Normalisation de la libération de glycérol basée sur le MTT pour une quantification précise de la lipolyse dans les adipocytes épididymaires primaires du rat

Summary

Les artefacts expérimentaux, y compris les fluctuations de la viabilité cellulaire et l’interférence du test, entravent la quantification précise de la libération de glycérol dans les adipocytes primaires riches en lipides. Pour atténuer ces défis, une stratégie de normalisation basée sur le MTT est utilisée pour ajuster les mesures de glycérol en fonction de l’activité métabolique cellulaire, améliorant ainsi la fiabilité de la quantification de la lipolyse.

Abstract

La lipolyse, une voie métabolique critique, implique l’hydrolyse des triglycérides stockés en acides gras libres et en glycérol. Cependant, la quantification précise de la production de glycérol dans les adipocytes primaires riches en lipides est souvent faussée par des artefacts expérimentaux, tels que la variabilité de la viabilité cellulaire et l’interférence du test. Pour remédier à ces limites, une méthode simple a été mise au point pour normaliser les mesures de libération de glycérol à l’aide de l’essai de viabilité cellulaire basé sur le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Ce protocole exploite la différence de densité entre les adipocytes et les solutions aqueuses, permettant la quantification simultanée de la production lipolytique et de la viabilité cellulaire. Dans les expériences de dépistage de médicaments, la pravastatine et la simvastatine ont significativement augmenté la libération de glycérol par les adipocytes abdominaux, tandis que l’atorvastatine et la lovastatine n’ont pas modifié de manière significative la production de glycérol. Ces résultats suggèrent que la normalisation basée sur le MTT offre une approche robuste et pratique pour quantifier avec précision la lipolyse, avec des applications potentielles dans la découverte de médicaments ciblant l’obésité et le syndrome métabolique. Cette étude souligne la nécessité de réévaluer les tests de lipolyse conventionnels pour distinguer les réponses métaboliques authentiques des fuites membranaires non spécifiques.

Introduction

Le tissu adipeux peut être divisé en tissu adipeux blanc (WAT) et tissu adipeux brun (BAT)¹. WAT remplit la fonction de stockage d’énergie excédentaire sous forme de triglycérides, tandis que BAT a la fonction de générer de la chaleur pour maintenir la température corporelle, qui convertit l’énergie chimique en énergie thermique sous la stimulation du froid¹. Le tissu adipeux a également une fonction endocrinienne². Il peut sécréter une variété d’hormones, de cytokines et de métabolites (collectivement appelés adipokines) et contrôler l’équilibre énergétique du corps en régulant le comportement de recherche de nourriture du système nerveux central et l’activité métabolique des tissus environnants².

La lipolyse est un processus d’hydrolyse étape par étape des lipides intracellulaires sous l’action d’une série d’enzymes lipolytiques ^3,4. Dans les adipocytes, les lipides sont principalement stockés dans des gouttelettes lipidiques sous forme de triglycérides⁵. Les gouttelettes lipidiques sont recouvertes de la famille des protéines périlipines, qui empêche l’hydrolyse des triglycérides par les enzymes lipolytiques ^6,7. Cependant, lorsque le signal de lipolyse est amélioré, les niveaux d’expression de la famille des périlipins dans les adipocytes sont diminués et les enzymes lipolytiques pénètrent dans les gouttelettes lipidiques ^3,4. Par conséquent, les triglycérides sont décomposés en glycérol et en acides gras libres ^3,4,5.

La lipolyse, c’est-à-dire la décomposition des triglycérides stockés en glycérol et en acides gras libres, est un processus fondamental dans le métabolisme des adipocytes⁸. Bien que la mesure directe des produits de lipolyse tels que le glycérol fournisse des informations précieuses, la quantification précise a été difficile, en particulier dans les adipocytes primaires en suspension en raison d’erreurs opérationnelles résultant de différences dans le nombre de cellules entre les groupes expérimentaux. Cette étude visait à relever ce défi en utilisant un test de viabilité cellulaire pour normaliser la quantification de la libération de glycérol par les adipocytes abdominaux primaires de rat. En normalisant la méthode de mesure, le test de libération normalisée de glycérol a été appliqué comme outil potentiel pour la découverte de médicaments ciblant l’obésité et le syndrome métabolique dans les adipocytes.

Protocol

Ce protocole exploite la différence de densité entre les adipocytes et les solutions aqueuses pour permettre la mesure simultanée de la libération de glycérol (en tant qu’indicateur de lipolyse) et de la viabilité cellulaire du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) dans les mêmes puits d’une plaque de 96 puits, rationalisant ainsi le flux de travail expérimental et améliorant l’efficacité.

Toutes les procédures sur les animaux étaient conformes aux lignes directrices d’ARRIVE et ont été effectuées conformément au Guide des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication NIH n° 8023, révisée en 1978). Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (numéro d’approbation 202112, approuvé le 5 mai 2021). Les rats Wistar mâles utilisés dans cette étude étaient âgés d’au moins 8 semaines et pesaient ≥ 200 g dans des conditions de logement standard. Du tissu adipeux blanc épididymaire a été prélevé avec des rendements typiques de 0,6 à 0,8 g par rat. Notamment, les rats plus âgés ou ceux nourris avec des régimes riches en graisses présentaient une augmentation significative de la masse de tissu adipeux blanc (souvent de 1,5 à 3 g), nécessitant un ajustement proportionnel des concentrations d’enzymes de digestion (par exemple, la collagénase) pour maintenir une efficacité de dissociation tissulaire constante. L’utilisation exclusive de rats mâles a permis d’éviter les effets confusionnels potentiels des fluctuations hormonales du cycle œstral féminin. La sélection des souches (p. ex., Sprague-Dawley, Wistar ou Long-Evans) a été maintenue de manière cohérente dans les expériences afin d’assurer l’uniformité génétique des réponses du tissu adipeux. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Isolement des adipocytes abdominaux primaires du rat

1. Anesthésier un rat Wistar adulte mâle avec une injection intrapéritonéale d’hydrate de chloral à 7 % (dissous dans du H₂O distillé) (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
2. Confirmez l’anesthésie complète en vérifiant l’absence de réponses réflexes, puis faites une incision abdominale médiane à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles.
3. Retirez soigneusement le tissu adipeux viscéral des côtés gauche et droit du coussinet adipeux de l’épididyme.
   REMARQUE : Les adipocytes épididymaires sont relativement grands et flottants, ce qui facilite la séparation et l’analyse.
4. Transférez le tissu collecté dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; Figure 1A).
5. Lavez le tissu deux fois avec du PBS pour éliminer les impuretés, y compris les vaisseaux sanguins collés et les caillots sanguins.
6. Coupez le tissu lavé en petits morceaux.

2. Purification des adipocytes abdominaux primaires du rat

1. Incuber le tissu adipeux disséqué avec de la trypsine et de la collagénase de type II (10 mg dans une solution de trypsine de 10 ml) à 37 °C pendant 2 h en agitant.
2. Filtrez le tissu adipeux digéré à travers une passoire cellulaire (Figure 1A).
3. Centrifuger le filtrat à 120 × g pendant 3 min à température ambiante pour éliminer l’activité enzymatique résiduelle.
4. Transférez les adipocytes en suspension (la couche blanche supérieure) dans un tube propre et lavez-les avec du PBS.
5. Centrifuger le filtrat à 120 × g pendant 3 min à température ambiante pour éliminer le PBS.
6. Incuber les adipocytes filtrés (la couche blanche supérieure) dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par une solution de sérum de veau fœtal à 10 % et de pénicilline-streptomycine à 1 %, pendant pas plus de 30 minutes.

3. Analyse de la libération de glycérol

1. Ensemencez les adipocytes filtrés (10^{4-10 5} cellules par puits ; 200 μL) dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits.
   REMARQUE : Les adipocytes ont été quantifiés à l’aide d’un hémocytomètre standard. En raison de la grande variation de la taille des adipocytes, certaines cellules plus grandes n’ont pas pu être comptées avec précision. Par conséquent, le nombre de cellules peut ne pas refléter précisément le nombre réel d’adipocytes. L’objectif principal était d’obtenir une distribution uniforme des cellules entre les puits plutôt qu’une quantification exacte.
2. Traitez les adipocytes avec 0,05 % de diméthylsulfoxyde (DMSO ; en tant que groupe témoin) et 50 μM d’atorvastatine, de pravastatine, de lovastatine et de simvastatine pendant 4 h à 37 °C sous une légère agitation.
   REMARQUE : Ces conditions de traitement sont fournies à titre de référence et peuvent être ajustées au besoin en fonction des objectifs spécifiques et de la conception de l’expérience.
3. Prélever le milieu de culture cellulaire (la couche rouge inférieure) pour analyser la libération de glycérol, ce qui indique le début de la lipolyse (Figure 1B).
4. Utilisez un kit de dosage de libération de glycérol commercial pour évaluer la lipolyse adipocytaire en réponse à différents traitements.
5. Mesurez l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

4. Analyse de la viabilité cellulaire

1. Dissoudre la poudre de MTT à une concentration de 5 mg/mL dans du H₂O distillé et stériliser à travers un filtre de 0,22 μm avant utilisation.
2. Après l’analyse de libération de glycérol, ajouter la solution de MTT (jusqu’à 0,5 mg/mL) dans les cellules et incuber à 37 °C pendant 2 h.
3. Transférez les adipocytes en suspension (la couche violette supérieure) dans un tube propre contenant du DMSO pour l’analyse de la viabilité cellulaire (Figure 1B).
4. Vortex brièvement pour solubiliser les cristaux de formazan pourpre formés.
5. Mesurez l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

5. Calcul de la normalisation

1. Effectuez toutes les expériences en trois exemplaires et répétez l’opération quatre fois (n = 4).
   REMARQUE : Pour chaque expérience indépendante (n = 4), les adipocytes ont été isolés chez trois rats, et chaque condition de traitement a été réalisée en trois exemplaires.
2. Pour chaque groupe de traitement, divisez la valeur d’absorbance de libération de glycérol par la valeur d’absorbance de viabilité cellulaire correspondante.
3. Présentez les données sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET).
   REMARQUE : La moyenne et l’écart-type ont été calculés à l’aide de Microsoft Excel avec les fonctions =AVERAGE(range) et =STDEV. S(plage). Pour les comparaisons de groupes, des tests t bilatéraux non appariés ont été effectués à l’aide de GraphPad Prism 6 avec le test t de fonction des moyennes de comparaison.
4. Déterminez la signification statistique des différences entre les groupes à l’aide du test t de Student, avec une valeur P inférieure à 0,05 considérée comme statistiquement significative.

Results

Après un criblage préliminaire de médicaments, les statines antihyperlipidémiques ont été utilisées pour étudier les effets lipolytiques dans les adipocytes par la méthode de libération normalisée de glycérol⁹.

L’impact des statines sur la libération de glycérol par les adipocytes abdominaux primaires du rat
L’effet des statines sur la lipolyse dans les adipocytes abdominaux primaires du rat a été évalué en traitant les cellules avec 50 μM de pravast...

Discussion

Cette étude fournit une méthode plus précise pour mesurer la lipolyse dans les adipocytes primaires chargés de lipides. Il a été constaté que la pravastatine et la simvastatine induisaient la libération de glycérol et réduisaient la viabilité dans les adipocytes épididymaires du rat, tandis que l’atorvastatine et la lovastatine n’ont montré aucun effet significatif. L’administration de simvastatine a entraîné une augmentation minime de la libération de glycérol par les adipocytes. Pour r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 et micro ; Filtre M	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513165-0001	filtre à seringue, système Aquo, stérile
bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium  ;	Sangon Biotech Co. Ltd.	A600799-0001	1 g
Plaques de culture cellulaire à 96 puits  ;	Sangon Biotech Co. Ltd.	F603204-0001	stérile
Atorvastatine sel de calcium	Cayman Chemical	10493-5	5 mg
Passoire à cellules  ;	Sangon Biotech Co. Ltd.	F513450-0001	80 maille d’écran
Hydrate de chloral	Sangon Biotech Co. Ltd.	A500288-0250	250 grammes
Diméthylsulfoxyde	Sangon Biotech Co. Ltd.	A460700-0100	100 ml
Aigle modifié de Dulbecco  ;	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600003	500 ml, hyperglucose, stérile
Sérum fœtal bovin	Sangon Biotech Co. Ltd.	E600001	100 ml, stérile
Kit de dosage colorimétrique du glycérol	Cayman Chemical	10010755-96	96 puits
Lovastatine	Cayman Chemical	10010338-5	5 mg
Rats adultes mâles  ;	Université de Putian	Wistar	environ 10-12 semaines
Solution de pénicilline-streptomycine  ;	Sangon Biotech Co. Ltd.	B540732-0010	10 ml, stérile
Solution saline tamponnée au phosphate	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607009-0500	500 ml, stérile, sans calcium ni magnésium
Sel de sodium de pravastatine	Cayman Chemical	10010343-5	5 mg
Simvastatine  ;	Cayman Chemical	10010344-5	5 mg
Solution de trypsine  ;	Sangon Biotech Co. Ltd.	E607003-0100	100 ml, sans EDTA ni rouge de phénol, stérile
Collagénase de type II  ;	Sangon Biotech Co. Ltd.	A004174-0100	100 mg