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Article de méthode

Imagerie chimique à très haut contenu en information avec microscopie à vie anti-Stokes cohérente à large bande, Raman et fluorescence à deux photons

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DOI :

10.3791/68845

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7 octobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une plate-forme d’imagerie multimodale combinant la diffusion Raman anti-Stokes cohérente à large bande (BCARS), la fluorescence d’excitation à deux photons (TPEF) et la microscopie d’imagerie à vie à vie de fluorescence à deux photons (2P-FLIM), permettant une bioimagerie chimique à très haut contenu en information.

Résumé

La spectroscopie d’empreintes digitales Raman et l’imagerie à vie de fluorescence sont des outils émergents pour l’étude des profils métaboliques d’échantillons biologiques. Alors que la spectroscopie d’empreintes digitales Raman détecte les vibrations moléculaires intrinsèques qui reflètent la composition moléculaire et l’environnement chimique d’un échantillon, l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence mesure les changements de la durée de vie à l’état excité des fluorophores sensibles à leurs microenvironnements. Ici, nous présentons une plate-forme d’imagerie multimodale combinant la diffusion Raman cohérente anti-Stokes à large bande (BCARS) et la microscopie à vie de fluorescence à deux photons (2p-FLIM) qui peut acquérir des spectres d’empreintes Raman biologiquement pertinents et des signaux de durée de vie de fluorescence in vivo et simultanément. Les informations chimiques considérables obtenues à partir d’images BCARS et 2p-FLIM co-enregistrées dans l’espace nous permettent de caractériser les différences subtiles entre les compartiments subcellulaires et de vérifier les résultats potentiellement faussement positifs générés par l’imagerie de fluorescence seule. Ceci est démontré en comparant directement les signaux BCARS, 2p-FLIM et de fluorescence d’excitation à deux photons (TPEF) obtenus simultanément à partir du même organite coloré dans le C . elegans vivant et intact exprimant un marqueur de protéine fluorescente verte (GFP). Dans ce travail, nous présentons le schéma de configuration BCARS/2p-FLIM/TPEF, les étapes d’acquisition d’images, le traitement des données et des résultats représentatifs montrant que la méthode d’imagerie intermodale permet une caractérisation rigoureuse et une détection in vivo à résolution subcellulaire. Ce protocole fournit un cadre pour l’imagerie chimique et l’imagerie simultanée de la durée de vie de la fluorescence afin d’améliorer la précision de l’interprétation biologique dans les systèmes vivants complexes.

Introduction

L’un des défis des études biologiques est de détecter avec précision les matériaux de construction biologiques dans leur état natif et dans l’architecture intacte des cellules et des tissus. La spectroscopie Raman présente un potentiel sans précédent pour la détection des métabolites intrinsèques et des espèces chimiques dans les échantillons biologiques et a récemment été reconnue comme un outil émergent pour le profilage métabolique des échantillons biologiques1. En analysant les pics de divers groupes métaboliques montrés dans les spectres d’empreintes digitales Raman, de plus en plus de preuves montrent que les caractéristiques de l’empreinte digitale peuvent être utilisées pour détecter les premiers stades de maladies telles que le cancer 2,3,4, les troubles cardiaques 5,6 et les maladies neurodégénératives 7,8 et sont particulièrement utiles pour résoudre des problèmes biologiques fondamentaux 9,10 y compris l’imagerie des structures intracellulaires sans aucune perturbation de marquage11, la différenciation de divers états cellulaires12,13 et la classification des types cellulaires 14,15,16. La plupart des informations chimiques ( > 90 %) codées dans les spectres Raman se trouvent dans la région des empreintes digitales (500 à 1800 cm-1), ce qui rend cette région de loin la plus utile pour discriminer les compositions chimiques dans les échantillons biologiques17. Cependant, la faiblesse du signal Raman dans cette gamme de fréquences rend difficiles les applications de la spectroscopie d’empreintes digitales Raman aux études biologiques, en particulier pour les spécimens biologiques vivants et intacts1.

Les approches d’imagerie Raman cohérente (IRC) raccourcissent considérablement le temps d’acquisition des signaux Raman, mais la plupart d’entre elles acquièrent des segments spectraux relativement étroits et sont optimisées pour les signaux d’étirement CH forts entre 2800 et 3100 cm-1. Les CARS à bande étroite et la diffusion Raman stimulée (SRS) (Figure 1A, B) utilisent deux impulsions picosecondes, généralement pour acquérir une partie étroite du signal CH fort 18,19,20,21,22,23. Les approches IRC multiplexes, telles que les CARS multiplex (Figure 1C), utilisent une combinaison d’impulsions picosecondes et d’impulsions ~100 fs pour obtenir une gamme spectrale modérée (généralement ≤ 400 cm-1) généralement dans la région CH 24,25,26,27,28,29,30. L’acquisition d’un spectre Raman complet pertinent sur le plan biologique (de 600 à 3200 cm-1) par pixel à l’aide de ces approches d’imagerie est généralement prohibitive, car la plupart des signaux d’empreintes digitales sont 10 à 100 fois plus faibles que les signaux d’étirement CH31. Contrairement à la plupart des approches CRI, la diffusion Raman cohérente anti-Stokes à large bande (BCARS) est optimisée pour l’acquisition à large bande en une seule fois qui couvre les régions d’empreinte digitale et d’étirement CH 31,32,33. Le BCARS utilise les interactions intra-impulsions d’une impulsion fs de ~10 pour exciter efficacement les vibrations à basse fréquence (empreinte digitale) (Figure 1D), et utilise le même mécanisme que le CARS multiplexe, la combinaison de l’impulsion fs et d’une impulsion ps pour générer une cohérence vibratoire dans la région d’étirement CH (Figure 1C)32,33. De plus, les signaux BCARS sont intrinsèquement calibrés en raison de leur interaction avec le fond non résonant (NRB), ce qui permet d’obtenir un spectre Raman complet quantitatif et invariant par impulsion laser à chaque pixel31, avec la capacité d’acquérir rapidement des données à haut contenu en information à partir de cellules, de tissus intacts et d’organismes biologiques vivants 32,34,35,36,37,38 et 39.

Les spectres BCARS bruts acquis contiennent un fort « bruit de fond non résonant » (NRB). Le NRB est la contribution de la réponse électronique aux impulsions laser qui n’est pas chimiquement spécifique. Le NRB interfère de manière cohérente avec le signal de résonance vibratoire, agissant comme un amplificateur hétérodyne32. Le NRB déforme également le spectre Raman sous-jacent (Figure 2A), mais le spectre Raman peut être récupéré tant que des sections spectrales contiguës significatives sont acquises. À l’heure actuelle, il n’existe aucune méthode de post-traitement permettant de séparer le signal CARS résonant de la composante non résonante à l’aide d’une approche CARS à bande étroite. La récupération du signal Raman à partir du signal CARS à large bande peut être réalisée en utilisant la relation de Kramers-Kronig dans le domaine temporel (ou transformée de Hilbert)33,40 (Figure 2B), l’entropie maximale41,42 ou l’apprentissage automatique 43,44,45,46,47,48 Approches. Notez que les deux premières méthodes récupèrent analytiquement la phase (le signal Raman résonant) à partir des spectres BCARS bruts, les approches d’apprentissage automatique peuvent être fortement dépendantes de l’instrumentation et des modèles d’entraînement.

Alors que la microscopie BCARS permet une caractérisation sans marquage du profilage métabolique des échantillons biologiques, le même laser supercontinuum (950 - 1200 nm pour la configuration BCARS présentée dans ce travail) utilisé pour la génération de signaux BCARS peut également exciter une large gamme de colorants, tels que les colorants à base de rhodamine, de bodipy, à base de fluor Alexa et de cyanine, et diverses protéines fluorescentes, y compris GFP et mCherry49. 50. Paragraphe 50. Par rapport à l’excitation monophotonique à l’aide de lasers à ondes continues visibles (CW), la microscopie à fluorescence multiphotonique, telle que la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence à deux photons (2p-FLIM) et la microscopie à fluorescence à excitation à deux photons (TPEF), l’utilisation de la lumière proche infrarouge (NIR) offre une profondeur de pénétration d’échantillon plus profonde, une capacité de sectionnement 3D intrinsèque, des images à contraste élevé et une bonne résolution comparable à la microscopie confocale de pointe, ce qui en fait un outil attrayant pour les applications biologiques. recherche 51,52. La microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM) utilisant une approche de comptage de photons uniques corrélée dans le temps (TCSPC) détecte les signaux de décroissance de fluorescence excités de manière répétée par une source laser modulée dans le temps53,54. Le spectre de fluorescence d’un fluorophore donné peut changer en fonction de facteurs environnementaux tels que la polarité du solvant, mais ces changements sont généralement subtils. D’autre part, les durées de vie de la fluorescence varient souvent de deux facteurs ou plus avec des changements environnementaux tels que les valeurs de pH55, la viscosité56, la polarité57 et la concentration d’espèces ioniques58,59, les interactions de liaison, la présence de trempeurs ou les changements structurels53,54. Cette propriété unique de la durée de vie de la fluorescence fournit un contraste de signal supplémentaire dans l’imagerie de fluorescence et a résolu avec succès les problèmes d’interférence de l’autofluorescence dans l’imagerie cellulaire et tissulaire60, en démélangeant plusieurs fluorophores à l’aide d’une approche FLIM résolue spectralement61, le diagnostic et le traitement du cancer62, la détection sans marquage de l’hétérogénéité cellulaire63 et les changements métaboliques64,65.

Dans ce travail, nous introduisons une plateforme d’imagerie multimodale combinant BCARS, 2p-FLIM et TPEF. À notre connaissance, c’est la première fois qu’une plateforme d’imagerie permettant l’imagerie BCARS et 2p-FLIM/TPEF est simultanée. Nous démontrons les capacités d’imagerie in vivo de cet instrument à l’aide d’un organisme modèle génétiquement traitable largement utilisé, Caenorhabditis elegans (C. elegans). Nous montrons que les spectres BCARS, les désintégrations 2p-FLIM du rouge du Nil (un colorant lipidique vital) et les signaux GFP de fluorescence à deux photons d’un marqueur lipidique rapporté (DHS-3 ::GFP) peuvent être acquis simultanément in vivo à partir de vers colorés au rouge du Nil. Un guide pratique pour l’approche d’imagerie présentée ici comprend (i) l’échantillon doit être optiquement transparent et d’une épaisseur généralement inférieure à 100 μm ; (ii) L’état de coloration peut être différent selon les colorants et les échantillons. Dans les résultats de la coloration rouge du Nil de C. elegans présentés ici, la concentration de rouge du Nil est au niveau ~μM, et le temps de coloration peut varier de quelques heures à une nuit66 ; iii) un environnement sombre de l’échantillon est nécessaire pour éviter toute fuite de lumière visible dans les détecteurs 2p-FLIM/TPEF. Ces conditions d’imagerie sont identiques à celles de la plupart des microscopies optiques non linéaires et de la microscopie à fluorescence. De plus, notre système présenté ici peut être appliqué pour détecter d’autres colorants et rapporteurs fluorescents en plus du rouge du Nil et du GFP en introduisant un laser Ti :Sapphire fs supplémentaire qui couvre la gamme 700 -950 nm pour l’excitation de fluorescence à deux photons. Ainsi, alors que les résultats représentatifs décrits dans ce protocole sont l’imagerie in vivo de C. elegans colorés exprimant la GFP, la plateforme de bioimagerie chimique à très haut contenu en information a des applications vastes et de grande portée.

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Protocole

1. L . préparation d’échantillons elegans et coloration Nile Red Vital

REMARQUE : C. elegans a été fortement utilisé pour de multiples techniques d’imagerie en raison de sa transparence sur l’ensemble du corps. Les organes et tissus internes peuvent être facilement imagés chez l’animal intact sans dissection. De plus, l’approbation éthique n’est pas requise pour la recherche impliquant C. elegans, car ils ne sont pas considérés comme des vertébrés et ne sont pas soumis aux mêmes réglementations éthiques que les animaux supérieurs comme les rongeurs. Cette section décrit la synchronisation des vers C. elegans et la préparation d’échantillons colorés en rouge du Nil pour l’imagerie par fluorescence. Des vers adultes d’un jour synchronisés sont obtenus via un protocole de ponte sur deux générations et colorés à l’aide de plaques Nile Red-OP50 fraîchement préparées.

  1. Maintenir les souches de C. elegans (p. ex., N2, LIU1, ldrIs1 [dhs-3p ::d hs-3 ::GFP + unc-76(+)]) sur des plaques de milieu de croissance de nématodes standard (NGM) ensemencées de bactéries OP50 à 20 °C.
  2. Synchroniser les vers
    1. Choisissez 10 à 20 vers adultes gravides sur une plaque NGM fraîchement ensemencée d’OP50.
    2. Incuber la plaque à 20 °C pendant 1 à 3 h pour permettre la ponte.
    3. Retirez tous les vers adultes, en ne laissant que les œufs fraîchement pondus sur la plaque.
    4. Incuber la plaque à 20 °C jusqu’à ce que les vers atteignent le stade adulte d’un jour.
    5. Répétez les étapes ci-dessus pour une génération supplémentaire afin d’améliorer la précision de la synchronisation.
  3. Préparer la solution mère de Nile Red
    1. Dissoudre 15,92 mg de rouge du Nil dans 10 mL de DMSO jusqu’à une concentration finale de 5 mM.
    2. Sonicate pendant 10 à 30 minutes si nécessaire pour faciliter la dissolution.
  4. Préparez les plaques de coloration Nile Red-OP50.
    1. Mélangez soigneusement la boue bactérienne OP50 avec la souche de rouge du Nil pour obtenir une concentration finale de 5 μM par plaque NGM. Par exemple, mélangez 10 μL de stock de rouge du Nil avec 20 μL de boue bactérienne OP50, puis appliquez immédiatement le tout le mélange sur une plaque de gélose NGM non ensemencée de 6 cm (avec un volume de ~10 ml) pour obtenir une concentration finale de rouge du Nil de 5 μM par plaque NGM.
    2. Répartissez le mélange uniformément sur des plaques NGM de 6 cm non ensemencées.
    3. Conservez les assiettes dans l’obscurité et à température ambiante pendant la nuit pour permettre la croissance bactérienne et l’absorption du colorant.
  5. Vers synchronisés avec les taches
    1. Transférez 30 à 50 vers adultes d’un jour synchronisés sur chaque plaque préparée de Nile Red-OP50.
    2. Incuber les vers dans l’obscurité à 20 °C pendant 1 à 2 h avant l’imagerie.
  6. Immobiliser les vers pour l’imagerie
    1. Appliquer une goutte de 100 mM d’azoture de sodium sur un tampon d’agarose à 2 % sur une lame de microscope (environ 10-15 μL pour 20 vers)
    2. Transférez les vers colorés dans l’agent anesthésique (azoture de sodium), déposez et recouvrez les vers avec une lamelle avant la microscopie.
      REMARQUE : Lorsque vous choisissez 10 à 20 adultes gravides sur une plaque NGM OP50 fraîchement préparée lors de la première étape de la synchronisation de la ponte, ne choisissez que les adultes, mais pas d’œufs ou de larves errants. Il s’agit de s’assurer que tous les œufs restants sur les assiettes sont produits par les vers cueillis dans la fenêtre de temps de ponte de 1 à 3 heures. De plus, l’azoture de sodium est classé comme une matière dangereuse, bien qu’il en nécessite une très petite quantité pour l’anesthésie des nématodes. L’utilisation et l’élimination des déchets d’azoture de sodium doivent suivre les directives du service de l’environnement, de la santé et de la sécurité de l’établissement.

2. Génération du faisceau de la sonde

REMARQUE : Ce protocole décrit la génération du faisceau de sonde picoseconde (ps) à l’aide d’un oscillateur paramétrique optique (OPO) fait maison, suivie d’une génération de seconde harmonique (SHG) avec un système de boucle de rétroaction de signal fabriqué à l’interne pour stabiliser la puissance de sortie du faisceau de sonde.

  1. Allumez le laser de pompe OPO de 1030 nm (Figure 3A ou le laser de pompe OPO proche de 1ps, ~3 W illustré à la Figure 4) et attendez au moins 2 h pour l’équilibrage thermique. Une sortie stable est essentielle pour le fonctionnement de l’OPA.
  2. Guider la sortie vers la cavité OPO
    1. Sélectionnez la période de polarisation appropriée sur le cristal OPO PPLN (Figure 3A) pour correspondre à la longueur d’onde du signal cible.
    2. Dirigez le faisceau dans le premier miroir incurvé (CM) (Figure 3A), faisant partie d’une cavité linéaire.
    3. Assurez-vous que le faisceau traverse le cristal de niobate de lithium (PPLN) à pôles périodiques OPO (Figure 3A) pour faciliter la conversion paramétrique optique descendante (Figure 3B).
    4. Assurez-vous que le faisceau se réfléchit sur un deuxième miroir incurvé (CM), puis sur le miroir d’extrémité (EM) (Figure 3A) pour former la boucle de la cavité.
    5. Configurez le coupleur de sortie (OC) (Figure 3A) pour extraire le faisceau de signal généré de la cavité.
  3. Réglez la température du quartz OPO PPLN à l’aide du contrôleur de température (TC) (Figure 3A) pour sélectionner la longueur d’onde du signal. Une longueur d’onde de signal typique est de 1530 nm, ce qui correspond à une puissance de sortie d’environ 0,8 W lorsqu’il est pompé avec 3 W à 1064 nm.
  4. Optimiser l’alignement OPO
    1. Ajustez la position et l’inclinaison de deux CM et de l’EM pour maximiser la puissance de sortie et la qualité du faisceau.
    2. Ajustez la longueur de la cavité pour déplacer le spectre du signal à la fréquence souhaitée.
  5. Acheminez le faisceau de signal OPO à travers un ensemble d’optiques de collimation et de focalisation et guidez-le dans l’étage SHG.
    1. Sélectionnez la période de polarisation appropriée sur le cristal SHG PPLN (Figure 3A) pour correspondre à la longueur d’onde du signal cible.
    2. Contrôlez avec précision la température du cristal à l’aide d’un contrôleur de température pour maximiser l’efficacité du SHG.
    3. Dirigez le faisceau dans le cristal SHG PPLN pour la génération de la deuxième harmonique, en convertissant le signal OPO de 1530 nm en 765 nm (Figure 3C). L’efficacité de conversion SHG typique est d’environ 30 % dans des conditions d’alignement optimales.
    4. Insérez un filtre passe-court de 1300 nm (SPF sur la figure 3A, spécifications dans la table des matériaux) après le SHG PPLN pour éliminer la lumière fondamentale résiduelle de 1530 nm.
    5. Collimater le faisceau de 765 nm résultant à l’aide d’une lentille appropriée (comme L sur la figure 3A).
  6. Stabilisation de la puissance de l’outil
    1. Utilisez une fenêtre de coin (WW) pour échantillonner le faisceau SHG et le diriger vers une photodiode ().
    2. Assurez-vous qu’une boucle de rétroaction compare le signal de la photodiode (dans la figure 3A) à une valeur de référence et actionne le picomoteur sur le miroir d’extrémité (EM) pour ajuster la longueur de la cavité OPO en temps réel, stabilisant ainsi la puissance de sortie SHG.
      REMARQUE : Pour déterminer la valeur de référence, balayez d’abord la position EM à l’aide du Picomoteur tout en enregistrant la puissance de sortie SHG. Identifiez l’intensité maximale dans ce profil, puis définissez la valeur de référence sur 90 % de la crête. Ce choix garantit une direction claire de correction de la rétroaction, ce qui permet au système de compenser les tendances à la hausse et à la baisse de la puissance et de stabiliser efficacement la puissance de sortie au fil du temps.

3. Génération de supercontinuum (SC) pour les BCAR

REMARQUE : La figure 4 illustre le schéma simplifié du système multimodal fondé sur le RNFPB. Ce protocole décrit la génération du faisceau SC.

  1. Ajustez le pré-chirp (Group Delay Dispersion, GDD) à la sortie d’impulsion femtoseconde (fs) (1030 nm, 150 fs, ~1 W) pour obtenir une bande passante SC suffisamment large couvrant les signaux de la région d’empreinte digitale (bande passante SC ≥ 1800 cm−1). Pour ce faire, ajustez la séparation d’une paire de réseaux (voir figure 4), ce qui permet un contrôle précis de la dispersion.
    REMARQUE : L’application d’un GDD pré-compensé est cruciale pour générer l’impulsion souhaitée et optimiser la génération de SC. La valeur GDD requise peut varier en fonction des caractéristiques spécifiques du système laser utilisé.
  2. Incorporer un télescope à faisceau composé de deux lentilles ayant les mêmes distances focales pour ajuster la divergence du faisceau de la pompe.
    REMARQUE : Lorsque le faisceau se déplace sur des mètres avant d’entrer dans la fibre d’élargissement, un contrôle précis de la divergence du faisceau devient essentiel. Le maintien d’un faisceau collimaté à cette distance est essentiel pour assurer une génération efficace de SC.
  3. Configurez l’aligneur automatique (Figure 4) à l’aide de supports de miroir cinématiques équipés d’actionneurs piézoélectriques pour l’orientation du faisceau. Combinez-les avec des sabots optiques et un détecteur de détection de position (PSD) pour surveiller et corriger activement l’alignement du faisceau.
  4. Positionnez les composants de telle sorte que la distance entre le coin et le premier miroir soit égale à la distance entre le coin et le premier PSD. Cette configuration symétrique assure la stabilité du pointage du faisceau dans la fibre en expansion.
    REMARQUE : L’alignement actif est essentiel pour maximiser l’efficacité de l’élargissement spectral et minimiser le risque d’endommagement de l’entrée de fibre.
  5. Utilisez une plaque demi-onde (HWP) et un séparateur de faisceau polarisant (PBS) pour contrôler la puissance du laser avant de le coupler dans la fibre. Tournez le HWP pour ajuster l’angle de polarisation par rapport au PBS, réglant ainsi la puissance transmise. Bien que ces composants ne soient pas illustrés à la figure 4, ils sont essentiels pour un alignement sûr et le contrôle de la puissance.
  6. Couplez environ 1 W de puissance laser dans une fibre à cristaux photoniques (PCF) LMA-PM-5 (Large-Mode-Area-Polarization Maintaining) de 10 cm à l’aide d’un coupleur de fibre. La procédure d’accouplement est la suivante :
    1. Tout d’abord, réduisez la puissance laser à ~20-50 mW lors de l’alignement initial pour éviter d’endommager la fibre.
    2. Dirigez le faisceau collimaté dans la fibre, en veillant à ce qu’une partie de la lumière émerge de l’autre côté. Optimisez la trajectoire du faisceau en ajustant sa position pour maximiser la puissance de sortie.
    3. Insérez la lentille asphérique (Figure 4), ajustez à nouveau le faisceau pour maximiser la puissance de sortie.
    4. Ajustez la position z de la lentille asphérique pour assurer une mise au point précise sur la facette de la fibre.
    5. Répétez les réglages d’alignement et de mise au point de manière itérative pour maximiser l’efficacité du couplage.
    6. Augmentez la puissance laser à 1 W pour le fonctionnement.
  7. Collimater la sortie du supercontinuum large bande (SC) résultante du PCF à l’aide d’un miroir parabolique hors axe (OAP) avec une distance focale f = 15 mm, comme illustré à la figure 4.
    REMARQUE : Les optiques réfléchissantes, telles que le miroir OAP, sont préférées pour les faisceaux à large bande afin de minimiser l’aberration chromatique introduite par les éléments réfractifs.
  8. Guidez la sortie du supercontinuum large bande (SC) collimaté dans un compresseur à prisme (Figure 4) composé d’une paire de prismes Schott Flint (SF10).
    1. Dirigez le faisceau SC vers le sommet du premier prisme pour initier la dispersion spectrale.
    2. Positionnez le deuxième prisme de telle sorte que le faisceau dispersé entre par son sommet.
    3. Montez les deux prismes sur un système de rail pour permettre un réglage grossier de la séparation des prismes. Déplacez le deuxième prisme le long du rail pour ajuster la longueur du chemin optique et la compression globale. La séparation pour ce système est de 44 cm.
    4. Montez le premier prisme sur une platine de translation linéaire de précision. Ajustez la profondeur d’insertion du premier prisme pour affiner la compensation de dispersion.
    5. Ajustez de manière itérative à la fois la séparation du prisme et la longueur d’insertion du deuxième prisme pour obtenir une compression temporelle optimale de l’impulsion SC. Déterminez la compression temporelle optimale en faisant correspondre le signal de mélange à quatre ondes dégénérées (DFWM) observé expérimentalement à des résultats simulés qui tiennent compte de la dispersion de retard de groupe (GDD) et de la dispersion de troisième ordre (TOD). Cette approche consiste à effectuer une simulation du processus de génération du supercontinuum, en incorporant les effets de GDD et de TOD, ce qui fournit une référence pour les caractéristiques temporelles et spectrales attendues des impulsions SC compressées de manière optimale. Ensuite, ajustez de manière itérative les paramètres du compresseur de prisme pour compenser le GDD et le TOD présents dans le système jusqu’à ce que le signal DFWM expérimental corresponde aux prédictions de simulation. Un résultat typique du profil spectral du SC est illustré à la figure 5.
      REMARQUE : Une compensation de dispersion appropriée améliore la cohérence spectrale du SC. Dans le cadre d’un alignement optimal, la sortie SC a une puissance d’environ 150 mW, une longueur d’onde centrale d’environ 1060 nm et couvre une gamme spectrale de 950 à 1200 nm (correspondant à 1800 cm−1). Ces valeurs peuvent varier légèrement en fonction de l’alignement et de l’efficacité du couplage des fibres.
  9. Combinez les faisceaux de la sonde et du supercontinuum à l’aide d’un miroir dichroïque (voir DM sur la figure 4). Alignez-les avec une paire de trous d’épingle pour vous assurer que les deux poutres sont colinéaires. Focaliser les faisceaux combinés sur une photodiode haute fréquence (bande passante de 1 GHz). Pour une qualité de signal optimale, les deux faisceaux doivent se chevaucher à la fois dans les domaines spatial et temporel. Le processus est le suivant :
    1. Dirigez la sortie de la photodiode vers un oscilloscope haute fréquence (bande passante de 500 MHz). Utilisez la gâchette laser comme horloge de référence.
    2. Bloquez le faisceau de la sonde et mesurez les impulsions SC. Enregistrez les différences temporelles entre les impulsions SC et la référence laser.
    3. Bloquez le faisceau SC et mesurez les impulsions de la sonde. Ajustez la ligne à retard mécanique (comme illustré à la figure 4) de sorte que les impulsions de la sonde se chevauchent avec les impulsions SC dans le temps. Assurez-vous que les deux faisceaux atteignent leur maximum simultanément.
    4. Retirez la photodiode et laissez le faisceau pénétrer dans le microscope.
      REMARQUE : Les étapes ci-dessus décrivent un réglage grossier pour le chevauchement des poutres. Une optimisation supplémentaire pour un alignement plus précis est abordée dans les étapes 6.1 à 6.9.

4. Configuration de la détection de fluorescence pour 2p-FLIM et TPEF et introduction d’un laser Ti :Sapphire fs supplémentaire

  1. Allumez le laser Ti :Sapphire et laissez-le atteindre l’équilibre thermique. Attendez environ 2 h pour assurer une puissance de sortie et un pointage du faisceau stables.
    REMARQUE : Dans cette étude, l’imagerie TPEF et FLIM a été réalisée à l’aide de la source SC, qui offre une large couverture spectrale et une puissance suffisante pour les fluorophores tels que GFP et Nile Red. Le laser Ti :Sapphire est inclus dans le système en tant que source d’excitation optionnelle pour les fluorophores avec des pics d’absorption de deux photons inférieurs à 950 nm, qui peuvent ne pas être efficacement excités par le SC.
  2. Activez le mécanisme de verrouillage de mode sur le laser Ti :Sapphire. Confirmez le verrouillage stable du mode via le moniteur intégré.
  3. Pré-bip des impulsions Ti :Sapphire pour une compression temporelle optimale au niveau de l’échantillon à l’aide d’un compresseur à prisme. Disposez les prismes dans une configuration similaire à celle décrite à l’étape 3.8 et ajustez la longueur d’insertion du deuxième prisme pour affiner la durée de l’impulsion.
    REMARQUE : Une compression temporelle appropriée garantit une intensité maximale et une excitation efficace à deux photons dans le plan de l’échantillon.
  4. (Facultatif) Couplez le faisceau Ti :Sapphire dans une fibre monomode de maintien de la polarisation si le laser est situé sur une table optique séparée. Ajustez l’optique de couplage d’entrée et surveillez la sortie de la fibre pour minimiser les pertes de couplage.
  5. Combinez le faisceau Ti :Sapphire avec le supercontinuum (SC) et les faisceaux de sonde à l’aide d’un miroir dichroïque (voir le point de combinaison à PBS montré dans la figure 3). Alignez soigneusement les faisceaux pour assurer le chevauchement spatial au niveau du dichroïque et la co-propagation vers le microscope.
  6. Guidez les faisceaux combinés vers le microscope et affinez leur chevauchement spatial. À l’aide d’un échantillon fluorescent (p. ex., une lame avec des billes de polystyrène fluorescent de 1 μm) pour vérifier l’alignement du faisceau Ti :Saphir par rapport à la trajectoire d’excitation du BCARS. Ajustez les miroirs d’alignement Ti :Sapphire pour vous assurer que l’émission de fluorescence est co-localisée avec le point focal BCARS dans le même champ d’imagerie. Confirmez la colocalisation en visualisant le chevauchement entre les images BCARS et TPEF acquises simultanément, où le décalage spatial doit être inférieur à un pixel.
    REMARQUE : Il est essentiel d’obtenir un chevauchement spatial entre les signaux de fluorescence et les signaux BCARS pour le recalage d’images multimodales.
  7. Insérez un miroir dichroïque avant l’entrée du microscope pour réfléchir la fluorescence rétrodiffusée vers le chemin de détection. Sélectionnez un dichroïque avec une longueur d’onde de coupure appropriée pour séparer efficacement la fluorescence des faisceaux d’excitation.
  8. Insérez un second miroir dichroïque en aval dans le trajet d’émission pour diviser le signal de fluorescence en deux branches de détection :
    1. Transmettez des longueurs d’onde ≥ 550 nm au détecteur FLIM.
    2. Réfléchissez les longueurs d’onde ≤ 550 nm vers un tube photomultiplicateur (PMT) pour la détection analogique par fluorescence excitée à deux photons (TPEF).
      REMARQUE : Installez des filtres passe-bande dans chaque branche de détection pour bloquer la lumière d’excitation résiduelle et isoler des bandes d’émission spécifiques.
  9. Connectez la sortie PMT à un préamplificateur et introduisez le signal analogique amplifié dans un périphérique d’acquisition de données (DAQ). Partagez le déclencheur de synchronisation globale du FPGA (Field Programmable Gate Array) avec l’DAQ pour garantir l’alignement temporel entre les modalités d’imagerie (Figure 7).
  10. Connectez la sortie du détecteur FLIM à un module de comptage de photons uniques corrélés dans le temps (TCSPC).
    1. Connectez le signal du détecteur FLIM à l’entrée de démarrage du module TCSPC.
    2. Connectez la sortie de synchronisation du laser Ti :Sapphire (ou BCARS SC) à l’entrée de référence du module TCSPC.
    3. Connectez le déclencheur de caméra global (généré par le FPGA) à l’entrée de synchronisation d’image du module TCSPC pour synchroniser avec l’acquisition d’images à balayage linéaire.

5. Configuration du chemin de détection BCARS

REMARQUE : Ce protocole décrit la configuration d’un chemin de détection désançonné pour l’imagerie hyperspectrale à balayage linéaire. Le miroir galvo 1D balaie le faisceau d’excitation le long de l’axe y avec un temps de séjour de 2 à 4 ms par pixel pour une intégration suffisante du signal. Après chaque balayage linéaire, l’étage d’échantillonnage avance d’un pas le long de l’axe des x. Le débalayage à l’aide d’un miroir galvo secondaire synchronisé est essentiel pour maintenir un recalage spatial cohérent du signal spectral sur la caméra lors d’un balayage rapide du faisceau, éliminant ainsi la diaphonie du signal entre les pixels adjacents et préservant la fidélité spatio-spectrale39.

  1. Introduire le supercontinuum (SC) et les faisceaux de sonde dans un scanner galvo unidimensionnel (1D) (comme le montre la figure 4 et plus de détails dans la référence39). Positionnez le miroir galvo conjugué à l’ouverture arrière de l’objectif de mise au point pour permettre un balayage précis du faisceau dans le champ de vision.
  2. Élargissez chaque faisceau à l’aide d’un expanseur de faisceau réfléchissant (comme illustré à la figure 4) pour correspondre à l’ouverture arrière de l’objectif d’excitation. Cela garantit une mise au point optimale et une résolution spatiale maximale au niveau du plan d’échantillonnage.
    REMARQUE : Utilisez des optiques réfléchissantes pour minimiser l’aberration chromatique et maintenir le contenu spectral à large bande du faisceau SC.
  3. Placez une cible d’alignement sur le plan d’ouverture arrière de l’objectif d’excitation. Ajustez les faisceaux SC et de sonde de manière à ce qu’ils passent par le centre de la cible, en assurant le co-alignement le long de l’axe optique.
    REMARQUE : Le chevauchement spatial précis maximise la force du signal BCARS et garantit une résolution spatiale maximale au point focal.
  4. Focaliser les faisceaux sur l’échantillon à l’aide d’un objectif d’excitation à forte ouverture numérique (par exemple, 1,2 NA, objectif à immersion dans l’eau 60x) monté sur un microscope inversé.
  5. Préparez un échantillon d’alignement en prenant en sandwich une goutte d’eau entre deux lamelles pour créer une lame de microscope scellée. Placez la lame préparée sur la platine du microscope et ajustez la mise au point pour afficher l’échantillon.
  6. Collecter le signal anti-Stokes généré en transmission à l’aide d’un objectif de collecte placé à l’opposé du chemin d’excitation.
  7. Mettre en œuvre un système de débalayage 4f (comme le montre la figure 4) pour préserver la cartographie spatiale du signal anti-Stokes sur les rangées fixes du détecteur.
    1. Relayer le plan focal arrière (BFP) de l’objectif de collecte sur l’axe du miroir galvo de débalayage à l’aide d’un système optique 4f. Il se compose de deux lentilles tubulaires de précision (voir tableau des matériaux), disposées de telle sorte que :
      1. La première lentille est placée à une distance focale (200 mm) après le BFP de l’objectif de collecte.
      2. La deuxième lentille est placée à une distance focale avant le miroir galvo.
    2. Synchronisez le galvo de débalayage avec le galvo de balayage à l’aide d’un générateur de formes d’onde contrôlé par FPGA.
    3. Intégrez un potentiomètre numérique 7 bits dans le système de contrôle FPGA pour permettre le réglage de l’amplitude galvo de débalayage.
      REMARQUE : Le miroir galvo de débalayage compense les déviations angulaires introduites par le galvo de balayage primaire. En ajustant dynamiquement son angle de manière synchronisée, il contrecarre le mouvement du faisceau, en veillant à ce que le signal anti-Stokes reste aligné le long de l’axe optique menant au spectromètre. Cette stabilisation est essentielle pour maintenir le recalage spatial sur le détecteur et éviter le déplacement latéral de l’image spectrale pendant le balayage.
  8. Configurez le système FPGA (voir Tableau des matériaux) pour synchroniser le balayage galvo et le déclenchement de la caméra.
    1. Générer des sorties analogiques pour le balayage et le débalayage des galvos.
    2. Acceptez un déclencheur d’étage d’entrée pour marquer le début de chaque balayage de ligne.
    3. La capture de trame de sortie déclenche des signaux vers la caméra scientifique sCMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) à chaque position de balayage.
    4. Contrôlez indépendamment l’amplitude de débalayage pour s’adapter à différents objectifs de collecte.
      REMARQUE : un train d’impulsions FPGA typique comprend un signal d’entraînement galvo à balayage, un signal d’entraînement galvo à débalayage, une entrée de déclenchement d’étage et une horloge à pixels pour la synchronisation des trames.
  9. Faites passer le signal anti-Stokes collimaté à travers deux filtres passe-court pour bloquer la pompe résiduelle et la lumière d’excitation SC.
  10. Focalisez le signal anti-Stokes filtré à travers la fente d’entrée du spectromètre et sur le détecteur sCMOS. Ajustez les angles des galvos de balayage et de débalayage pour vous assurer que le faisceau est balayé parallèlement à l’axe long de la fente, en alignant le plan de l’image optique avec la fente. Cet alignement précis maximise la résolution spectrale et minimise la diaphonie latérale du signal entre les rangées du détecteur.
  11. Configurez le spectromètre pour disperser le spectre anti-Stokes verticalement le long des rangées de caméras. Sélectionnez un réseau approprié (par exemple, 300 lignes/mm, blasé à 700 nm) pour une couverture spectrale optimale.

6. Optimisation du signal et étalonnage de la résolution spectrale

  1. Lancez le logiciel d’acquisition maison et commencez la surveillance du signal en temps réel à partir de la caméra sCMOS. Le logiciel d’acquisition est construit en Python 3.8+ (Windows 10) avec des dépendances comprenant Hamamatsu DCAM-API et les pilotes de la bibliothèque universelle de calcul de mesure, sortant des données au format HDF5. Le logiciel est disponible sur demande raisonnable de l’auteur correspondant.
  2. Préparez un échantillon d’étalonnage spectral en plaçant une goutte de benzonitrile entre deux lamelles pour former une lame scellée. Placez la lame sur la platine du microscope et faites-la correspondre à l’aide de l’objectif d’excitation.
  3. Localisez le signal BCARS sur la caméra sCMOS. Ajustez la position z de l’objectif de collecte pour maximiser l’intensité du signal anti-Stokes.
  4. Ajustez la position latérale de l’objectif de collecte pour vous assurer que la lumière anti-Stokes est correctement focalisée à travers la fente d’entrée du spectromètre. Cet alignement assure un couplage optimal avec le spectromètre et une meilleure fidélité spectrale.
  5. Optimiser le chevauchement spatial entre le supercontinuum (SC) et les faisceaux de sonde au niveau du plan de l’échantillon. Utilisez des miroirs dans la trajectoire du faisceau de la sonde pour ajuster avec précision sa position latérale et son angle d’incident.
  6. Traduisez la ligne à retard optique dans le trajet du faisceau de la sonde pour assurer le chevauchement temporel avec les impulsions SC. Surveillez l’intensité du signal et ajustez-la jusqu’à ce que le signal anti-Stokes soit maximisé, confirmant ainsi une synchronisation temporelle correcte.
  7. Identifiez un pic Raman fort et net dans le benzonitrile (par exemple, 1002 cm-1) sur l’image sCMOS.
  8. Enregistrez la longueur d’onde de la sonde et la position correspondante de ses pixels sur la caméra. Utilisez la raie de Rayleigh (0 cm-1 à la longueur d’onde de la sonde) et les pics Raman de benzonitrile connus à 1002 cm-1 et 3073 cm-1 pour établir une cartographie linéaire pixel-numéro d’onde à travers le détecteur sCMOS. La raie de Rayleigh fournit la référence du numéro d’onde zéro, tandis que les pics de benzonitrile déterminent l’incrément du numéro d’onde par pixel.
    REMARQUE : Étant donné que l’analyse ne nécessite que des informations relatives sur le nombre d’onde (correspondance entre la position du pixel et le décalage Raman), l’étalonnage absolu de la longueur d’onde à l’aide de lampes à émission n’est pas nécessaire.
  9. Entrez le mappage pixel-numéro d’onde dans le logiciel d’acquisition. Cet étalonnage doit rester valide à moins que des modifications ne soient apportées au chemin optique, au réglage du réseau dans le spectromètre ou à l’alignement.

7. Acquisition du signal

  1. Chargez l’échantillon de C. elegans préparé aux étapes 1.1 à 1.6 sur la platine du microscope. Localisez une région d’intérêt et mettez-la au point à l’aide de l’objectif d’excitation.
  2. Identifiez une région de la diapositive qui n’a pas de signal actif Raman (fond d’eau ou lamelle en verre nu) pour servir de référence de fond non résonnant (NRB).
  3. Localisez le signal BCARS sur le détecteur sCMOS. Ajustez la position z de l’objectif de collecte pour maximiser l’intensité du signal anti-Stokes.
  4. Ajustez la position latérale de l’objectif de collecte pour vous assurer que la lumière anti-Stokes est correctement alignée à travers la fente d’entrée du spectromètre.
  5. Démarrez le balayage et le débalayage synchronisés des miroirs galvo à l’aide du FPGA. Ajustez l’amplitude du galvo de débalayage à l’aide du potentiomètre numérique jusqu’à ce que la déviation angulaire du balayage primaire soit entièrement compensée. Le signal anti-Stokes doit rester confiné dans ~12 rangées sur la caméra sur toute la plage de balayage.
  6. Définition d’une séquence d’acquisition temporelle
    1. Acquisition d’un signal de corrélation croisée entre les impulsions SC et de la sonde en retardant l’impulsion de la sonde. Pour l’acquérir, tracez le signal BCARS tricolore intégré en fonction de la temporisation de l’impulsion de la sonde. Le signal le plus fort apparaîtra au temps 0 lorsque les impulsions SC et de la sonde se chevauchent temporellement.
      REMARQUE : Étant donné que les systèmes de détection FLIM et TPEF partagent le même déclencheur que les BCARS, leurs signaux sont acquis simultanément pendant ce point.
    2. Enregistrer à un retard ultérieur du faisceau de la sonde (par exemple, 1-2 ps) pour les BCARS et un retard ultérieur du faisceau SC pour le bruit de fond non résonant (spectres NRB dans la figure 6A). Lorsqu’une temporisation est appliquée à l’impulsion à bande étroite (sonde), le NRB dans le signal CARS tricolore peut être efficacement supprimé, et donc le rapport signal/bruit peut être amélioré67.
    3. Acquérez une image sombre sans chevauchement temporel entre le SC et la sonde pour capturer le bruit de base du détecteur (référence sombre).
    4. Enregistrez toutes les images BCARS, NRB et sombres, y compris les métadonnées, dans un seul fichier h5.
  7. Protocole de traitement du signal BCARS
    1. Ouvrez le logiciel CRIkit268.
    2. Chargez tous les jeux de données nécessaires à l’aide de l’outil Open HDF, comme illustré à la figure 6B : Charger les données hyperspectrales BCARS, la référence NRB et la référence sombre. Sélectionnez la région de fréquence dans la bande passante de génération du signal BCARS à l’aide de l’outil Fenêtre de fréquence (de 400 cm-1 à ≥ 3200 cm-1 pour le système BCARS illustré ici).
    3. Effectuez les étapes de prétraitement :
      1. Utilisez l’outil Anscombe (comme le montre la figure 6B) pour stabiliser la variance des ensembles de données BCARS et NRB.
      2. Utilisez l’outil de réduction du bruit pour effectuer une décomposition en valeurs singulières (SVD) : conservez les composants principaux en fonction de l’inspection visuelle. Conservez les composants présentant des distributions spatiales correspondant à la morphologie de l’échantillon et éliminez les composants dominés par un bruit non structuré ou chatoié. Cette étape de débruitage améliore le rapport signal/bruit (SNR), en particulier pour les caractéristiques spectrales de faible intensité.
      3. Utilisez l’outil Anscombe inverse pour restaurer les données dans leur domaine d’origine.
        REMARQUE : ces étapes peuvent être ignorées si vous effectuez un traitement en temps réel lors de l’acquisition.
    4. Récupérez des spectres de type Raman à l’aide de la transformée de Kramers-Kronig (KK) :
      1. Ouvrez l’outil KK (comme illustré à la Figure 6B).
      2. Activez Norm to NRB pour garantir une normalisation de référence spectrale appropriée.
      3. Définissez des paramètres tels que le biais NRB, le facteur de pad et la moyenne des pixels de bord.
      4. Exécutez la transformation KK pour obtenir les spectres Raman récupérés.
    5. Effectuer des corrections d’erreurs post-KK
      1. Corriger les erreurs de phase à l’aide du lissage Savitzky-Golay : ouvrez l’outil de correction d’erreur de phase (Figure 6B). Ajustez la taille de la fenêtre de lissage et l’ordre polynomial. Inspectez les spectres d’origine par rapport aux spectres corrigés à l’aide du panneau de prévisualisation .
      2. Corriger les erreurs d’échelle : ouvrez l’outil de correction d’erreur d’échelle (Figure 6B). Normalisez les spectres pour corriger l’échelle de l’intensité relative dans l’ensemble de données. Assurez la cohérence entre les dimensions spatiales et spectrales.
    6. Étalonnage de l’axe spectral (facultatif, s’il n’est pas aligné) : Ouvrez l’outil d’étalonnage (Figure 6B). Comparez les numéros d’onde mesurés aux pics de référence connus. Appliquez la pente/l’ordonnée à l’origine corrigée pour réaligner l’axe spectral.
    7. Définir et extraire des données à partir de régions d’intérêt (ROI)
      1. Utilisez le ROI Spect. ou Pt Spect. (figure 6B) pour marquer les régions spatiales d’intérêt ou les points d’intérêt dans l’image du RNFPB.
      2. Visualisez et comparez le contenu spectral de différents ROI.
      3. Exportez les spectres récupérés pour une analyse quantitative ou chimiométrique plus approfondie.

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Résultats

La figure 5 montre les spectres mesurés de la sonde à bande étroite et des impulsions du supercontinuum à large bande (SC) utilisées pour l’excitation des BCARS. L’impulsion de la sonde, générée par la génération de seconde harmonique d’un signal de ~1530 nm à partir d’un oscillateur paramétrique optique fait maison (OPO, Figure 3), est centrée à 764,2 nm avec une largeur totale à mi-hauteur (FWHM) de 0,2 nm, fournissant la résolution spectrale à ~6,8 <...

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Discussion

Ce travail démontre en détail l’architecture du BCARS et de la plateforme d’imagerie 2p-FLIM/TPEF. Alors qu’un laser à double sortie de 1030 nm est utilisé dans notre configuration actuelle, la plupart des lasers à fibre fs 1030 nm haute puissance peuvent être utilisés comme source laser maîtresse pour la construction d’un microscope BCARS. En choisissant soigneusement la longueur et la période des cristaux OPO/SHG PPLN, il est possible de générer une impulsion de sonde de quelques ps av...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer et n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

W-W.C. remercie les NIH (R21AG086974). M.T.C. remercie le département de l’Énergie des États-Unis (DOE BERDE-SC0022121).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CaméraHamamatsuORCA-FusionsCMOS, 2304× ; 2304 pixels (en anglais)
Objectif de la collecte  ; Olympe  ; LUMPLFLN60XW  ; Immersion dans l’eau, 1.0 NA
DAQ  ; Diligent  ; MCC USB-1208HS  ; carte d’acquisition de données
Ligne à retard  ; Newport  ; DL225  ; Retard mécanique pour l’impulsion de la sonde
Dichroïque  ; Semrock  ; FF925-DI01  ; combinaison de sonde et de SC
Dichroïque  ; Semrock  ; FF705-Di01  ; Détection de la fluorescence en mode épi
Dichroïque  ; Thorlabs  ; DMLP550R  ; séparation du signal FLIM et du signal TPEF
Objectif d’excitation  ; Olympe  ; UPLSAPO60XWIR  ; Immersion dans l’eau, 1.2 NA
Filtre  ; Semrock  ; FF01-1326/SP-25  ; Rejeter le laser fondamental après SHG
Filtre  ; Semrock  ; Réf. FF01-758/SP  ; Rejeter le laser fondamental avant la caméra BCARS
Filtre  ; Thorlabs  ; FESH0650  ; Rejeter le laser fondamental avant la modalité de fluorescence
FLIM PMT  ; PicoQuant  ; PMA Hybride  ; Détecteur de photons uniques FLIM
FPGA  ; Redpitaya  ; STEMlab 125-14  ; Synchronisation et déclenchement du balayage
Galvo  ; Thorlabs  ; GVS101  ; Pour le balayage et le débalayage
Grille  ; Cohérent  ; LumièreSmyth 1040nm  ; 1000 rainures/mm, pré-chirp pour SC
Plaque demi-ondulée  ; Thorlabs  ; AHWP05M-980  ; Contrôle de la polarisation
K-cube  ; Thorlabs  ; KPA101  ;Pilote PSD pour l’aligneur automatique
Laser  ; Instruments prospectifs  ; FSX-Double  ; Laser femtoseconde à double sortie
Laser  ; Cohérent  ; Mira-900  ; Laser femtoseconde pour l’excitation par fluorescence
PBS  ; Thorlabs  ; PBS255 (en anglais)  ; Combinaison de faisceaux pour SC et sonde
Le  ; Thorlabs  ; LMA-PM-5  ; Fibre à cristaux photoniques de 10 cm pour la génération SC
Maladie de Parkinson  ; Thorlabs  ; PDA100A2  ; Boucle de rétroaction OPO
Support de miroir piézoélectrique  ; Thorlabs  ; POLARIS-K1S2P  ; Ajusteur piézoélectrique pour l’auto-aligneur
Préampli  ; EdmundOptics  ; 59-179  ; Préamplificateur TPEF
Prisme  ; Optique Lambda Research  ; EQP-30SF10  ; Compression SC
DSP  ; Thorlabs  ; PDQ80A  ; Détecteur sensible à la position pour l’aligneur automatique
Spectromètre  ; Teledyne Princeton Instruments  ; IsoPlane 160  ; Caillebotis de 300 g/mm, centré à 700 nm
Étape  ; L’ASI  ; MS-2000  ; Platine 3 axes motorisée
Le  ; PicoQuant  ; MultiHarp 150  ; Dispositif de comptage de photons pour FLIM
TPEF PMT  ; Hamamatsu  ; N° H9305-03  ; Détecteur TPEF
Lentille tube  ; Thorlabs  ; TL200-2P2  ; Utilisé dans le système de débalayage

Références

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