contrôlées. Bien qu’il présente des limites en matière de surveillance active et de contrôle du pH, sa flexibilité, son évolutivité et sa rentabilité en font un outil inestimable pour un large éventail d’études microbiologiques, en particulier celles nécessitant une réplicabilité et un débit expérimental élevés. Il est important de noter que la conception modulaire et l’approche de fabrication du système le rendent intrinsèquement adaptable. les chercheurs ont et peuvent continuer d’adapter le MBRA à un large éventail d’objectifs expérimentaux. Cette adaptabilité garantit que le MBRA peut continuer à évoluer aux côtés des questions et des technologies scientifiques émergentes, tout en maintenant sa pertinence en tant que plateforme polyvalente pour la recherche sur le microbiome.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
; Guide V-Tap, tailles standard 0-80 à 5/8"	Outils Big Gator	STD500NP
0,22 &mu ; Filtre à seringue M	Pêcheur	SLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 Entraînement d’agitation (entraînement uniquement)	2MAG	Référence MF 41060
Aiguilles hypodermiques Air-tite, 22G x3"	VWR	89219-274
BD 1mL Slip Tip Seringues stériles Stérile	Pêcheur	14-823-434
Bioréacteur	Proto-Labs	NA	Imprimé en 3D à partir de DMS Somos Watershed Plastic. Voir le fichier supplémentaire 1 pour le modèle
Supports de bioréacteur	Proto-Labs	NA	Imprimé en 3D en PA 12 Black. Voir le fichier supplémentaire 2 pour le modèle.
Diba Omnifit Q-Series Bouchon de bouteille de solvant, GL38/38-430 (verre), 2 ports UNF(F) sans vannes, bleu	Cole Parmer	EW-21942-86
Tube Diba Omnifit, PTFE, 1/8" (3,2 mm) OD x 1,5 mm ID	Cole Parmer	EW-21942-76
Adaptateur Dibafit, fond plat 1/4"-28 UNF(M) jusqu’à 3,2 mm ID, PEEK	Cole Parmer	EW-21941-49
IRWIN 12001ZR Clé à tarauder #0-1/4" Poignée en T	Amazone	B00004YOB0
Irwin Hanson Taraud à fraction SAE en acier à haute teneur en carbone 1/4 po. 1 pièce	Zoro	G7695682
Loctite Heavy Duty Epoxy Quick Set Bouteille de 8 onces liquides	Amazone	B0044F59N0
Connecteur Luer Lock mâle à mâle	Microfluidique Darwin	DM-MM-LUER-PP  ;	Alternative : Strategic Applications Inc Connecteur Luer mâle à mâle - 10/pk - Fisher - NC9876577
Raccords d’adaptation Masterflex, Luer à Luer, Nylon, Avantor	VWR	MFLX45502-56
Raccord Masterflex, nylon, droit, adaptateur femelle Luer vers tuyau cannelé, 1/16" ID	VWR	MFLX45502-00
Raccord Masterflex, nylon, droit, adaptateur Luer femelle vers tuyau cannelé, 3/32" ID	VWR	MFLX45502-02
Raccord Masterflex, nylon, droit, adaptateur femelle Luer à tuyau cannelé, 1/8"	VWR	MFLX45502-04
Raccord Masterflex, nylon, droit, adaptateur Luer Lock mâle vers tuyau cannelé, 1/8	VWR	MFLX45505-04
Raccord Masterflex, Nylon, Droit, Luer mâle x 1/4-28 UNF	VWR	MFLX45505-82
Raccord Masterflex, polypropylène, coudé, adaptateur Luer femelle vers Luer femelle	VWR	MFLX45508-26
Tube de pompe Masterflex Ismatec, 2 arrêts, Tygon S3 E-Lab, 0,89 mm ID	VWR	MFLX96460-26
Tube de pompe Masterflex Ismatec, 2 arrêts, Tygon S3 E-Lab, 1,14 mm ID	VWR	MFLX96460-30
Masterflex® ; Tube de transfert, C-Flex, blanc opaque, 1/8 » ID x 1/4 » OD ; 25 pieds	VWR	MFLX06424-67
Mohr' s Robinet de pince pour tube	VWR	470201-374
Rondelles d’aile en caoutchouc néoprène ½ ; ” OD x ¼ ; ” ID x 1/16 po Épaisseur  ;	Amazone	B01A29F1R0
Septa en caoutchouc d’étanchéité de précision	Sigma Aldrich	Z553905
Spinbar Micro Stir Bars	VWR	58948-375
Tétra-Gravure	Compagnie R.S. Hughest	TE-500
Porte-tube	Proto-Labs	NA	Imprimé en 3D en PA 12 Black. Voir le fichier supplémentaire 3 pour le modèle.
Pompe à cartouche multicanaux Watson-Marlow 205S	Watson-Marlow	Référence 020.3724.00A	Discountine, alternative : Pompes péristaltiques numériques Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 ou Pompe péristaltique Masterflex Ismatec IPC, 0,1 à 11,25 tr/min, 24 canaux, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH