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Article de méthode

Mesure de la perméabilité de la barrière intestinale en détectant le flux de traceurs fluorescents à travers des monocouches de coloïdes humains

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DOI :

10.3791/68857

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17 octobre 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une technique de mesure de l’intégrité de la barrière intestinale, dans laquelle le taux de translocation d’un sucre marqué par fluorescence de taille connue reflète la perméabilité des coloïdes intestinaux humains dérivés de tissus.

Résumé

La barrière intestinale est un site critique de régulation entre les antigènes luminaux et le système immunitaire de l’hôte, et sa dérégulation est impliquée dans de multiples maladies gastro-intestinales. Les organoïdes intestinaux peuvent être un outil utile pour comprendre et modéliser les différences dans l’intégrité de la barrière intestinale. Ici, nous décrivons un protocole qui utilise des colonoïdes humains pour quantifier les différences fonctionnelles de la barrière intestinale en mesurant le flux de traceurs fluorescents à travers les monocouches d’organoïdes. Après avoir fait croître les monocouches jusqu’à la confluence, nous ajoutons un traceur fluorescent, tel que le FITC-dextran, à la chambre apicale et détectons sa translocation dans la chambre basolatérale au fil du temps. L’augmentation de la translocation du traceur fluorescent reflète une barrière épithéliale plus perméable ou plus faible. Ce protocole est une plateforme adaptable qui permet d’évaluer les différences fonctionnelles de la barrière intestinale dans plusieurs conditions en parallèle. En utilisant des variantes de ce protocole, on peut évaluer la perméabilité transépithéliale à des molécules de taille, de forme et de structure chimique variées, ainsi que les différences de perméabilité dans le contexte de traitements isolés ou de changements microenvironnementaux sur les côtés apical ou basolatéral des cellules épithéliales. Cela permet une compréhension plus approfondie du mécanisme et du traitement de la rupture de la barrière dans les états pathologiques.

Introduction

La muqueuse intestinale est une structure complexe qui joue un rôle important dans la régulation du contact entre les métabolites, les antigènes et les microbes dans la lumière intestinale et le système immunitaire et la circulation entérique. Les cellules épithéliales intestinales sont un élément clé de ce système et, dans des conditions saines, forment une barrière hautement sélective. Le transport à travers l’épithélium peut se faire par de multiples mécanismes : transport actif ou passif transcellulaire, pores paracellulaires ou voies de fuite régulées par des jonctions serrées et des jonctions adhérentes. La question de savoir si l’une de ces voies peut être utilisée par une molécule pour se déplacer à travers l’épithélium est déterminée par l’hydrophobie, la taille et la structure chimique. Une fois à travers l’épithélium, ces molécules peuvent interagir plus facilement avec les cellules immunitaires de la muqueuse et pénétrer dans la circulation sanguine ou lymphatique de l’intestin 1,2 La perturbation de la barrière intestinale est une caractéristique de plusieurs maladies gastro-intestinales inflammatoires, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin et la maladie cœliaque 1,3,4,5,6,7. On pense que cette barrière intestinale affaiblie joue un rôle dans la physiopathologie de ces processus pathologiques par le biais d’une translocation dérégulée d’antigènes pathogènes, qui peuvent alors créer une réponse inflammatoire locale ou systémique.

Il existe plusieurs protocoles établis pour mesurer la barrière intestinale. Les études in vitro utilisent traditionnellement des lignées cellulaires cancéreuses, telles que les cellules T84 ou Caco-2, pour mesurer la résistance électrique transépithéliale (TEER) et quantifier les composants des jonctions serrées et des jonctions adhérentes8. Ex vivo, des mesures du courant transépithélial peuvent être prises à l’aide de chambres d’Ussing sur biopsie ou d’échantillons d’intestin réséqués9. Les études in vivo consistent généralement à administrer des traceurs inertes par voie orale, puis à mesurer l’absorption de ces traceurs dans le sang ou l’urine10,11. Bien que ces techniques se soient avérées utiles dans l’étude de la barrière intestinale, elles présentent plusieurs limites : les lignées cellulaires immortelles transformées présentent intrinsèquement des changements métaboliques et cytosquelettiques qui affectent la barrière intestinale de manière mal définie ; l’accès aux patients, aux échantillons de patients ou aux organismes modèles peut être limité ; Les études in vivo sont difficiles à contrôler pour les facteurs de confusion ou à tirer des conclusions au niveau moléculaire. Ainsi, bien que des preuves de cette rupture de la barrière aient été rapportées dans de multiples modèles de maladies, la compréhension du mécanisme de ces défauts de la barrière intestinale reste limitée, et notre capacité à cibler et à traiter cet aspect des maladies gastro-intestinales est restée insaisissable.

Les organoïdes intestinaux humains offrent une capacité unique et passionnante d’élucider la cause et le traitement des défauts de la barrière intestinale. Les organoïdes intestinaux humains dérivés de tissus sont des cultures de cellules cellulaires primaires dérivées de cellules souches adultes situées à la base des cryptes intestinales12. Ces cellules peuvent être isolées à partir d’une biopsie ou d’échantillons chirurgicaux et mises en culture pour maintenir les changements génétiques et épigénétiques observés chez les patients dont elles sont dérivées 13,14,15. Ils servent de modèle plus pertinent sur le plan physiologique que les lignées cellulaires immortelles traditionnelles, car ils n’ont pas les changements métaboliques des lignées cellulaires cancéreuses et peuvent être différenciés en différents types de cellules présents dans l’épithélium intestinal mature 16,17,18. De plus, parce qu’ils peuvent être développés in vitro, ils sont plus accessibles et utiles pour des études contrôlées de l’effet cellulaire de divers traitements et conditions de croissance en parallèle. Bien qu’il existe également des limites inhérentes aux modèles d’organoïdes intestinaux, notamment l’absence d’autres types de cellules non épithéliales et le contexte du système du corps entier, il a été démontré que les organoïdes intestinaux humains fournissent un modèle fiable pour de multiples aspects des maladies gastro-intestinales13.

Parmi ceux-ci, il a été démontré que les organoïdes intestinaux modélisent étroitement les défauts de la barrière intestinale, démontrant les changements attendus dans l’organisation des jonctions serrées et la TEER dans le cadre d’agressions de barrière 19,20,21. Ici, nous adaptons une technique d’évaluation de l’intégrité de la barrière dans les coloïdes humains, dans laquelle le flux de molécules marquées par fluorescence à travers des monocouches d’organoïdes est détecté22. Dans ce protocole, les organoïdes sont cultivés et mûris en monocouches bidimensionnelles polarisées sur des membranes semi-perméables. Le dosage implique l’ajout d’un traceur fluorescent à la surface apicale de la monocouche épithéliale, et sa présence sur le côté opposé est quantifiée dans le temps. L’augmentation du flux du traceur est le reflet d’un épithélium plus perméable ou plus perméable. Ce test fournit une lecture de barrière fonctionnelle, qui peut s’ajouter aux évaluations de la structure des jonctions serrées et adhérentes. De plus, bien que les mesures TEER soient souvent utilisées pour fournir une évaluation de base de l’intégrité de la barrière, le test de flux décrit ici peut être adapté pour détecter la perméabilité de molécules de différentes classes, charges et tailles, caractérisant ainsi la barrière de manière beaucoup plus détaillée. Plusieurs traceurs fluorescents disponibles dans le commerce peuvent être utilisés à cette fin. De plus, grâce à l’utilisation de spectres fluorescents non chevauchants, la perméabilité à plusieurs traceurs peut être évaluée simultanément. De plus, la configuration monocouche de ce test permet d’évaluer la réponse barrière aux conditions de croissance appliquées spécifiquement à la surface apicale ou basolatérale des cellules uniquement. Grâce à cela, une évaluation contrôlée de l’effet des traitements, des changements microenvironnementaux et des conditions de co-culture est possible.

On sait que les défauts de la barrière intestinale jouent un rôle pathogène important dans le développement de plusieurs maladies gastro-intestinales, mais le terme « intestin perméable » est de plus en plus utilisé dans les médias populaires sans précision. Cela souligne la nécessité de modèles améliorés pour évaluer et caractériser la barrière intestinale. Le système décrit utilise des monocouches d’organoïdes intestinaux physiologiques dérivés de tissus humains pour évaluer l’intégrité de la barrière fonctionnelle dans des conditions contrôlées.

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Protocole

Tous les échantillons ont été acquis et utilisés conformément à un protocole approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université du Colorado, numéro de protocole 14-2012.

REMARQUE : Toutes les procédures des étapes 1 à 3 doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile avec une technique stérile. Un schéma du protocole est présenté à la figure 1.

1. Établissement de colonoïdes humains à partir de cultures congelées

REMARQUE : Assurez-vous que tous les matériaux sont prêts dans l’enceinte de biosécurité avant de décongeler les cellules afin de minimiser l’exposition des organoïdes décongelés au milieu de congélation. Le protocole commence avec des colonoïdes humains cryoconservés dérivés de tissus. Des protocoles de dérivation et de cryoconservation de colonoïdes humains ont été décrits précédemment24.

  1. Préparation d’un milieu souche organoïde intestinal humain
    1. Préparez les milieux conditionnés Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 (L-WRN) conformément aux protocoles décrits précédemment25,26.
    2. Complétez le milieu L-WRN avec les facteurs de croissance suivants : facteur de croissance épidermique [50 ng/mL], nicotinamide [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], thiazovivine [4 μM], SB431542 [4 μM], gastrine I [10 nM].
    3. Mélangez le milieu L-WRN supplémenté 1:1 avec un milieu organoïde intestinal commercial.
    4. Juste avant l’utilisation, compléter avec du Y-27632 [10 μM].
      REMARQUE : La composition optimale du milieu de tige organoïde intestinale peut varier en fonction du laboratoire et de la lignée colonoïde. L’utilisation de milieux supplémentés en L-WRN seuls ou l’utilisation de milieux organoïdes intestinaux commerciaux seuls peut également être possible. L’utilisation par ce protocole de milieux conditionnés à parts égales en L-WRN et de milieux commerciaux est plus résistante à la variabilité d’un lot à l’autre par rapport à l’utilisation de milieux conditionnés seuls et est plus rentable par rapport à l’utilisation de milieux commerciaux seuls.
  2. Préparation du milieu de différenciation
    1. Complétez DMEM/F12 avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine et 2 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide.
    2. Mélanger le DMEM/F12 1:1 complété par un milieu de tige organoïde intestinal à partir de l’étape 1.1
  3. Préparation de matrice extracellulaire (ECM)
    1. Décongeler l’ECM pendant la nuit sur de la glace, puis préparer des aliquotes de 100 μL.
      REMARQUE : Les aliquotes peuvent être recongelées à -20 °C. Voir les instructions du fabricant pour plus de détails.
    2. Incuber les aliquotes sur de la glace jusqu’au moment du placage des cellules.
  4. Décongélation et placage des organoïdes
    1. Décongelez le contenu du flacon cryogénique dans un bain-marie à 37 °C, en veillant à ce que le flacon reste immergé, mais que le capuchon soit au-dessus de l’eau, jusqu’à ce qu’il soit tout juste décongelé.
    2. Transvasez le contenu de la fiole dans un tube conique de 15 mL contenant 13 mL de milieu DMEM/F12 complété par de la glace (à partir de l’étape 1.2.1).
    3. Centrifugeuse à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
    4. Aspirez le surnageant, en laissant environ 1 mL de volume résiduel au-dessus de la pastille de cellule.
    5. Placez le tube sur de la glace. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 complété par de la glace (à l’étape 1.2.1) et pipeter la suspension 10 à 15 fois pour remettre la pastille en suspension.
    6. Centrifugeuse à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette, en laissant le moins de produit de lavage résiduel possible sur la pastille de cellule.
    8. Ajoutez 100 μL d’ECM décongelé à la pastille. Remettez complètement en suspension pour vous assurer que les organoïdes sont uniformément dispersés sans grumeaux. Pipeter lentement pour éviter d’introduire des bulles d’air.
    9. ECM sur plaque en pipetant environ 10 dômes ou gouttelettes tridimensionnelles d’ECM, d’environ 10 μL chacun, dans un puits d’une plaque à 6 puits.
    10. Retournez rapidement la plaque et incubez à 37 °C pendant 5 à 10 minutes ou jusqu’à ce que les dômes soient solidifiés.
    11. Une fois les dômes fixés, ajoutez 2 ml de milieu de tige organoïde intestinal (de l’étape 1.1) dans le puits.
    12. Incuber à 37 °C, dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Remplacez le support tous les 2 jours.
    13. Passez à l’étape 2 une fois que les organoïdes occupent plus de 75 % de la surface du dôme ECM ou accumulent des débris centraux.

2. Passage et expansion des colonoïdes humains

  1. Pour chaque puits, aspirer le milieu de croissance des puits sans perturber les dômes ECM.
  2. Lavez délicatement les dômes avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée, puis retirez le PBS.
  3. Ajouter 1 mL de trypsine glacée dans chaque puits. À l’aide d’une pipette, brisez les dômes de l’ECM en les pipetant de haut en bas. Pipetez le mélange 10 à 15 fois pour dissocier complètement l’ECM.
  4. Incuber la plaque à 37 °C pendant 3 à 5 min.
  5. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 complété par voie glacée (à l’étape 1.2.1) dans le puits pour neutraliser la trypsine. Pipetez vigoureusement le mélange 20 à 30 fois jusqu’à ce que les cellules soient dissociées en grappes de 2 à 3 cellules chacune.
  6. Transférez la suspension cellulaire dans un contenant conique de 15 ml.
  7. Utilisez 1 mL supplémentaire de DMEM/F12 supplémenté (à l’étape 1.2.1) pour bien laver et ajoutez la solution de lavage au conique de 15 mL.
  8. Ajouter du DMEM/F12 supplémenté (à partir de l’étape 1.2.1) pour atteindre un volume total de 13 mL dans le conique de 15 mL.
  9. Passer aux étapes 1.4.3 à 1.4.12 de l’étape 1 en utilisant une quantité appropriée d’ECM pour étendre l’expansion dans d’autres puits.
    REMARQUE : Un puits confluent d’organoïdes dans une MEC de 100 μL peut généralement être acheminé dans 2 à 3 puits (200 à 300 μL de MEC). Un puits confluent d’organoïdes est suffisant pour environ 3 à 6 monocouches à l’étape 3.

3. Génération de monocouches de coloïdes humains

  1. Revêtement de collagène inserts de culture cellulaire
    1. Placez les inserts de culture cellulaire en polystyrène (pores de 0,4 μm) dans une plaque de 24 puits et ajoutez 100 μL de solution d’enrobage de collagène dans la chambre apicale de chaque insert.
    2. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité pour éviter l’évaporation.
    3. Incuber à 4 °C pendant 4 à 24 h.
      REMARQUE : Il n’y a pas de différence dans les résultats au cours de ce temps d’incubation, mais un temps d’incubation plus court ou plus long peut être choisi pour s’adapter à un point de pause pratique.
  2. Placage de monocouches organoïdes
    1. Suivez les étapes 2.1-2.5 pour dissocier les organoïdes.
    2. Passez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm dans un tube conique de 50 mL.
    3. Rincer les puits avec 1 mL de DMEM/F12 supplémenté (à l’étape 1.2.1). Récupérez ce produit de lavage et passez-le dans la crépine de la cellule.
    4. Laver la crépine cellulaire avec du DMEM/F12 complété (à partir de l’étape 1.2.1) jusqu’à ce que le volume total dans le tube conique de 50 mL atteigne 15 mL.
    5. Transvaser le filtrat dans un contenant conique de 15 ml.
    6. Centrifugeuse à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Aspirer le surnageant en laissant 1 mL au-dessus de la pastille.
    8. Ajouter 1 mL de milieu DMEM/F12 supplémenté (à l’étape 1.2.1) et remettre en suspension.
    9. Examinez la suspension au microscope pour confirmer la dissociation complète. Si nécessaire, pipetez vigoureusement les cellules jusqu’à ce qu’elles soient principalement des cellules uniques.
    10. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette, en laissant le moins de produit de lavage résiduel possible sur la pastille de cellule.
    11. Mettre en suspension dans un petit volume (200-1000 μL) de milieu de tige organoïde intestinal (à partir de l’étape 1.1). Restez sur la glace.
    12. Prélever une aliquote de la suspension cellulaire à utiliser pour compter les cellules viables en utilisant la méthode préférée. Utilisez le nombre de cellules viables pour déterminer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour plaquer 100 000 cellules viables par insert.
    13. Aspirez la solution d’enrobage de collagène de chaque insert sans toucher la membrane de l’insert.
    14. Ajouter le volume approprié de milieu souche organoïde intestinal (de l’étape 1.1) dans la chambre apicale de chaque insert pour porter le volume final à 200 μL une fois la suspension cellulaire ajoutée.
      REMARQUE : Si vous le souhaitez, la suspension cellulaire de l’étape 3.2.12 peut être ajustée à une concentration finale de 100 000 cellules/200 μL, puis 200 μL peuvent être plaqués dans la chambre apicale. Cependant, si la suspension cellulaire entière n’est pas utilisée pour le placage monocouche, cela peut entraîner un gaspillage excessif de support.
    15. Ajouter le volume approprié de suspension cellulaire dans la chambre apicale.
    16. Ajouter 500 à 1000 μL de milieu de tige organoïde intestinal dans la chambre basolatérale.
      REMARQUE : 500 μL sont suffisants pour les colonoïdes typiques. Si les cellules sont métaboliquement plus actives ou sensibles à l’accumulation de déchets, l’utilisation d’un plus grand volume dans la chambre basolatérale peut être utile pour maintenir la croissance.
    17. Répétez l’opération pour tous les inserts/puits.
    18. Incuber à 37 °C, dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2.
    19. Remplacez le support une fois par semaine.
      REMARQUE : Les traitements d’intérêt peuvent être appliqués sur les chambres apicales et/ou basolatérales des inserts à tout moment avant ou après le placage.

4. Mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) et de la maturation monocouche

  1. Mesurer la résistance
    1. Utilisez un voltmètre/ohmmètre épithélial sur le réglage ohm. Nettoyez la sonde en l’essuyant avec une lingette de travail imbibée d’éthanol à 70 %. Placez le bras le plus long de l’électrode dans le compartiment basolatéral et le bras le plus court dans le compartiment apical de l’insert. Enregistrez la mesure.
      REMARQUE : Si les mesures TEER sont également un point final d’intérêt, prenez également des mesures de résistance d’un insert enrobé de collagène sans cellules comme arrière-plan. Ensuite, le TEER est calculé comme suit : (résistance - résistance de l’insert d’arrière-plan) x surface de l’insert. La surface de l’encart dans ce protocole est de 0,33cm2. Ce calcul donnera TEER en ohm·cm2. Si vous utilisez un voltmètre/ohmmètre épithélial différent de celui indiqué dans le tableau des matériaux, utilisez les instructions du fabricant pour l’utilisation du compteur pour mesurer la résistance.
    2. Répétez l’opération tous les jours jusqu’à ce que les mesures atteignent un plateau.
      REMARQUE : Le plateau se produit généralement après 2 à 3 semaines avec un TEER supérieur à 200 ohm·cm2, mais varie selon la ligne coloïde et les conditions de croissance.
  2. Une fois que la résistance a atteint un plateau, amorcer la maturation des organoïdes en remplaçant le milieu de tige par un milieu de différenciation (à partir de l’étape 1.2).
  3. Continuez les mesures quotidiennes du TEER. Attendez-vous à une augmentation du TEER et à un deuxième plateau.
    REMARQUE : Le deuxième plateau se produit généralement vers 7 jours avec un TEER de 1500-2500 ohm·cm2, mais cela varie selon la ligne des colonoïdes et les conditions de croissance.
  4. Une fois que les mesures TEER ont atteint un plateau une deuxième fois, passez à l’étape 5.

5. Dosage du flux FITC-dextran

REMARQUE : Ce protocole utilise FITC-dextran 4 kDa (rayon de Stokes 14 Å). Cependant, en fonction des besoins expérimentaux, des traceurs fluorescents de différentes tailles, charges et fluorophores peuvent être utilisés22. Plusieurs traceurs peuvent également être utilisés en même temps, auquel cas il faut confirmer que les spectres d’excitation et de fluorescence d’émission ne se chevauchent pas. Il est suggéré d’effectuer les étapes 5.1 à 5.3 dans une armoire chauffante (incubateur non humidifié, sans CO2 ) réglée à 37 °C. Si ce n’est pas le cas, les réactifs doivent être chauffés à 37 °C avant d’être utilisés, et les cellules, les tampons et les échantillons collectés doivent être conservés à 37 °C pendant les temps d’incubation.

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparez la solution saline tamponnée de Hank (HBSS) avec 10 mM d’HEPES et ajustez le pH à 7,4. Chaud à 37 °C.
      REMARQUE : Si nécessaire, préparez HBSS+HEPES avec les traitements d’intérêt. Préparez-vous suffisamment pour obtenir 80 μL/puits dans la chambre apicale et 1 mL/puits dans la chambre basolatérale.
    2. Versez environ 50 ml de HBSS+HEPES chaud dans un petit bécher pour rincer les inserts. Ayez un bécher plus grand à proximité pour les déchets liquides.
    3. Décongélation complète FITC-dextran 4 kDa. Préparez une solution à 1,25 mg/mL dans HBSS avec HEPES. Préparez un volume adéquat de solution de FITC-dextran pour allouer 80 μL par puits et 1 μL pour la courbe standard.
      REMARQUE : La concentration de départ peut être ajustée en fonction de la taille et de la perméabilité attendue du traceur. Par exemple, des traceurs plus petits ou plus perméables peuvent être ajoutés à une concentration plus faible pour conserver les réactifs. Si des traitements doivent être appliqués sur la chambre apicale, préparer une solution de FITC-dextran dans HBSS+HEPES correctement traité.
  2. Application du FITC-dextran aux monocouches
    1. Préparez une nouvelle assiette à 24 puits en ajoutant 1 mL de HBSS+HEPES (avec traitement si désiré) dans les puits appropriés.
    2. Lavez les monocouches organoïdes en saisissant l’insert avec une pince, en le soulevant hors du puits, en le plongeant dans le bécher contenant HBSS+HEPES chaud (à partir de l’étape 5.1.2) pour remplir la chambre apicale, puis en le renversant sur le bécher à déchets pour vider la solution de lavage.
    3. Répétez ce lavage 2 fois de plus.
    4. Placez l’insert dans le puits approprié de la plaque fraîche préparée à l’étape 5.2.1.
    5. Pipeter doucement 80 μL de solution FITC-dextran dans la chambre apicale. Pipeter sur le côté de l’insert afin d’éviter de perturber la monocouche.
    6. Répétez l’étape 5.2.5 pour tous les monocouches.
    7. Ajoutez HBSS ou PBS à tous les puits vides pour maintenir l’humidité.
  3. Collecte d’échantillons de flux
    1. Immédiatement après l’étape 5.2.7, prélever 70 μL de la chambre basolatérale de chaque puits dans un puits constitué d’une plaque plate à fond transparent noire à 96 puits et le conserver à l’abri de la lumière à 37 °C. Il s’agit du point de temps 0.
    2. Incuber la plaque, à l’abri de la lumière, à 37 °C.
    3. Toutes les 30 minutes pendant 2 h, mélangez le tampon dans le puits basolatéral, puis recueillez 70 μL supplémentaires dans des puits vides de la plaque à fond transparent à 96 puits de l’étape 5.3.1.
  4. Préparation de la courbe standard
    1. Ajouter 1 μL de la solution réservée de FITC-dextran (1,25 mg/mL ; étape 5.1.3) dans 999 μL de HBSS+HEPES. Il s’agira de la dilution de 1:1000 ou 1,25 μg/mL pour la courbe standard.
    2. Diluez en série cette solution 1:1 en prélevant 150 μL de la solution et en l’ajoutant à 150 μL de HBSS+HEPES, puis en mélangeant bien. Répétez cette opération dix fois de suite pour un total de dilution en 12 étapes.
      REMARQUE : Cela créera une courbe standard de : 1250, 625, 312,5, 156,25, 78,13, 39,06, 19,53, 9,77, 4,88, 2,44, 1,22 et 0,61 ng/mL. En fonction de la perméabilité des lignées cellulaires, il peut être nécessaire de plus ou moins concentrer la courbe standard. La première fois que l’expérience est réalisée, réservez une solution supplémentaire de FITC-dextran 1,25 mg/mL au cas où la courbe standard devrait être refaite à une concentration différente.
    3. Pipeter 70 μL de chaque dilution de la courbe standard dans les puits vides de la plaque inférieure transparente à 96 puits selon les étapes 5.3.1 et 5.3.3. Répétez l’opération pour la deuxième répétition.
  5. Mesurez la fluorescence sur un lecteur de plaques fluorescentes avec les réglages suivants : excitation 490 nm, émission jusqu’à 520 nm, lecture depuis le bas de la plaque, avec un gain de 100 et une hauteur de lecture de 7 mm.
    REMARQUE : Ajustez les longueurs d’onde d’excitation/émission en fonction du fluorophore de votre choix.
  6. Analyse des données
    1. Tracez la courbe standard avec la concentration sur l’axe des x et la fluorescence sur l’axe des y. Utilisez cette option pour déterminer l’équation de régression linéaire.
    2. Utilisez cette équation de régression linéaire et les lectures fluorescentes des échantillons pour calculer la concentration de FITC-dextran à chaque point temporel de chaque échantillon.
    3. Tracez la concentration dans le temps pour chaque échantillon et calculez la pente d’une équation de régression linéaire, qui représente les microgrammes/min (μg/min). Divisez cela par la surface de l’insert de culture cellulaire (0,33 cm) pour déterminer le débit en microgramme par minute et par centimètre carré (μg/min/cm2).

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Résultats

À l’aide de ce protocole, la perméabilité des colonoïdes humains sains en présence et en l’absence de signalisation inflammatoire a été analysée. Il a été démontré précédemment que l’ajout d’un mélange de cytokines inflammatoires, appelé cytomix, qui comprend de l’IFNγ, du TNFα et de l’IL-1β (chacun à 10 ng/ml), induit un dysfonctionnement de la barrière intestinale tel que mesuré par TEER dans des modèles de cellules épithéliales intestinales20,27. Nous avons ch...

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Discussion

Il s’agit d’un protocole permettant d’évaluer la barrière intestinale dans le modèle physiologiquement représentatif des monocouches coloïdes humaines. Le test de flux de traceur fluorescent décrit ici fournit des informations sur l’intégrité fonctionnelle de la barrière au-delà de ce qui est glané avec d’autres types de tests de barrière, tels que TEER, les mesures en chambre d’Ussing ou l’évaluation de l’expression des protéines de jonction serrée. De plus, l’utilisation de modèles d’o...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de divulgations ou de conflits d’intérêts.

Remerciements

Le Dr Sean Colgan est financé par les subventions des NIH DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 et VA Merit BX002182.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à centrifuger coniques de 15 mLCelltreat229411
Flacon cryogénique à filetage interne de 2 ml.Corning430488
Tubes à centrifuger coniques de 50 mLCelltreat229421
Plaque à 6 puits, traitée pour culture tissulaireCelltreat229106
70 &mu ; Crépine à cellules MFaucon352350
Plaque inférieure noire / transparente à 96 puitsThermo Scientific165305
A83-01  ;R& D2939
Lecteur de plaques BioTek SynergyAgilentSynergie H1
Compteur de cellules à fond clair Auto T4NexcelcomCMT-AT4P
Chambres de comptage de cellules de cellomètreNexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
Solution d’enrobage de collagèneApplications cellulaires125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
Éthanol 100 %Fisher ScientificN° A4094
Voltohmmètre EVOM2 avec électrode Stx2Instruments de précision mondiauxNC9792051
Sérum fœtal bovin (FBS)CytivaSH30396.03HI
Pointes de pipette filtranteFisher Scientific02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrin I (Humain)R& D3006
GlutaMAX  ;Fisher Scientific35050061200 mM de lipeptide de L-alanyl-L-glutamine
Hanks solution saline tamponnée 10xThermo Scientific14065056
HEPES 1MThermo Scientific15630080
Interféron gamma recombinant humainBioLégende575308
Interleukine 1 bêta recombinante humaineThermo scientifique200-01B-500UG
Milieu de croissance des organoïdes intestinaux IntestiCult (humain)STEMCELL Technologies06010  ;Milieux organoïdes intestinaux commerciaux
Microscope inversé en directOlympeIX85
MatrigelCorning354234Matrice extracellulaire (ECM)
Incubateur microbiologiqueFisher Scientific151030515
Plaque multipuits pour la culture en suspension, 24 puitsGreiner Bio-one662102
NicotinamideR& D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526BFilm d’étanchéité
Pipettes Pasteur (verre borosilicaté)Fisher Scientific13-678-20B
PBS  ;Gibco10010-023
Pénicilline Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140122
Facteur de croissance épidermique recombinantR& D2028-EG
Centrifugeuse réfrigéréeBeckman CoulterBE-AX15R
SB202190  ;R& D1264
ThiazovivineR& D3845
Insert de culture cellulaire ThinCert pour plaque 24 puits, 0,4 &mu ; mGreiner Bio-one662641
Trypsine-EDTA (0,25 %)Fisher Scientific25200114
Facteur de nécrose tumorale alpha recombinant humainR& DRéférence 10291-TA-100
Dichlorhydrate d’Y-27632  ;TocrisTB1254-GMP

Références

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