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Article de méthode

Amplification combinée de la recombinase polymérase Essai CRISPR/Cas12a pour la détection de Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

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DOI :

10.3791/68841

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14 novembre 2025

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1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans ce protocole, un test combiné d’amplification de la recombinase polymérase CRISPR/Cas12a est illustré pour la détection de l’agent pathogène envahissant des plantes, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Résumé

Une surveillance régulière et précise est essentielle à la gestion efficace des maladies des plantes. Il peut indiquer quel plan d’action est le plus approprié et si la prévention, l’éradication ou l’absence de mesure est nécessaire. La surveillance basée sur la symptomatologie chez les plantes hôtes seules n’est souvent pas fiable en raison des similitudes des symptômes causés par les stress biotiques et abiotiques. Les méthodes moléculaires en laboratoire, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la PCR quantitative (q)PCR, sont les plus couramment et les plus fiables pour la détection des agents pathogènes des plantes, mais elles nécessitent des équipements coûteux et des opérateurs qualifiés. Ici, nous décrivons un protocole combinant une extraction d’ADN simplifiée, une amplification par polymérase recombinase (RPA) et des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) pour la détection de l’agent pathogène invasif, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc TR4). La technique offre une alternative simple de détection à tube unique, analytiquement robuste avec une spécificité améliorée par rapport aux tests de détection moléculaire disponibles et élimine le besoin d’équipements de laboratoire coûteux et sophistiqués.

Introduction

La fusariose, causée par l’agent pathogène fongique du sol Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), est considérée à l’échelle mondiale comme l’un des agents pathogènes transfrontaliers des plantes les plus dévastateurs de l’histoire1. Une fois introduit dans une nouvelle zone, le Foc reste invisible jusqu’à ce que les plantes infectées développent des symptômes. Cela peut prendre des mois, ce qui permet au champignon de s’établir et de se propager sans le savoir. Une fois établie, elle est presque impossible à éradiquer économiquement en raison de la production de chlamydospores résistantes et de la nature pérenne de la production de bananes. L’importance de la prévention et de la détection précoce est donc primordiale pour protéger les producteurs vulnérables1. L’épidémie actuelle de la maladie, causée par la race tropicale Foc 4 (TR4), nécessite une détection par une surveillance régulière afin d’identifier les bananiers symptomatiques dans les zones à haut risque. Les contraintes abiotiques telles que le stress hydrique et certaines carences en nutriments produisent un jaunissement externe, qui s’apparente aux symptômes produits par l’infection par Foc TR4. De plus, les symptômes résultant d’une infection par différentes races Foc ne peuvent pas être distingués. La purification en laboratoire et la détection phénotypique et moléculaire ultérieure sont donc nécessaires pour une détection fiable de Foc TR42. Divers tests moléculaires sont disponibles pour la détection de Foc TR4, notamment la PCR, la PCR quantitative (q) et les tests d’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) 3,4,5,6,7. Cependant, la plupart de ces protocoles nécessitent encore des compétences et des équipements coûteux et spécialisés, qui doivent être effectués en laboratoire. L’amplification par polymérase recombinase (RPA) peut être réalisée de manière isotherme et, par conséquent, élimine le besoin d’un tel équipement et peut être envisagée pour les protocoles de détection sur le terrain8.

Les systèmes CRISPR-Cas sont de plus en plus utilisés pour améliorer le diagnostic moléculaire9. Ces systèmes sont utilisés car ils sont peu coûteux, simples et ne nécessitent pas l’utilisation d’instruments spéciaux, et peuvent donc être envisagés pour la détection sur le terrain. Les diagnostics basés sur CRISPR impliquent généralement l’amplification isotherme d’une séquence cible, suivie de la reconnaissance de la cible via les protéines CRISPR-Cas et du clivage collatéral d’un colorant rapporteur fluorescent d’ADN ou d’ARN pour indiquer la présence de la cible10,11. Dans les systèmes CRISPR-Cas12a, en particulier, l’ARN CRISPR (ARNcr) guide Cas12a pour reconnaître et cliver les cibles d’acide nucléique. Cet ARNcr peut être conçu pour cibler une région spécifique d’ADN ou d’ARN d’intérêt par hybridation avec une séquence complémentaire. Une fois lié, il en résulte le clivage de Cas12a de la cible avec une spécificité mononucléotidique, suivi d’un clivage collatéral des molécules rapporteures12. Récemment, les systèmes CRISPR-Cas12a ont été utilisés pour détecter divers agents pathogènes fongiques des plantes d’importance économique 13,14,15,16,17,18,19,20.

Dans ce protocole, le développement d’une technique de détection à tube unique est décrit, combinant une extraction simplifiée de l’ADN, une amplification par polymérase recombinase (RPA) et la technologie CRISPR/Cas12a (RPA-Cas12a) pour la détection de Foc TR4, qui a été visualisée à la fois sur un fluorimètre portable et à l’œil nu sous un transilluminateur à diode électroluminescente (LED) peu coûteux21. La méthode peut être optimisée pour la détection sur le terrain afin d’améliorer les stratégies de prévention et de confinement. Une approche similaire peut également être utilisée pour concevoir des tests de détection basés sur Cas12a pour d’autres agents pathogènes des plantes.

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Protocole

1. Extraction simplifiée de l’ADN à partir de matériel végétal

REMARQUE : reportez-vous à la Figure 1 pour une vue d’ensemble.

  1. Effectuez l’extraction de l’ADN.
    1. Transférez 250 mg de chaque morceau de pseudo-tronc symptomatique dans un sac d’extraction séparé (voir le tableau des matériaux).
    2. Ajouter 2 mL de NaOH-PVP (Table des matières) de 0,5 M dans des sacs contenant du matériel végétal. Broyez les récipients infectés dans un sac d’extraction à l’aide d’un broyeur manuel comme un pilon.
      REMARQUE : Ajouter 1 à 2 mL de NaOH-PVP supplémentaire de 0,5 M si nécessaire pour obtenir suffisamment d’extrait liquide du sac.
    3. Ajouter 195 μL de 100 mM de Tris-HCL (pH 8,0) (Table des matériaux) dans des tubes de 1,5 mL.
    4. Pipeter 5 μL d’extrait du sac dans le tube de 1,5 mL avec 195 μL de 100 mM de Tris-HCL (pH 8,0), en diluant l’extrait 40 fois.
    5. Agitez les tubes pendant 15 à 30 s et stockez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.

2. Synthèse de l’ARNcr et contrôle de la qualité

  1. Effectuer la transcription.
    1. À l’aide du kit de transcription d’ARN (table des matériaux), ajoutez les éléments suivants dans un tube de PCR de 0,2 mL : 1,5 μL de tampon de réaction 10x T7, 1,5 μL de chaque dNTP, 1,5 μL de mélange d’ADN polymérase T7, 1 μL d’eau exempte de nucléases et 10 μL d’ADN matrice 100 μM T7 pour un volume total de 20 μL.
    2. Incuber le tube à 37 °C dans un bain-marie ou une machine PCR pendant au moins 4 h.
    3. À l’aide d’un spectrophotomètre (Table des matières), déterminer la quantité d’ARN transcrit. Diluer l’ARN à 250 ng/μL (10 μg) dans un volume de 40 μL à l’aide d’eau exempte de nucléases ou d’un tampon TE (Fichier supplémentaire 1).
      REMARQUE : L’ARN transcrit peut être stocké à -80 °C jusqu’à ce que les traitements et les étapes de nettoyage se poursuivent.
  2. Effectuer le traitement de la DNase et le nettoyage de l’ARNcr.
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes à température ambiante. Gardez l’ARN et l’enzyme DNase I sur de la glace.
    1. Traitez l’échantillon d’ARN avec la DNase I incluse dans le kit de nettoyage de l’ARN (Table des matériaux) selon les instructions du fabricant22.
    2. Nettoyez l’échantillon d’ARN à l’aide du kit de nettoyage d’ARN conformément aux instructions du fabricant, conformément au protocole II22.
    3. Nanodéposez l’ARNcr nettoyé pour déterminer la quantité et la qualité présentes. Diluer l’ARN à 100 ng/μL avec de l’eau exempte de nucléases et le conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
    4. Chauffer l’ARNcr avec le colorant de charge d’ARN (Table des matériaux) à 70 °C pendant 10 min dans un bain-marie, et soumettre l’ARNc à une électrophorèse sur un gel d’agarose à 1,5 % pour visualiser l’ARNcr synthétisé (Figure 2).

3. Amplification par polymérase recombinase (RPA)-réaction monotube Cas12a pour la détection in vitro Foc TR4

REMARQUE : Voir la figure 3 pour une vue d’ensemble.

  1. Préparez les mélanges réactionnels RPA et Cas12a.
    REMARQUE : Assurez-vous que ces étapes sont effectuées dans un espace exempt d’ADN sur de la glace, avec les réactifs et les matériaux pré-refroidis. Essuyez le plan de travail et les pipettes avec de l’eau de Javel et de l’éthanol à 70 % avant l’expérience. Voir le tableau 1 pour obtenir des renseignements sur tous les oligonucléotides utilisés dans cette étude.
    1. Préparez un mélange réactionnel Cas12a de 20 μL dans un tube séparé de 0,5 mL (tableau des matériaux) avec les volumes de réactifs suivants : 2 μL de 10x NEBuffer r2.1 (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl2, 100 μg/mL d’albumine recombinante, pH 7,9), 0,4 μL de protéine 10 μM LbCas12a, 0,6 μL de 100 ng/μL d’ARNcr, 0,4 μL de rapporteur de 10 μM et 16,6 μL d’eau désionisée.
      REMARQUE : Les concentrations finales de la protéine LbCas12a, de l’ARNcr et du rapporteur sont respectivement de 200 nM.
    2. Préparez un mélange réactionnel RPA de 9,5 μL dans un tube séparé de 0,5 mL avec les volumes de réactif suivants : 5 μL de 2x tampon de réaction (concentration finale 1x selon les directives du fabricant), 1,6 μL de dNTP Mix (concentration finale 1,6 mM), 1 μL de 10x E-Mix de base (concentration finale 1x selon les directives du fabricant), 0,5 μL de chaque amorce RPA à 10 μM (concentration finale 0,5 μM chacune), 0,5 μL de mélange réactionnel à noyau 20x (concentration finale 1x selon les directives du fabricant) et 0,4 μL d’eau désionisée.
    3. Placez une bande de 8 tubes dans un support de tubes (Table des matériaux) sur de la glace.
    4. Transvasez le mélange réactionnel Cas12a de 20 μL dans la base du tube.
    5. Transférez le mélange réactionnel RPA de 9,5 μL dans le couvercle de la bande tubulaire. Ajouter 0,5 μL de 280 nM de MgOAc (concentration finale 14 nM) au mélange réactionnel RPA dans le couvercle de la bande tubulaire et mélanger par pipetage de haut en bas.
    6. Ajouter 0,5 μL d’eau déminéralisée dans le couvercle du tube sans matrice (NTC) et le fermer avec précaution pour s’assurer que les mélanges réactionnels RPA et Cas12a ne sont pas combinés.
      REMARQUE : Un contrôle sans modèle (NTC) est inclus pour garantir la fiabilité des résultats.
  2. Ajoutez l’ADN matriciel et lancez la réaction.
    1. Ajouter 0,5 μL d’ADN matrice au mélange réactionnel RPA de 10 μL contenant du MgOAc dans le couvercle de la bande tubulaire, à l’exception du NTC, avec de l’eau désionisée à la place de l’ADN. Ajoutez toujours un contrôle positif connu de l’ADN Foc TR4 dans un puits pour vous assurer que le test a fonctionné comme prévu. Mélanger par pipetage de haut en bas.
    2. Fermez soigneusement les couvercles de la bande tubulaire pour vous assurer que les réactions RPA et Cas12a ne se mélangent pas.
    3. Allumez le fluorimètre portable (table des matériaux) et créez un profil d’exécution pour le test RPA-Cas12a (fichier supplémentaire 2). Ouvrez le profil de fonctionnement enregistré et placez la bande de tube dans le fluorimètre portable pour l’incuber pendant 30 min à 37 °C.
      REMARQUE : Veillez à ne pas toucher le fond des tubes lors de la manipulation de la bande de tubes ; Au lieu de cela, tenez les bords extérieurs en haut à gauche et à droite.
    4. Retirez la bande de tube du fluorimètre portable après 30 min. Retournez les tubes six fois pour mélanger les réactions RPA et Cas12a et faites-les tourner dans une mini centrifugeuse (voir tableau des matériaux) pendant 5 s.
    5. Replacez la bande de tube dans le fluorimètre portable et incubez pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C à l’aide du profil de course enregistré.
  3. Visualisez les résultats.
    1. Interpréter les unités de fluorescence relative (RFU) moyennes mesurées sur le fluorimètre portable (Fichier supplémentaire 2 et manuel d’utilisation23).
    2. Visualisez les tubes sous lumière bleue LED à une longueur d’onde d’excitation de 465 nm à l’aide d’un transilluminateur de lumière bleue (Fichier supplémentaire 3). Capturez des images avec l’appareil photo d’un téléphone.

   

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Résultats

La détection réussie de Foc TR4 à partir de matériel végétal infecté à l’aide d’une extraction simplifiée de l’ADN suivie du test combiné RPA-Cas12a lorsqu’elle est effectuée dans le fluorimètre portable Genie III est illustrée à la figure 4A. Les échantillons positifs présentent une fluorescence visible (voies 6-8), tandis que les échantillons négatifs montrent une fluorescence à faible point final (voies 1-5). Lorsque les tubes d’échantillon ont été observ...

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Discussion

Une surveillance régulière est une stratégie importante pour des efforts efficaces de prévention et de confinement du Foc TR4 et d’autres ravageurs envahissants importants. Des protocoles de détection qui peuvent être appliqués sur le terrain et identifier rapidement et précisément les agents pathogènes peuvent accélérer la prise de décision et limiter les coûts associés aux efforts de surveillance. À cette fin, le protocole présenté ici combinait une extraction simplifiée de l’ADN, réal...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier ou intellectuel concurrent.

Remerciements

Nous reconnaissons le financement de la Fondation nationale de la recherche d’Afrique du Sud, numéro de subvention : 138109, dans le cadre du programme de soutien concurrentiel pour les chercheurs non évalués. Nous saluons également le financement de la bourse de recherche et d’innovation Marie Sklodowska-Curie du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la subvention du projet INDICANTS n° 890856.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Protéine EnGen Lba Cas12a (Cfp1)New England BiolabsM0653T
Diluant EnGen Lba Cas12aNew England BiolabsB0653A
Eppendorf PCR TubesMerckEP0030124332
Tubes micro à verrouillage EppendorfMerckEP0030121708
Sacs d’extraction universelsBIOREBA430100
Échelle ADN GeneRuler 100 pbThermo Fischer ScientificSM0241 / SM0242
Genie Centrifuge Mini-6KOOptiGeneOP-FUGE
Génie IIIOptiGenehttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/  ;
Porte-bande GenieOptiGeneGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
Genie StripsOptiGeneOP-0008-50 / OP-0008-500
Kit de synthèse d’ARN à haut rendement HiScribe T7New England BiolabsE2040S
Spectrophotomètre UV/Vis NanoDrop ND-1000Thermo Fischer Scientifichttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3New England BiolabsB7003S
NEBuffer r2.1New England BiolabsB6002S
Poudre de polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-Aldrich9003-39-8
Kit RNA Clean et Concentrateur-5Zymo ResearchR1013
Colorant de charge d’ARNThermo Fischer ScientificR0641
Téléilluminateur SmartBlue Blue LightAccuris InstrumentsE4000-E
Granulés d’hydroxyde de sodium (NaOH)Merck, EMPARTAK277
Tris (hydroxylméthyl) aminométhaneMerck77-86-1
Kit Liquide Base TwistAmpTwistDxTALQBAS01

Références

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