Article de méthode

Production de microbulles stables recouvertes de phospholipides monodispersés à température ambiante à l’aide d’un dispositif de focalisation d’écoulement microfluidique

DOI :

10.3791/68796

⸱

10 octobre 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit une méthode de production de microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides à l’aide d’un dispositif de focalisation d’écoulement microfluidique à température ambiante, y compris la préparation de la formulation du revêtement de phospholipides.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microbulles monodispersées ont démontré un potentiel significatif dans l’amélioration de l’efficacité des agents de contraste à ultrasons pour l’imagerie et les applications thérapeutiques. Ces microbulles peuvent être produites directement à l’aide d’une méthode de focalisation par flux microfluidique, ce qui permet un contrôle précis de leur taille. Cependant, la prévention de la coalescence pendant la production reste un défi critique. Bien que des températures de production élevées (p. ex., 55 °C) puissent supprimer la coalescence, de telles conditions compliquent la conception des dispositifs microfluidiques et peuvent être incompatibles avec les agents de ciblage et les conjugués de médicaments. Ce protocole décrit une méthode pour produire des microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides à température ambiante, la stabilité et la monodispersité des microbulles étant maintenues pendant au moins 7 jours. Le protocole décrit également la fabrication de puces microfluidiques PDMS réutilisables et la préparation de la formulation de revêtement de phospholipides contenant le tensioactif Pluronic F68. Nos résultats montrent que les microbulles produites à l’aide de cette méthode conservent leur taille et leur stabilité pendant 7 jours, ce qui soutient leur applicabilité future dans des contextes cliniques où des agents de contraste à ultrasons stables et contrôlables sont essentiels.

Introduction

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Les agents de contraste à ultrasons (UCA) sont largement utilisés dans l’échographie clinique et les applications thérapeutiques 1,2,3. Administrées par voie intraveineuse, ces microbulles restent confinées dans le système vasculaire, agissant comme des agents de pool sanguin 4,5. Une coquille stabilisatrice recouvre les microbulles et réduit la diffusion de gaz entraînée par la pression de Laplace, prolongeant ainsi la durée de vie de la microbulle 3,6. Lorsqu’elles sont exposées aux ultrasons, les microbulles commencent à osciller et à produire de forts échos en raison de la compressibilité du noyau de gaz 7,8. L’oscillation est plus prononcée à la fréquence de résonance de la microbulle, qui est influencée par la taille de la microbulle et les propriétés de la coquille 9,10,11. Les UCA cliniquement approuvées sont généralement constituées de microbulles polydispersées avec une large distribution de taille, allant généralement d’environ 0,5 à 10 μm de diamètre12, 13, 14. Cette large distribution de taille conduit à une large gamme de fréquences auxquelles ces microbulles sont en résonance. Étant donné que les sondes d’échographie cliniques fonctionnent généralement dans une bande passante de fréquence étroite, seul un sous-ensemble de la population UCA résonne efficacement15. Il a été démontré que les microbulles monodispersées, qui ont une distribution de taille étroite (par exemple, PDI 3 ~ 10 %16,17), augmentent le diagnostic et le traitement par rapport aux microbulles polydispersées. Pour l’imagerie par ultrasons avec produit de contraste, l’intensité a augmenté de deux à trois ordres de grandeur18, tandis que la sensibilité pour la détection de pression non invasive par des signaux sous-harmoniques a presque doublé 19,20,21, et l’efficacité de l’administration du médicament a été augmentée de près d’un ordre de grandeur 22. Par conséquent, la production de microbulles monodispersées avec une distribution de taille étroite et donc une réponse acoustique est essentielle pour maximiser leur potentiel pour l’imagerie par ultrasons et les applications thérapeutiques, où les oscillations contrôlées des microbulles sont essentielles.

Les microbulles monodispersées peuvent être produites par diverses méthodes, telles que la décantation23 , la filtration mécanique24 et la centrifugation d’un agent microbulle polydispersé25. Cependant, l’obtention d’un contrôle précis de la taille et d’une monodispersité élevée reste un défi avec ces techniques26. Une approche alternative et plus contrôlée est la production directe de microbulles monodispersées à l’aide d’un dispositif de focalisation par flux microfluidique. Dans ce processus, un fil de gaz est focalisé entre deux flux de liposomes aqueux sur une puce microfluidique, ce qui permet un pincement reproductible du fil de gaz, ce qui permet une production à grande vitesse de microbulles monodispersées à la taille souhaitéede 27. Bien que les méthodes de focalisation par flux aient été largement utilisées pour produire des gouttelettes monodispersées28,29, leur application dans la production de microbulles monodispersées est moins courante en raison de la difficulté d’empêcher la coalescence et de maintenir correctement la stabilité à long terme en termes de taille, de monodispersité et de concentration30. La coalescence, où plusieurs microbulles fusionnent en plus grandes, a un impact sur la monodispersité. Il a été démontré que des températures de production élevées réduisent la coalescence31, mais cela complique la conception du système microfluidique et peut ne pas convenir aux formulations impliquant des agents de ciblage ou des conjugués de médicaments. Par conséquent, la production de microbulles monodispersées à température ambiante serait avantageuse. La méthode de stockage de ces microbulles monodispersées est tout aussi importante, car les microbulles recouvertes de phospholipides ont tendance à rétrécir, à s’effondrer et à perdre leur monodispersité au fil du temps32. Assurer une stabilité à long terme, sur plusieurs jours, pendant le stockage est essentiel pour traduire la technologie des microbulles monodispersées dans les applications cliniques.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de production de microbulles monodispersées enrobées de phospholipides à l’aide d’une plateforme microfluidique à focalisation en flux à température ambiante. Cette méthode est compatible avec des débits de lipides allant de 13 à 42 μL/min et est conçue pour être utilisée à température ambiante, ce qui la rend adaptée aux laboratoires ne disposant pas de contrôle de la température sur leur système microfluidique. Le protocole utilise une formulation phospholipidique composée de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol] (DPPE-PEG5000), qui garantit la stabilité et la reproductibilité. Le protocole fournit des instructions étape par étape sur la fabrication de puces microfluidiques PDMS réutilisables, la préparation des solutions de revêtement de phospholipides et l’incorporation du tensioactif Pluronic F68 pour empêcher la coalescence des microbulles pendant la production à température ambiante. Il détaille également les procédures de nettoyage du système microfluidique pour éviter le colmatage des buses, l’ajustement de la pression du gaz et du débit de liquide pour contrôler la taille des microbulles, et la collecte et le stockage des microbulles produites pour une stabilité à long terme. Cette méthode offre une approche pratique pour générer des microbulles monodispersées stables avec un contrôle précis de la taille à température ambiante.

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Protocole

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1. Fabrication de films lipidiques

REMARQUE : Le mélange lipidique pour la production de microbulles monodispersées est formulé avec un mélange binaire de DSPC et de DPPE-PEG5000 à un rapport molaire de 90:10. Le DSPC a été choisi comme lipide principal car il a été démontré qu’il offre une stabilité supérieure contre la dissolution des gaz dans les microbulles polydispersées33,34 et monodispersées31. On suppose que cette stabilité accrue résulte de sa température de transition de phase cristalline gel-liquide relativement élevée de 55 °C35, ce qui est supérieur à celui d’autres lipides couramment utilisés tels que le DPPC (~41 °C)35, conduisant ainsi à une coquille lipidique plus rigide et imperméable à température ambiante36. Ici, un exemple de préparation d’une solution d’enrobage de phospholipides de 3 mL est présenté. Pour atteindre une concentration finale de phospholipides de 20 mg/mL, qui est une concentration typique pour produire des microbulles monodispersées,16,17, 60 mg de phospholipides sont nécessaires. La quantité souhaitée de chaque composant phospholipidique est indiquée dans le tableau 1.

  1. Sortez la poudre de phospholipides du congélateur à -20 °C et laissez-la décongeler à température ambiante pendant 1 h.
  2. Pesez la poudre lipidique nécessaire dans des fioles jaugées séparées de 2 ml.
  3. Préparez 100 mL d’un mélange 90:10 v/v de solvant chloroforme :méthanol dans une hotte en mesurant 90 mL de chloroforme à l’aide d’un cylindre doseur en verre de 100 mL, puis en transférant le tout dans un Erlenmeyer en verre de 250 mL. Mesurez ensuite 10 ml de méthanol à l’aide du cylindre doseur en verre de 100 ml et versez-le dans l’erlenmeyer en verre de 250 ml qui contient déjà le chloroforme. Fermez l’Erlenmeyer en verre à l’aide d’un bouchon en verre et mélangez les deux solvants en agitant doucement l’Erlenmeyer jusqu’à ce que la solution soit devenue claire.
    ATTENTION : Le chloroforme et le méthanol sont des produits chimiques toxiques. Le chloroforme est un cancérogène potentiel et peut provoquer une irritation des voies respiratoires, de la peau et des yeux. Le méthanol est hautement inflammable, toxique s’il est inhalé, ingéré ou absorbé par la peau, et peut provoquer la cécité s’il est ingéré. Travaillez toujours avec des mélanges de chloroforme/méthanol dans une hotte bien ventilée pour éviter l’inhalation de fumées. Portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire. Assurez-vous qu’il n’y a pas de flammes nues ou de sources d’inflammation lors de la manipulation du méthanol. Éliminer les déchets de solvants conformément aux protocoles de l’établissement en matière de déchets dangereux.
  4. Pour dissoudre complètement les poudres lipidiques pesées à l’étape 1.2, ajoutez mL du mélange chloroforme/méthanol dans chaque fiole jaugée en verre de 2 mL et fermez rapidement le couvercle en verre pour éviter l’évaporation.
    REMARQUE : Assurez-vous que la poudre lipidique est complètement dissoute. Si nécessaire, agitez doucement le ballon pour faciliter la dissolution.
  5. Mélangez les solutions lipidiques dissoutes dans un flacon en verre de 30 mL en versant chaque solution séquentiellement.
  6. Évaporez le solvant sous un flux constant de gaz argon, en tournant le flacon pour assurer une distribution uniforme du film lipidique sur la surface du verre.
    REMARQUE : Les traces finales de solvant peuvent être difficiles à évaporer en utilisant uniquement le gaz argon. Laissez le flacon dans la hotte pendant 2 h pour permettre un séchage supplémentaire. En l’absence de gaz argon, on peut utiliser de l’azotegazeux 37 ou un évaporateur rotatif sous vide fonctionnant à 6 °C31,38 (c’est-à-dire au-dessus de la température de transition de phase du DSPC de 55 °C35) pour évaporer le solvant chloroforme/méthanol.
  7. Après l’évaporation du solvant, soumettez le mélange lipidique sous vide pour éliminer tout résidu de solvant organique restant. Scellez le flacon en verre avec une couche de parafilm et percez plusieurs trous avec une aiguille pour permettre à l’air de circuler pendant le vide.
    REMARQUE : Le but de l’utilisation du parafilm est d’empêcher les lipides de se disperser hors du flacon en verre pendant le processus de lyophilisation.
  8. Placez les flacons dans un lyophilisateur sous vide pendant la nuit pour éliminer tout solvant organique résiduel.
  9. Passez à l’étape suivante ou conservez le film lipidique à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    REMARQUE : Aucune étape de centrifugation n’est utilisée dans cette section ou ailleurs dans le protocole.

2. Fabrication de puces microfluidiques à focalisation par flux

REMARQUE : Les microbulles monodispersées sont produites à l’aide d’une puce microfluidique à focalisation en flux, comme illustré à la figure 1A. Un schéma de la géométrie du canal microfluidique, y compris les dimensions de la buse et de la sortie, est fourni dans la figure supplémentaire S1. Un protocole de fabrication détaillé pour la photolithographie basée sur SU-8 utilisée pour préparer ces moules a été décrit précédemment37 et peut être trouvé en tant qu’information supplémentaire à ce protocole. Le processus de fabrication de la puce PDMS est décrit dans les étapes suivantes.

  1. Mélangez la base PDMS (23,3 g) et l’agent de durcissement (2,3 g) dans un rapport poids de 10:1 pour obtenir un total de 25,5 g de PDMS.
  2. Placez le moule maître dans une boîte de Pétri et versez le mélange PDMS dessus.
  3. Dégazez le mélange sous vide (2 ~ 7 mbar) pendant 40 min pour éliminer les bulles d’air emprisonnées.
    REMARQUE : Pour des volumes plus importants, un temps de dégazage plus long peut être nécessaire pour assurer l’élimination complète des bulles.
  4. Placez le moule sur une plaque chauffante à 75 °C pendant 1 h.
    REMARQUE : Pour des volumes plus importants, un temps de durcissement plus long peut être nécessaire.
  5. Laissez le PDMS refroidir à température ambiante. À l’aide d’un scalpel, coupez soigneusement autour du PDMS durci et décollez-le pour libérer la puce.
  6. Coupez la puce PDMS à la taille souhaitée et percez les trous d’entrée/sortie à l’aide d’un poinçon de 1 mm.
  7. Nettoyez la puce PDMS avec du ruban adhésif pour enlever les particules de poussière.
  8. Nettoyez la puce PDMS et la lame de verre avec de l’isopropanol, puis de l’eau désionisée.
  9. Collez les PDMS à la lame de verre en les traitant dans un purificateur plasma à air pendant 1 min à 60 % de puissance (60 W).
  10. Placez la puce collée sur une plaque chauffante à 95 °C pendant 3 min pour améliorer la liaison.
  11. Laissez la puce PDMS refroidir à température ambiante. La puce entièrement fabriquée est illustrée à la figure 1C, et une image microscopique en champ clair de la tuyère est illustrée à la figure 1D.
  12. Placez la puce collée dans le nettoyeur plasma pendant 5 min à 80 % de puissance (80 W) pour restaurer l’hydrophilie de surface du canal microfluidique.
  13. Remplissez immédiatement la puce d’eau Milli-Q pour préserver l’hydrophilie.
  14. Conservez les chips à température ambiante dans de l’eau Milli-Q jusqu’à utilisation.

3. Préparation de la solution d’enrobage de phospholipides

  1. Sortez le film lipidique préparé du congélateur à -20 °C et décongelez-le à température ambiante pendant 1 h.
  2. Ajouter 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée (55 °C) au film lipidique (60 mg) pour atteindre une concentration finale de lipides de 20 mg/mL. Placez les flacons dans un bain-marie à 55 °C pendant 40 min, en tourbillonnant toutes les 15 min à vitesse moyenne (niveau 3 sur 5 sur le mélangeur vortex).
    REMARQUE : Cette étape sert à pré-dissoudre et à disperser uniformément les composants lipidiques dans le PBS avant la sonication à l’étape 3.5. Cette température est la température de transition de phase du DSPC39, favorisant la solubilisation partielle et réduisant l’agrégation des lipides. Bien que la sonication à l’étape 3.6 soit nécessaire pour obtenir une clarté optique complète, l’incubation thermique préliminaire facilite une sonication plus efficace et reproductible en minimisant la formation de gros agrégats lipidiques et en améliorant l’homogénéité de la dispersion.
  3. Ajouter 0,43 mL de solution de Pluronic F68 au mélange de lipides pour atteindre une concentration molaire de 10 %, à savoir, DSPC : DPPE-PEG5000 : Pluronic F68 = 81 : 9 : 10 % molaire. Ensuite, l’échantillon doit ressembler visuellement à la figure 2A, qui est une solution trouble.
    REMARQUE : Pluronic F68 est un tensioactif utilisé pour empêcher la coalescence lors de la production de microbulles monodispersées16,40. En l’absence de Pluronic F68, il est impossible de former des microbulles monodispersées à l’aide du dispositif microfluidique Horizon37et de la formulation lipidique décrite dans le présent protocole16. Aucun propylène glycol n’a été utilisé dans la formulation lipidique, car il a été signalé que ce composé compromettait à la fois la monodispersité et la stabilité de la suspension de microbulles monodispersées résultante38.
  4. Pour la préparation de microbulles monodispersées marquées par fluorescence, incorporez un colorant lipidique, tel qu’un colorant carbocyanine lipophile, dans le mélange à ce stade.
  5. Sonicer le mélange lipidique dans un bain-marie à 100 % de puissance pendant 20 min, en maintenant la température de l’eau à 55 °C. La solution lipidique doit ressembler à la figure 2B après 20 min, qui est une solution moins trouble qu’à l’étape 3.4. Continuez la sonication à intervalles de 10 minutes jusqu’à ce que la solution soit claire, comme le montre la figure 2C.
    REMARQUE : Pour la solution de la figure 2C, 30 min de sonication ont été nécessaires pour obtenir une solution claire. La caractérisation de la solution lipidique peut être réalisée en mesurant la taille du liposome à l’aide, par exemple, d’un diffuseur de lumière dynamique.
  6. Laissez la solution lipidique refroidir à température ambiante avant de poursuivre le traitement.

4. Préparation du flacon de collecte de microbulles

REMARQUE : Pour assurer le stockage à long terme des microbulles monodispersées, un flacon médical étanche au gaz est nécessaire comme flacon de collecte.

  1. Scellez un flacon médical en verre de 5 ml avec un bouchon en caoutchouc et remplissez le flacon de gaz C4F10 . Par la suite, sertissez un bouchon en aluminium autour du flacon pour assurer l’étanchéité au gaz. Le flacon de prélèvement est maintenant prêt à l’emploi.

5. Préparation de la plateforme microfluidique

REMARQUE : Comme illustré à la figure 3A, le système comprend la plate-forme microfluidique Horizon37 (ci-après dénommée « plate-forme microfluidique »), un ordinateur pour le contrôle, une caméra à grande vitesse pour la surveillance du processus de production, une source lumineuse externe à diodes électroluminescentes (LED) pour l’éclairage pendant l’imagerie à grande vitesse et un générateur de formes d’onde fonctionnelle pour déclencher l’imagerie à grande vitesse à des intervalles spécifiques pendant la production. Avant de commencer la production de microbulles, l’appareil doit être nettoyé pour réduire le risque de colmatage de la buse. La procédure de nettoyage implique à la fois le tube et la puce microfluidique.

  1. Procédure de nettoyage des tubes
    1. Allumez l’interrupteur d’alimentation de la plate-forme microfluidique, qui se trouve sur le côté droit (Figure 3A).
      REMARQUE : Le « commutateur d’alimentation » fait référence à l’unité de contrôle d’alimentation principale de la plate-forme Horizon, qui active le microcontrôleur interne, les pompes et les capteurs du système.
    2. Placez un flacon en verre de 4 mL rempli d’éthanol à 70 % dans le côté gauche de la chambre de la pompe P de la plateforme microfluidique (figure 3). Démarrez le débit de liquide à 100 μL/min afin que le tube d’entrée de liquide soit rincé avec l’éthanol à 70 % du flacon. Arrêtez le rinçage en arrêtant l’écoulement du liquide au bout de 5 min.
      REMARQUE : La pompe P fait référence à l’unité de distribution de gaz à pression contrôlée intégrée dans le système microfluidique. Cette étape a pour but de nettoyer le tube seulement ; Le tube ne doit pas être connecté à la puce microfluidique à ce stade. Ce processus élimine les poussières et les contaminants solubles dans l’éthanol du système fluidique.
    3. Remplacez le flacon rempli d’éthanol par un flacon rempli d’eau Milli-Q.
    4. Rincez le tube avec de l’eau Milli-Q à 100 μL/min pendant 5 min pour éliminer tout résidu d’éthanol du système.
  2. Procédure de nettoyage des copeaux
    1. Allumez l’interrupteur d’éclairage LED interne de la plate-forme microfluidique.
    2. Insérez la puce PDMS dans le support.
    3. Positionnez le collecteur sur la puce et fixez-le à l’aide de la molette réglable.
    4. Fixez le tube de gaz, de liquide et de sortie à la puce PDMS à l’aide d’une pince à épiler. La configuration de la connexion est illustrée à la figure 3B. Assurez-vous que le tube de sortie mène à un flacon pour recueillir la solution résiduelle du processus de nettoyage.
    5. Ajustez la plate-forme pour positionner la buse de la puce dans le champ de vision de l’objectif.
    6. Nettoyez la puce avec de l’eau Milli-Q pendant 5 min en utilisant une pression de gaz de 1000 mbar et un débit de liquide de 100 μL/min. Démarrez d’abord le flux de gaz, puis poursuivez avec le flux de liquide.
      REMARQUE : Cette étape consiste à nettoyer la puce microfluidique en amont de la buse.
    7. Arrêtez l’écoulement du liquide, suivi du flux de gaz.
    8. Rebranchez le tuyau de gaz et de sortie comme illustré à la Figure 3C.
    9. Répétez la procédure de lavage avec de l’eau Milli-Q pendant encore 5 min, en utilisant une pression de gaz de 1000 mbar et un débit de liquide de 50 μL/min. Démarrez d’abord le flux de gaz, puis poursuivez avec le flux de liquide.
      REMARQUE : Cette configuration nettoie la puce microfluidique en aval de la buse.
    10. Arrêtez l’écoulement du liquide, suivi du flux de gaz. La puce PDMS est maintenant prête pour la production de microbulles.

6. Configuration de l’imagerie à grande vitesse

REMARQUE : Pour surveiller et contrôler la production de microbulles monodispersées, il est recommandé d’intégrer une caméra à haute vitesse à la plate-forme microfluidique, car la microbulle sera produite à un taux de production supérieur à 105 microbulles / s. La caméra à grande vitesse permet de mesurer la taille des microbulles sur puce et le taux de production, ainsi que de surveiller la coalescence des microbulles sur puce.

  1. Montez une source lumineuse LED au-dessus de la plate-forme de montage (Figure 3A) pour éclairer la puce microfluidique pendant l’imagerie à grande vitesse.
  2. Couplez la caméra haute vitesse au port d’imagerie latéral de la plate-forme microfluidique.
  3. Utilisez un générateur de formes d’onde à fonction externe pour déclencher des enregistrements à grande vitesse à des intervalles de 10 secondes pendant toute la durée de la production de microbulles. Connectez la sortie de déclenchement TTL du générateur de formes d’onde à l’entrée de déclenchement externe de la caméra haute vitesse à l’aide d’un câble BNC standard pour assurer une acquisition synchronisée. Cette surveillance est nécessaire pour évaluer la forme du fil de gaz et la stabilité granulométrique des microbulles pendant la production.
    REMARQUE : Une surveillance continue est importante, car un colmatage peut se produire pendant la production. De plus, les séquences d’images à grande vitesse sont utilisées pour extraire des distributions de taille de microbulles sur puce résolues en temps. Cet intervalle de 10 s peut être ajusté en fonction des besoins de l’utilisateur.

7. Production et caractérisation de microbulles monodispersées

  1. Avant de commencer la production, installez le flacon collecteur comme illustré à la figure 4A. Percez une aiguille à travers le bouchon en caoutchouc pour servir d’aiguille collectrice, et une autre aiguille à travers le bouchon comme aiguille de ventilation, avec la pointe de l’aiguille positionnée près du fond du flacon. Maintenez le flacon collecteur inversé à l’aide d’une pince pendant la production.
    REMARQUE : L’aiguille de ventilation assure une pression constante à l’intérieur du flacon pendant le prélèvement. Comme C4F10 est plus lourd que l’air, il ne sort pas spontanément du flacon.
  2. Chargez la solution de phospholipides préparée dans la pompe P de la plate-forme microfluidique.
  3. Déplacez la partie buse de la puce dans le champ de vision de l’objectif.
    REMARQUE : La plate-forme microfluidique comprend un module optique interne avec zoom et mise au point réglables, ainsi qu’un coupleur externe à monture F pour la fixation d’une caméra haute vitesse.
  4. Pour lancer la production de microbulles, réglez la pression du gaz à 800 mbar et le débit du liquide à 40 μL/min.
    REMARQUE : La plate-forme microfluidique intègre deux canaux de liquide à débit contrôlé, 1-5 μL/min à gauche et 1-100 μL/min à droite, et un canal de gaz à pression contrôlée. Dans ce protocole, le canal liquide de 1-100 μL/min et le canal de gaz à pression contrôlée ont été utilisés.
  5. Une fois que le liquide atteint la buse, le fil de gaz se pince et libère des microbulles monodispersées par la sortie (Figure 4A).
  6. Réglez l’enregistrement haute vitesse sur une fréquence d’images de ≥ 200 000 ips et utilisez des enregistrements haute vitesse pour mesurer la taille des microbulles produites via la fonction imfindcircles dans MATLAB.
  7. Ajustez la pression du gaz et le débit de liquide pour contrôler la taille des microbulles.
    REMARQUE : après avoir ajusté le débit et/ou la pression du gaz, utilisez le script MATLAB pour tracer la distribution de taille sur puce à partir de l’enregistrement haute vitesse. En ajustant la distribution granulométrique à l’aide d’une distribution gaussienne, il est possible de déduire la μ moyenne et l’écart-type σ . Le μ représente la taille sur puce des microbulles monodispersées produites. La coalescence des microbulles peut se produire au stade initial de la production en raison de l’eau résiduelle Milli-Q dans le tube, ce qui dilue la concentration de lipides. Ce problème se résout généralement une fois que la solution lipidique non diluée atteint la buse. Le tableau 2 résume les diamètres de microbulles résultants pour plusieurs débits appliqués à une pression de gaz constante de 800 mbar ; Diverses combinaisons de pression de gaz et de débit de liquide peuvent produire des microbulles de tailles similaires, bien que différentes combinaisons de paramètres influencent également le taux de production. À débit de gaz constant, on sait que le taux de production est positivement corrélé aux débits de liquide41. Le taux de production de microbulles dans ce protocole est de l’ordre de ~105 microbulles par seconde, sur la base d’une analyse image par image des enregistrements à grande vitesse, ce qui est cohérent avec les valeurs précédemment rapportées pour des géométries de focalisation d’écoulement similaires37.
  8. Une fois que la taille de microbulle souhaitée est atteinte, collectez les microbulles produites en connectant le tube de sortie au flacon collecteur.
  9. Pendant la collecte, réglez l’enregistrement à grande vitesse pour qu’il se déclenche toutes les 10 s afin de surveiller le processus de production.
    REMARQUE : L’intervalle entre les enregistrements peut être ajusté en fonction des besoins spécifiques.
  10. Une fois qu’une quantité suffisante de suspension de microbulles a été recueillie, retirez l’aiguille de ventilation et l’aiguille de collecte du flacon collecteur.
  11. Arrêtez l’écoulement du liquide, suivi du flux de gaz.
  12. Conservez les microbulles collectées à la verticale à température ambiante, en veillant à ce que le flacon soit légèrement agité mécaniquement.
    REMARQUE : La solution de microbulles aura trois couches comme illustré à la figure 5A : une couche de mousse, une couche de microbulles monodispersées et un subnatant. Il est préférable de laisser la couche de mousse dans le flacon, car des études antérieures ont rapporté que les bulles associées à la mousse peuvent progressivement rétrécir jusqu’à une taille monodispersée16,38. Les microbulles produites à l’aide de ce protocole n’ont pas fait l’objet d’une évaluation réglementaire de l’innocuité. Cependant, les lipides constitutifs (DSPC, DPPE-PEG5000) et le tensioactif (Pluronic F68) sont couramment utilisés dans les formulations injectables approuvées par la FDA et sont considérés comme biocompatibles42,43. Une évaluation préclinique plus poussée est nécessaire pour établir l’innocuité à des fins médicales.
  13. 2 h après la production (c’est-à-dire 2 h après la production des microbulles monodispersées), caractériser la taille finale et la concentration des microbulles à l’aide d’une machine de caractérisation des particules.
    REMARQUE : Les microbulles monodispersées produites par la méthode de focalisation par écoulement nécessitent environ 90 minutes pour se stabiliser jusqu’à leur taille finalede 44. Par conséquent, il est recommandé de laisser au moins 2 h de stabilisation avant d’utiliser les microbulles.
  14. Fixez une aiguille de 19 G à une seringue d’un ml, ci-après dénommée « seringue d’extraction ».
  15. Insérez une aiguille séparée de 19 g dans le flacon à microbulles comme aiguille de ventilation. Assurez-vous que la pointe de l’aiguille reste près du haut du flacon pour permettre l’entrée d’air et maintenir la pression interne pendant l’extraction des microbulles.
  16. Agitez doucement le flacon pour homogénéiser la suspension. La suspension se séparera en trois couches : une couche supérieure de mousse, une couche intermédiaire contenant des microbulles monodispersées et une couche aqueuse inférieure.
  17. Insérez rapidement la seringue d’extraction et positionnez soigneusement la pointe de l’aiguille au milieu de la couche de microbulles monodispersées, en évitant la mousse et la couche aqueuse inférieure de sous-nageant. Prélever le volume souhaité de suspension de microbulles et retirer la seringue d’extraction du flacon. Lorsque l’extraction des microbulles est terminée, retirez l’aiguille de ventilation.

8. Procédure de nettoyage et d’arrêt

REMARQUE : Après la production de microbulles, la plate-forme microfluidique et la puce doivent être soigneusement nettoyées pour assurer leur bon fonctionnement et permettre la réutilisation de la puce. Les étapes suivantes décrivent le processus de nettoyage.

  1. Pour la puce, procédez comme suit :
    1. Remplacez le flacon lipidique par un flacon d’eau Milli-Q.
    2. Rincez la puce microfluidique en utilisant une pression de gaz de 800 mbar et un débit de liquide de 40 μL/min pendant 5 min.
    3. Arrêtez d’abord le flux de liquide, puis arrêtez le flux de gaz.
    4. Débranchez uniquement le tube d’entrée de gaz de la puce microfluidique.
    5. Remplissez la puce microfluidique avec de l’eau Milli-Q pour maintenir l’hydrophilie des surfaces internes.
    6. Arrêtez l’écoulement du liquide et débranchez tous les tubes restants de la puce.
    7. Conservez la puce dans de l’eau Milli-Q jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire pour une utilisation future.
  2. Pour le système microfluidique, procédez comme suit :
    1. Remplacez le flacon d’eau Milli-Q par un flacon d’éthanol à 70 % dans la plateforme microfluidique.
    2. Rincer la tubulure d’entrée de liquide avec de l’éthanol à 70 % à un débit de 100 μL/min pendant 5 min pour éliminer tout résidu de lipides.
    3. Remplacez le flacon d’éthanol par un flacon d’eau Milli-Q dans P-Pump1.
    4. Rincez le tube avec de l’eau Milli-Q à 100 μL/min pendant 5 min pour éliminer tout résidu d’éthanol du système. Le système est maintenant propre.
    5. Arrêt de la plate-forme microfluidique et du système de caméra à grande vitesse.

9. Étapes de dépannage

  1. Blocage de la buse
    REMARQUE : Compte tenu de la petite taille de la buse (5 μm), des blocages peuvent se produire pendant le processus de production. Pour éliminer le blocage, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Arrêtez immédiatement l’écoulement du liquide, suivi du flux de gaz.
    2. Rebranchez le tube conformément à la configuration illustrée à la Figure 3B.
    3. Remplacez le flacon rempli de phospholipides par un flacon rempli d’eau Milli-Q dans P-Pump1.
    4. Appliquez une pression de gaz de 1000 mbar et réglez le débit de liquide à 100 μL/min pendant 5 min pour rincer la buse.
      REMARQUE : Dans la plupart des cas, les blocages sont éliminés après un rinçage de 5 minutes. Cependant, si le blocage persiste, il peut être nécessaire de remplacer la puce PDMS par une nouvelle.
    5. Une fois l’obstruction éliminée, rebranchez le tube comme indiqué à la figure 3C.
    6. Rincez à nouveau la puce avec de l’eau Milli-Q pendant 5 min, en utilisant une pression de gaz de 1000 mbar et un débit de liquide de 50 μL/min pour assurer un dégagement complet.
    7. Remplacez le flacon rempli d’eau Milli-Q par le flacon rempli de phospholipides dans P-Pump1 et reprenez la production de microbulles.
      REMARQUE : Si des blocages persistent pendant la production, cela peut indiquer un nettoyage insuffisant du tube ou de la puce microfluidique. Dans ce cas, débranchez le tube de la puce et suivez la procédure de nettoyage décrite à l’étape 5. Si des blocages continuent de se produire après un nettoyage minutieux de l’ensemble du système, cela pourrait suggérer une défaillance du filtre interne de la plate-forme microfluidique. Le remplacement du filtre par un nouveau peut résoudre le problème.
  2. Réutilisez la puce microfluidique si vous le souhaitez.
    REMARQUE : Si la puce n’est pas stockée correctement, elle peut perdre son hydrophilie. Si cela se produit, le pincement du filetage de gaz peut ressembler au motif illustré à la figure 5E. Dans ce cas, il est recommandé de passer à une nouvelle puce hydrophile pour assurer une production de microbulles constante et fiable.

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Résultats

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Dans ce protocole, nous présentons une méthode pour produire des microbulles stables et monodispersées à température ambiante à l’aide d’une puce microfluidique à focalisation sur flux. La puce PDMS est fabriquée par moulage à partir d’un moule maître, comme le montre la figure 1. Pour lier la puce PDMS à une lame de verre, un traitement au plasma est utilisé. Le traitement au plasma est crucial car il modifie la surface du PDMS d’hydrophobe à hydrophile. Cette hydrophilie est essentielle po...

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Discussion

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Ce protocole décrit en détail comment produire et stocker des microbulles monodispersées stables à température ambiante à l’aide d’une puce de focalisation de flux microfluidique. La microbulle monodispersée peut être utilisée pour l’imagerie par ultrasons avec contraste18, la détection de pression non invasive19 et l’administration de médicaments médiée par des microbulles22, à la fois in vitro et in vi...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été financé en partie par le Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (accord de subvention 805308) et en partie par le TTW Applied and Engineering Sciences (VIDI-project 17543), qui fait partie de NWO, tous deux attribués à K.K. La plateforme microfluidique Horizon a été développée grâce au financement de subventions de l’EPSRC (subventions n° EP/I000623 et EP/K023845). Les auteurs remercient le Microbubble Consortium (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) de l’Université de Leeds pour les discussions utiles, ainsi que Stuart Weston et Andrew Price pour leur aide dans la conceptualisation de l’instrument et la production de pièces pour la plate-forme microfluidique Horizon. Le moule maître pour la fabrication des puces PDMS a été aimablement fourni par l’Université de Leeds. Les auteurs remercient Robert Beurskens du Département de génie biomédical, Département de cardiologie, et Geert Springeling du Département d’instrumentation médicale expérimentale, tous deux du MC Erasmus, aux Pays-Bas, pour leur assistance technique pendant les expériences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poinçon de biopsie de 1 mm  ;Kai Médical143831
1,1'-Dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD)Thermo Fisher ScienticD307un colorant lipophile à base de carbocyanine
1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol] (DPPE-PEG5000)LipoïdeN° CAS 384835-61-4
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC)LipoïdeN° CAS 816-94-4
Cylindre doseur en verre de 100 mLBLAUBRAND
Fioles jaugées en verre de 2 mLBLAUBRAND
Erlenmeyer en verre de 250 mLBLAUBRAND
Flacon en verre de 30 mLDWK Sciences de la vieSCERC40752700D0C2
70 % d’éthanol
75 ° ; Plaque chauffante C  ;
Ruban adhésif
Capuchon en aluminium  ;Sigma-aldrich27016
Gaz argon  ; Linde Gas Benelux
C4F10 gazProduits chimiques F2
ChloroformeMerck KGaA67-66-3
Cliniquement disponible  ; agent de contraste à ultrasons (c.-à-d. microbulles)Bracco,
Plan-LesOuates, Suisse		SonoVueGraphique 6A.
Aiguille de collecte et de ventilation 19G100 Stérilisant4657799
Compteur de socs Multisizer 3Beckman CoulterMachine de caractérisation des particules
Produit de contraste à ultrasons sur mesure (c.-à-d. microbulle monodispersée)NAF1-10PFGraphique 6A. Produit tel que décrit par : Wang, Y. et al. Influence de Pluronic F68 sur la stabilité granulométrique et le comportement acoustique de microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides produites à température ambiante. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976&minus ;8986. (2025).
Produit de contraste à ultrasons sur mesure (c.-à-d. microbulle monodispersée)NAF2-10 PFGraphique 6A. Produit tel que décrit par : Wang, Y. et al. Influence de Pluronic F68 sur la stabilité granulométrique et le comportement acoustique de microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides produites à température ambiante. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976&minus ;8986. (2025).
Demi-eau
Lumière LED externeGSVITECGS02370
LyophilisateurMertin Christ GmbHAlpha 1&ndash ; 2 LD plus
Générateur de formes d’onde de fonction  ;AgilentRéférence 33220A
Flacon en verre étanche au gazSigma-aldrichZ113964-288EA
Toboggan en verreVWR631-1552
Caméra haute vitessePhotronNova S16
Plateforme microfluidique HorizonUniversité de Leeds, AngleterreLa plateforme est disponible dans le commerce et décrite en détail dans : Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon : Plateforme microfluidique pour la production de microbulles et nanobulles thérapeutiques. Examen des instruments scientifiques. 92 (7), 074105 (2021).
MatlabLe MathWorksRéf. R2023a
MéthanolMerck KGaA67-56-1
Eau Milli-Q
Gel PDMSSYLGARDSYLGARD® ;   ; 184
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1x)  ;Gibco10010023
Nettoyeur plasmaHenniker ScientificHPT-100
Pluronic F68Thermo Fisher Scientific24040032
Bouchon en caoutchoucSigmaZ166065-100EA
TubageMasterflexMFLX06407-41PTFE, 1/32 » ID x 1/16 » OD ; 25 pieds
Pince
Vortex  ;Sigma-aldrichZ654779
Sonicateur à bain d’eauEMAGEMMI 30HC

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