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Stimulation de cellules endothéliales vasculaires à l’aide de pièges extracellulaires de neutrophiles en présence de lipoprotéines de basse densité

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DOI :

10.3791/68830

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12 août 2025

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1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

Dans cet article

Résumé

Une série de méthodes est décrite, notamment l’isolement des lipoprotéines de basse densité (LDL) du plasma humain, la différenciation des cellules HL-60 en cellules de type neutrophile, la préparation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) en présence de LDL et la stimulation des cellules endothéliales aortiques humaines avec un mélange de TNE et de LDL.

Résumé

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont apparus comme facteurs causaux dans diverses maladies non infectieuses et ont été impliqués dans des troubles cardiovasculaires tels que l’athérosclérose et la thrombose. La formation de TNE est observée dans la paroi vasculaire, et il existe des preuves convaincantes que les marqueurs plasmatiques de la formation de TNE augmentent avec la gravité de la maladie. Les composants des TNE dérivés des neutrophiles, y compris les myéloperoxydases et les protéases, affectent les lipoprotéines plasmatiques et l’homéostasie vasculaire. Ici, une série de méthodes pour stimuler les cellules vasculaires avec des TNE formées en présence de lipoprotéines de basse densité (LDL) est décrite. Le LDL a été fractionné à partir du plasma humain par ultracentrifugation. Les cellules HL-60 ont été traitées avec de l’acide rétinoïque tout-trans pour les différencier en cellules de type neutrophile, puis stimulées avec du phorbol-12-myristate 13-acétate (PMA) pour induire la formation de TNE. Après l’élimination et le lavage de la PMA, les cellules ont été incubées à nouveau avec du LDL. Les surnageants collectés contenant des TNE et des LDL ont été immédiatement utilisés pour stimuler les cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC). En tant que réponse représentative, l’altération morphologique des HAEC induite par le traitement par les TNE a été renforcée par la présence de LDL, suggérant que la formation de TNE, en combinaison avec les LDL, améliore la réponse des HAEC. Ces méthodes sont bénéfiques pour explorer les effets du LDL sur les cellules endothéliales sous activation des neutrophiles et inflammation associée aux TNE, fournissant ainsi de nouvelles informations sur les mécanismes sous-jacents aux maladies cardiovasculaires associées à l’augmentation du LDL plasmatique.

Introduction

Les pièges extracellulaires (TNE) neutrophiles, produits par les neutrophiles activés lors d’une infection bactérienne, ainsi que dans des conditions physiologiquement plausibles non infectieuses, libèrent de l’ADN et des protéines décondensés, tels que les histones, la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase1 des neutrophiles. Parce que ces composants peuvent démanteler les cellules et les tissus marginaux, provoquant une inflammation persistante, la formation de TNE est apparue comme un facteur causal dans l’initiation et la progression de diverses maladies aiguës et chroniques, notamment la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, le diabète, la maladie d’Alzheimer, les métastases cancéreuses et les maladies cardiovasculaires2. Les analyses histologiques des lésions vasculaires humaines de l’athérosclérose3 et de l’anévrisme de l’aorte abdominale4 ont montré que l’infiltration des neutrophiles et la formation de TNE étaient colocalisées. Dans le sang circulant, les niveaux de marqueurs de TNE, tels que les histones citrullinées, l’ADN-NET et le MPO, augmentent avec la gravité de la maladie coronarienne5. Dans les premiers stades de l’athérosclérose, la formation de TNE précède souvent l’accumulation de lipides, qui se produit via la formation de cellules spumeuses induites par les macrophages 6,7. Ces phénomènes suggèrent fortement que la MPO et les enzymes protéolytiques libérées extracellulairement lors de la formation des TNE peuvent agir non seulement sur les tissus vasculaires mais aussi sur les composants sanguins, tels que les lipoprotéines. Les lipoprotéines sont des complexes lipidiques-protéiques fragiles qui peuvent être endommagés par des protéines dérivées de TNE telles que le MPO8 ; par conséquent, la formation de TNE peut provoquer des altérations structurelles et biochimiques dans les lipoprotéines, influençant ainsi l’homéostasie vasculaire. Cependant, les effets synergiques de la formation de TNE et des lipoprotéines sur la dérégulation induite par les cellules vasculaires et les réponses inflammatoires restent incertains.

Ici, ce manuscrit propose une méthode pour examiner les réponses cellulaires des cellules endothéliales vasculaires humaines induites par le traitement avec des TNE préparées à partir de cellules de type neutrophile dérivées du HL-60 et de lipoprotéines de basse densité (LDL) fractionnées à partir de plasma humain. Des résultats représentatifs démontrent le fractionnement des LDL du plasma humain par ultracentrifugation et les réponses cellulaires des cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC) stimulées par des TNE après co-incubation avec des LDL. Cette méthode est largement applicable à l’étude des cellules vasculaires impliquant d’autres lipoprotéines.

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Protocole

Le protocole de préparation des LDL a été approuvé par le comité d’éthique de la faculté de pharmacie de l’Université médicale Showa (n° 231). Un consentement éclairé écrit a été obtenu conformément à la Déclaration d’Helsinki, et tous les participants ont volontairement apposé leur signature pour participer à cette étude. Les cellules ont été manipulées de manière aseptique à l’aide d’une hotte à flux laminaire. Le critère d’inclusion était une tranche d’âge de 22 à 65 ans. Les critères d’exclusion comprenaient l’usage du tabac, les maladies cardiovasculaires préexistantes (comme les maladies coronariennes, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies artérielles périphériques), les dysfonctionnements hépatiques graves et les maladies chroniques non contrôlées, notamment le diabète, l’hypertension, la dyslipidémie, les maladies inflammatoires graves et le cancer. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Isolement des LDL dans le plasma humain

  1. Prélever du sang total d’un volontaire humain en bonne santé en présence d’héparine anticoagulante (10 unités/mL).
  2. Centrifugeuse 45-50 mL de sang total humain obtenu dans un tube d’héparine (700 × g pendant 15 min à 4 °C). Assurez-vous de réduire lentement la vitesse de la centrifugeuse. Recueillir la couche supérieure comprenant la fraction plasmatique.
  3. Effectuez deux fois la centrifugation (700 × g, 15 min à 4 °C) avec le même réglage de décélération qu’à l’étape 1.2 pour éliminer les cellules sanguines. Ajouter un volume de 1:1 000 de 250 mM d’EDTA (pH 7,4) pour prévenir l’oxydation des lipoprotéines médiée par les ions métalliques divalents.
  4. Placez 2,7 ml de plasma dans un tube de 4 ml en polycarbonate (4PC), superposez 900 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 250 μM D’EDTA (PBS/EDTA) et ultracentrifugeuse (600 000 × g, 7 min à 4 °C).
  5. Jetez 900 μL de la couche supérieure pour éliminer le chylomicron. Empilement de 900 μL de PBS/EDTA sur plasma et ultracentrifugeuse (600 000 × g, 2,5 h à 4 °C).
  6. Jetez 900 μL de la couche supérieure pour éliminer les lipoprotéines de très basse densité (VLDL). Cette étape est importante pour éviter la contamination des LDL par d’autres fractions de lipoprotéines.
  7. Ajouter 540 μL de solution KBr à 0,5 mg/mL pour ajuster la densité à d = 1,063, puis mélanger doucement à l’aide d’une pipette puis d’une ultracentrifugeuse (600 000 x g, 2,5 h à 4 °C).
  8. Prélever 540 μL de la couche supérieure contenant du LDL. Une couche jaune-orange indique une séparation réussie des LDL9. Transfert sur une membrane de dialyse.
  9. Dialyser la fraction LDL trois fois contre 2 L de PBS/EDTA à 4 °C dans l’obscurité pour éliminer KBr.
  10. Stockez le LDL à 4 °C dans l’obscurité avant utilisation.

2. Préparation de puits enrobés de poly-L-lysine ou de gélatine

  1. Préparez une solution de poly-L-lysine à 0,01 %10 en diluant une solution de poly-L-lysine à 0,1 % avec de l’eau stérile, suivie d’une filtration avec un filtre stérile de 0,2 μm. Conserver à 4 °C avant utilisation.
  2. Ajouter 152 μL/puits d’une solution de poly-L-lysine à 0,01 % dans chaque puits d’une plaque à 12 puits et incuber pendant au moins 5 min.
  3. Retirer la solution, puis laver une fois avec 200 μL/puits d’eau stérile et sécher pendant au moins 2 h.
  4. Conserver à température ambiante avant utilisation dans la préparation des TNE.

3. Préparation des puits recouverts de gélatine

  1. Préparez une solution de gélatine à 0,1 % avant utilisation en diluant une solution de gélatine à 2 % avec de l’eau stérile.
  2. Ajouter 152 μL/puits de la solution de gélatine à 0,1 % dans chaque puits d’une plaque à 12 puits et incuber pendant au moins 5 min11.
  3. Retirer la solution, puis laver une fois avec 200 μL/puits d’eau stérile et sécher pendant au moins 2 h.
  4. Conserver à température ambiante avant utilisation.

4. Entretien et préparation des cellules endothéliales de l’aorte humaine (HAEC)

  1. Cultiver des HAEC primaires dans une fiole de culture non enrobée à l’aide d’un milieu complet contenant 2 % de sérum de veau fœtal, 5 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 10 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques, 20 ng/mL de facteur de croissance analogue à l’insuline, 0,5 ng/mL de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, 1 μg/mL d’acide ascorbique, 22,5 μg/mL d’héparine et 0,2 μg/mL d’hydrocortisone, comme indiqué dans les instructions du fabricant. Changez de milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 70 % à 80 %.
  2. Pour la stimulation, semez les HAEC dans des plaques de 12 puits recouvertes de gélatine. Changez de milieu tous les deux jours jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Effectuez l’expérience entre les passages 4 et 7.

5. Préparation de cellules de type neutrophile dérivées du HL-60 suivies de TNE

  1. Maintenir les cellules HL-60 avec le milieu RPMI-1640 complété par 5 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine, à l’aide de plats non traités.
  2. Pour la préparation de cellules de type neutrophile dérivées du HL-60, cultiver 2 × 106 cellules par 10 mL de cellules HL-60 pendant 4 jours dans un milieu RPMI-1640 contenant 2 μM d’acide rétinoïque tout trans (AtRA).

6. Préparation des TNE avec le LDL

  1. Prélever les cellules HL-60 4 jours après le traitement avec 2 μM AtRA. Après la différenciation des cellules HL-60 en cellules de type neutrophile, les cellules deviennent plus petites.
  2. Cellules de centrifugation (220 × g, 4 min à 18-22 °C). Aspirez le surnageant et lavez les cellules avec un volume égal de RPMI-1640 sans sérum.
  3. Centrifugez les cellules (220 × g, 4 min à 18-22 °C), puis remettez les cellules en suspension avec du RPMI-1640 sans sérum.
  4. Comptez les cellules, puis remettez-les en suspension à 2 × 106 cellules/mL dans du RPMI-1640 sans sérum et ensemencez 0,5 mL de suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à 12 puits pré-enduite de poly-L-lysine. Cultiver pendant au moins 30 min.
  5. Ajouter 100 μL de RPMI-1640 sans sérum avec ou sans 300 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) à la concentration finale de 0 ou 50 nM de PMA. Culture pendant 30 min.
  6. Retirez le milieu et lavez une fois les cellules avec du RPMI-1640 sans sérum. Remplacer le milieu par du RPMI-1640 sans sérum avec ou sans 20 μg/mL de LDL, puis cultiver pendant 2 h.
  7. Prélever le milieu de culture et centrifuger (700 × g, 3 min à 18-22 °C) pour éliminer les débris cellulaires.

7. Stimulation des HAEC avec des TNE et des LDL

  1. Remplacer le milieu par 0,5 mL de milieu de culture frais. Cultivez pendant au moins 30 minutes avant la stimulation.
  2. Ajouter 167 μL du milieu de culture contenant des TNE et des LDL (étape 6.7) et LDL dans des boîtes HAEC. Vérifiez les changements morphologiques dans les HAEC induits après une stimulation pendant 12 h ou plus.

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Résultats

Après l’élimination des chylomicrons, suivie des fractions VLDL du plasma humain par ultracentrifugation séquentielle, le plasma humain a été mélangé à une solution KBr pour ajuster la densité à d = 1,063. Au cours de cette étape, le précipitant restant n’a pas été complètement dissous dans la solution, et un mélange sévère, qui a créé des bulles de gaz, a été évité pour garder le LDL intact. Après l’ultracentrifugation, le LDL a été évalué visuellement sur la couche supérieure par sa couleur jaune-orange

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Discussion

Ce protocole décrit la préparation de TNE à partir de cellules dHL-60 induites par la coexistence de LDL, qui sont ensuite utilisées pour analyser les réponses HAEC. L’importance de ce protocole est l’utilisation d’un milieu frais contenant des TNE et des LDL pour la stimulation des cellules, même si de nombreuses autres études utilisent une solution mère de TNE congelées à -20 °C. Comme les lipoprotéines sont des complexes lipidiques-protéines, leurs structures et caractéristiques inta...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée en partie par la Société japonaise pour la promotion de la science, KAKENHI (numéros de subvention 23K10897 et 19K07069). Nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l’édition de la langue anglaise.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,1 % de poly-L-lysineSigmaAldrichP8920-100ML
Plat de 10 cmCorning430591
Plaques de culture tissulaire à 12 puitsFaucon353043
2 % GélatineSigmaAldrichG1393-20ML
Tube 4PCL’HimacS404332A
Acide rétinoïque tout-transWako188-01113Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
Tubulure de dialyse CelluroseGroupe MISUMI Inc.Référence 0327-23-37-07 (UC18-32-100)Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
EDTADojindo345-01865Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
Milieu de croissance cellulaire endothéliale Kit 2PromoCellC-22111
Sérum fœtal bovinGibco10270-106Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
Héparine sodique (5 000 unités/5 ml)Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseTOMYSRX-201Accélération : 9, Décélération : 7
Cellules endothéliales de l’aorte humaineLonzaCC-2535
KBrWako168-03475Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
Logiciel de microscopie KEYENCECLÉAnalyseur BZ-II
Micro ultracentrifugeuseL’HimacCS150GX
MicroscopieOLYMPECK40
MicroscopieCLÉBZ-9000Pour l’imagerie en accéléré (option)
Caméra de microscopieNikonDS-Fi3
Logiciel de caméra de microscopieNikonDS-L4
Pénicilline/streptomycineGibco15140-122 100MLPeut être remplacé par n’importe quel fournisseur
tampon phosphate salin (& fois ; 10)Dissoudre 2,6 g de NaH2PO4· ; 2H2O, 29 g de Na2HPO4· ; 12H2O, 80 g de NaCl et 2,0 g de KCl dans de l’eau distillée et ajuster au volume de 1 L. (Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur)
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acétate)Wako162-23591Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
ReagentPackLonzaCC-5034(CC-5022 : Solution saline tamponnée HEPES, CC-5012 : Trypsine/EDTA, CC-5002 : Solution neutralisante de trypsine)  ;
RotorL’HimacS100AT6-0242
RPMI-1640 (avec rouge de phénol)Wako189-02025Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
RPMI-1640 (sans rouge de phénol)Wako186-02155Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur
Fiole T-25Corning3275

Références

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Mots-clés

Formation de NETcellules HL 60ultracentrifugationfractionnement du plasma humainac tate de myristate de phorbolalt ration morphologiquem canismes des maladies cardiovasculaires

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