Production de microbulles stables recouvertes de phospholipides monodispersés à température ambiante à l’aide d’un dispositif de focalisation d’écoulement microfluidique

Résumé

Cet article décrit une méthode de production de microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides à l’aide d’un dispositif de focalisation d’écoulement microfluidique à température ambiante, y compris la préparation de la formulation du revêtement de phospholipides.

Résumé

Les microbulles monodispersées ont démontré un potentiel significatif dans l’amélioration de l’efficacité des agents de contraste à ultrasons pour l’imagerie et les applications thérapeutiques. Ces microbulles peuvent être produites directement à l’aide d’une méthode de focalisation par flux microfluidique, ce qui permet un contrôle précis de leur taille. Cependant, la prévention de la coalescence pendant la production reste un défi critique. Bien que des températures de production élevées (p. ex., 55 °C) puissent supprimer la coalescence, de telles conditions compliquent la conception des dispositifs microfluidiques et peuvent être incompatibles avec les agents de ciblage et les conjugués de médicaments. Ce protocole décrit une méthode pour produire des microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides à température ambiante, la stabilité et la monodispersité des microbulles étant maintenues pendant au moins 7 jours. Le protocole décrit également la fabrication de puces microfluidiques PDMS réutilisables et la préparation de la formulation de revêtement de phospholipides contenant le tensioactif Pluronic F68. Nos résultats montrent que les microbulles produites à l’aide de cette méthode conservent leur taille et leur stabilité pendant 7 jours, ce qui soutient leur applicabilité future dans des contextes cliniques où des agents de contraste à ultrasons stables et contrôlables sont essentiels.

Introduction

Les agents de contraste à ultrasons (UCA) sont largement utilisés dans l’échographie clinique et les applications thérapeutiques ^1,2,3. Administrées par voie intraveineuse, ces microbulles restent confinées dans le système vasculaire, agissant comme des agents de pool sanguin ^4,5. Une coquille stabilisatrice recouvre les microbulles et réduit la diffusion de gaz entraînée par la pression de Laplace, prolongeant ainsi la durée de vie de la microbulle ^3,6

Protocole

1. Fabrication de films lipidiques

REMARQUE : Le mélange lipidique pour la production de microbulles monodispersées est formulé avec un mélange binaire de DSPC et de DPPE-PEG5000 à un rapport molaire de 90:10. Le DSPC a été choisi comme lipide principal car il a été démontré qu’il offre une stabilité supérieure contre la dissolution des gaz dans les microbulles polydispersées^33,34 et monodispersées³¹. On suppose que cette stabilité accrue résulte de sa température de transition de phase cristalline gel-liquide ....

Résultats

Dans ce protocole, nous présentons une méthode pour produire des microbulles stables et monodispersées à température ambiante à l’aide d’une puce microfluidique à focalisation sur flux. La puce PDMS est fabriquée par moulage à partir d’un moule maître, comme le montre la figure 1. Pour lier la puce PDMS à une lame de verre, un traitement au plasma est utilisé. Le traitement au plasma est crucial car il modifie la surface du PDMS d’hydrophobe à hydrophile. Cette hydrophilie est essentielle po.......

Discussion

Ce protocole décrit en détail comment produire et stocker des microbulles monodispersées stables à température ambiante à l’aide d’une puce de focalisation de flux microfluidique. La microbulle monodispersée peut être utilisée pour l’imagerie par ultrasons avec contraste¹⁸, la détection de pression non invasive¹⁹ et l’administration de médicaments médiée par des microbulles²², à la fois in vitro et in vi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poinçon de biopsie de 1 mm  ;	Kai Médical	143831
1,1'-Dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD)	Thermo Fisher Scientic	D307	un colorant lipophile à base de carbocyanine
1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol] (DPPE-PEG5000)	Lipoïde	N° CAS 384835-61-4
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC)	Lipoïde	N° CAS 816-94-4
Cylindre doseur en verre de 100 mL	BLAUBRAND
Fioles jaugées en verre de 2 mL	BLAUBRAND
Erlenmeyer en verre de 250 mL	BLAUBRAND
Flacon en verre de 30 mL	DWK Sciences de la vie	SCERC40752700D0C2
70 % d’éthanol
75 ° ; Plaque chauffante C  ;
Ruban adhésif
Capuchon en aluminium  ;	Sigma-aldrich	27016
Gaz argon	; Linde Gas Benelux
C4F10 gaz	Produits chimiques F2
Chloroforme	Merck KGaA	67-66-3
Cliniquement disponible  ; agent de contraste à ultrasons (c.-à-d. microbulles)	Bracco, Plan-LesOuates, Suisse	SonoVue	Graphique 6A.
Aiguille de collecte et de ventilation 19G	100 Stérilisant	4657799
Compteur de socs Multisizer 3	Beckman Coulter	Machine de caractérisation des particules
Produit de contraste à ultrasons sur mesure (c.-à-d. microbulle monodispersée)	NA	F1-10PF	Graphique 6A. Produit tel que décrit par : Wang, Y. et al. Influence de Pluronic F68 sur la stabilité granulométrique et le comportement acoustique de microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides produites à température ambiante. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976&minus ;8986. (2025).
Produit de contraste à ultrasons sur mesure (c.-à-d. microbulle monodispersée)	NA	F2-10 PF	Graphique 6A. Produit tel que décrit par : Wang, Y. et al. Influence de Pluronic F68 sur la stabilité granulométrique et le comportement acoustique de microbulles monodispersées recouvertes de phospholipides produites à température ambiante. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976&minus ;8986. (2025).
Demi-eau
Lumière LED externe	GSVITEC	GS02370
Lyophilisateur	Mertin Christ GmbH	Alpha 1&ndash ; 2 LD plus
Générateur de formes d’onde de fonction  ;	Agilent	Référence 33220A
Flacon en verre étanche au gaz	Sigma-aldrich	Z113964-288EA
Toboggan en verre	VWR	631-1552
Caméra haute vitesse	Photron	Nova S16
Plateforme microfluidique Horizon	Université de Leeds, Angleterre		La plateforme est disponible dans le commerce et décrite en détail dans : Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon : Plateforme microfluidique pour la production de microbulles et nanobulles thérapeutiques. Examen des instruments scientifiques. 92 (7), 074105 (2021).
Matlab	Le MathWorks	Réf. R2023a
Méthanol	Merck KGaA	67-56-1
Eau Milli-Q
Gel PDMS	SYLGARD	SYLGARD® ;   ; 184
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1x)  ;	Gibco	10010023
Nettoyeur plasma	Henniker Scientific	HPT-100
Pluronic F68	Thermo Fisher Scientific	24040032
Bouchon en caoutchouc	Sigma	Z166065-100EA
Tubage	Masterflex	MFLX06407-41	PTFE, 1/32 » ID x 1/16 » OD ; 25 pieds
Pince
Vortex  ;	Sigma-aldrich	Z654779
Sonicateur à bain d’eau	EMAG	EMMI 30HC