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Article de méthode

Production et utilisation de moules d’agarose personnalisables pour la culture de follicules ovariens de souris sans échafaudage

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DOI :

10.3791/68871

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24 octobre 2025

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons des méthodes de culture des follicules ovariens dans un nouveau moule d’agarose sans échafaudage qui complète la gamétogenèse in vitro .

Résumé

Le follicule ovarien est l’unité fonctionnelle de l’ovaire qui produit les hormones et les gamètes nécessaires au maintien de la fonction reproductive et de la santé féminine. La capacité de récapituler la folliculogenèse, l’ovulation et la lutéinisation in vitro a une large utilité fondamentale, translationnelle et clinique. Les systèmes de croissance folliculaire in vitro les plus avancés maintiennent l’architecture tridimensionnelle (3D) du follicule, ce qui est crucial pour le développement d’ovocytes de métaphase II méiotiquement compétents chez l’homme. Récemment, une méthode sans échafaudage pour la croissance in vitro des follicules secondaires multicouches de souris a été développée et validée. Pour cela, des moules imprimés en 3D personnalisés ont été utilisés pour micropatterner l’agarose avec des micropuits qui s’adaptent à l’expansion volumétrique des follicules. Les follicules cultivés dans cet environnement sans échafaudage ont montré une production d’hormones et une viabilité comparables par rapport aux systèmes de croissance folliculaire encapsulée in vitro (eIVFG) bien établis à base d’alginate. Il est important de noter que les micropuits d’agarose sont une méthode évolutive, moins exigeante sur le plan technique, et montrent une amélioration de la croissance des follicules et des taux d’ovulation par rapport à l’eIVFG. Cette méthodologie produit des moules personnalisables qui sont biocompatibles avec l’ovocyte, une cellule très sensible aux lixiviats spécifiques au matériau et à d’autres contaminants environnementaux. De plus, les follicules de ce système sont cultivés dans le même plan focal, ce qui permet une imagerie et une analyse en temps réel. Pour accroître l’accessibilité de cette nouvelle approche, cet article détaille les méthodes nécessaires pour concevoir et imprimer en 3D des moules maîtres, créer des moules en silicone pour des plaques de 24 ou 96 puits et cultiver des follicules ovariens secondaires multicouches isolés dans les moules d’agarose. Cette configuration peut également être intégrée à un système d’imagerie time-lapse économique, permettant une analyse morphocinétique. De plus, les moules peuvent être noyés en paraffine pour les analyses histologiques en aval. Dans l’ensemble, cette méthode conviviale est un outil polyvalent pour la culture des follicules et peut être personnalisée davantage pour favoriser la différenciation et la maturation des cellules germinales dans le contexte du follicule afin de maintenir une gamétogenèse in vitro complète.

Introduction

L’ovocyte, ou gamète femelle, fournit la majeure partie du cytoplasme et la moitié du matériel génétique à l’embryon lors de la fécondation, ce qui est essentiel pour le développement de la génération suivante. L’ovogenèse commence au cours du développement embryonnaire lorsque les cellules germinales primordiales entrent en méiose et s’arrêtent dans la prophase I. Ces ovocytes résident dans les follicules primordiaux et constituent la réserve ovarienne, un pool fini et non renouvelable à partir duquel ils sont progressivement recrutés. Les follicules se développent dans un processus connu sous le nom de folliculogenèse, dans le but de produire finalement un gamète mature capable de féconder 1,2,3,4,5. Le développement du follicule commence par une phase précoce, indépendante des gonadotrophines, où la signalisation paracrine est essentielle à la survie et à la croissance du follicule. Au fur et à mesure que les follicules atteignent le stade secondaire, ils deviennent dépendants des gonadotrophines, marquant un changement vers la signalisation endocrinienne. Une caractéristique clé des follicules secondaires est un ovocyte entouré d’un minimum de deux couches complètes de cellules de la granulosa cuboïde, ainsi que de la couche de thèque nouvellement développée. Les cellules thèques forment la couche la plus externe du follicule, fournissant des androgènes et un soutien structurel 6,7. Enfin, une cavité antrale remplie de liquide se forme et se rompt en réponse à une poussée d’hormone lutéinisante (LH) pendant l’ovulation, libérant un gamète compétent pour la fécondation arrêté à la méiose II 2,8,9.

L’ovocyte acquiert une compétence développementale pour la fécondation et la capacité de soutenir le développement embryonnaire préimplantatoire précoce, appelé maturation nucléaire et cytoplasmique, au cours de l’ovogenèse et de la folliculogenèse 10,11,12. La maturation cytoplasmique est apparente morphologiquement, car les ovocytes se dilatent tout au long de la folliculogenèse. En raison de la prolifération des cellules somatiques, y compris les cellules de la thèque, de la granulosa et des cumulus, les follicules eux-mêmes connaissent une expansion volumétrique importante. Chez la souris, le diamètre du follicule est multiplié par cinq entre les follicules secondaires précoces et pré-ovulatoires. La communication bidirectionnelle entre l’ovocyte et les cellules somatiques environnantes est essentielle pour l’ovogenèse. Dans les follicules primaires, la zone pellucide se forme à partir de protéines sécrétées par l’ovocyte, et la communication entre ces compartiments folliculaires est en partie médiée par des projections transzonales, qui assurent un contact physique entre ces deux compartiments folliculaires13,14. Par conséquent, le microenvironnement folliculaire est essentiel pour orchestrer correctement la croissance ainsi que la maturation nucléaire et cytoplasmique de l’ovocyte 2,5. Pour mieux comprendre les mécanismes discrets qui sous-tendent ces processus, il est nécessaire de disposer de techniques de culture in vitro avancées et physiologiquement pertinentes. La capacité de cultiver des follicules in vitro a de nombreuses applications, notamment les technologies de procréation assistée et la préservation de la fertilité 15,16,17,18, la conservation des espèces 19,20, le développement de médicaments21 et le dépistage toxicologique22,23.

Les systèmes de culture folliculaire in vitro sont également une étape intermédiaire essentielle pour la capacité à générer des gamètes à partir de cellules souches pluripotentes, également connue sous le nom de gamétogenèse in vitro (GAV)24. Les chercheurs ont utilisé des cellules souches embryonnaires, des cellules souches mésenchymateuses et des cellules souches pluripotentes induites pour développer des gamètes chez une variété d’espèces, en s’appuyant souvent sur des cellules somatiques pour recréer le microenvironnement du follicule natif 25,26,27,28,29,30. Bien que des étapes majeures de preuve de concept aient été franchies grâce à ces méthodes, il reste un défi à relever pour les ovocytes de mauvaise qualité, ce qui se traduit par un faible développement embryonnaire et des taux de progéniture vivante après fécondation in vitro chez la souris31,32. Aucune naissance vivante n’a encore été obtenue chez d’autres espèces, ce qui souligne la nécessité de continuer à affiner les protocoles pour soutenir pleinement l’ovogenèse et la folliculogenèse.

Actuellement, plusieurs stratégies sont utilisées pour la culture des follicules. Les approches techniquement les moins exigeantes et les plus productives sont les méthodes sans échafaudage, où les follicules sont placés dans une boîte en plastique ou un insert à membrane33,34. Ici, les cellules de la granulosa adhèrent à la surface de la culture, perdant le contact avec l’ovocyte33,34. La dégradation de l’architecture folliculaire limite l’utilisabilité et la pertinence biologique de ces techniques. Cependant, la culture sans échafaudage dans des plaques d’attache basses ou des gouttes inversées permet au follicule de maintenir son intégrité structurelle chez plusieurs espèces de mammifères 35,36,37. Malheureusement, avec ces techniques, il est difficile de contrôler l’interaction entre les follicules et la quantité de soutien mécanique qu’ils reçoivent. Par conséquent, pour mieux récapituler la physiologie in vivo, des méthodes de culture ont été développées où les follicules sont encapsulés dans des hydrogels avec des compositions chimiques définies et réglables et/ou des propriétés mécaniques 33,34,38,39,40,41,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Par exemple, le système de croissance folliculaire in vitro encapsulé dans de l’alginate peut récapituler les signatures transcriptomiques clés observées in vivo21.

Malgré le succès et la valeur des protocoles de culture encapsulés, il existe plusieurs inconvénients. Elles peuvent être techniquement difficiles, laborieuses, à faible débit et ne sont pas compatibles avec les méthodes d’imagerie automatiques. De plus, les méthodes de culture encapsulée nécessitent des approches en plusieurs étapes pour les espèces de mammifères plus grandes en raison de l’expansion volumétrique plus élevée du follicule37. De plus, les techniques encapsulées exercent un soutien uniforme dans toutes les directions, et les follicules doivent être libérés de l’hydrogel avant l’ovulation. Cela ne se produit pas in vivo, où le follicule interagit avec le microenvironnement ovarien environnant, qui fournit un soutien biomécanique dynamique54. Par exemple, le cortex ovarien rigide maintient la quiescence des follicules primordiaux, tandis que les gros follicules en croissance se trouvent généralement dans le compartiment médullaire plus mou55,56. Une fois qu’un follicule avec un ovocyte compétent a atteint sa taille terminale, les modifications de la paroi du follicule et de l’épithélium de la surface de l’ovaire permettent l’ovulation. Par conséquent, les techniques de culture où les follicules sont autorisés à se développer dans une seule direction avec peu de résistance pourraient mieux imiter la physiologie in vivo.

Dans le cadre d’une nouvelle approche, une méthode de culture reproductible, évolutive, techniquement moins exigeante et rentable pour les follicules secondaires multicouches de souris a été mise au point57. Ici, des micropuits d’agarose à très faible adhérence avec une géométrie (forme, dimensions) et une disposition spatiale (nombre, proximité) et une disposition spatiale (nombre, proximité) contrôlables avec précision sont fabriqués à l’aide de méthodes abordables. Les follicules dans les moules d’agarose subissent un support mécanique dans toutes les directions sauf une et sont cultivés dans le même plan focal, ce qui permet l’imagerie en accéléré pour une analyse morphocinétique avancée. L’impression 3D par stéréolithographie (SLA) a été utilisée comme méthode accessible pour fabriquer un moule maître, suivie d’étapes de moulage qui créent des moules en silicone sans lixiviat pour couler l’agarose. Le nouveau système a permis d’améliorer la croissance des follicules et l’ovulation par rapport à l’eIVFG traditionnelle, sans compromettre la survie, la maturation ou la lutéinisation globales des follicules57. Ce document de protocole décrit les étapes nécessaires à la personnalisation et à la fabrication de moules d’agarose, à l’ensemencement et à la culture de follicules secondaires multicouches, au traitement et enfin à la réalisation d’une analyse en accéléré (Figure 1).

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Protocole

Toutes les procédures animales liées à ce protocole ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Northwestern et effectuées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Adapter la conception du moule maître

Cette section décrit les premières étapes effectuées au cours de la phase de conception (Figure 1), au cours de laquelle des micropuits personnalisés sont introduits dans une conception assistée par ordinateur (CAO) d’un moule maître pour les plaques de culture à 24 puits, appelée conception de base de moule maître à 24 puits (Fichier supplémentaire 1). Les dimensions des micropuits dictent la quantité de support et la taille de croissance maximale des follicules, tandis que le nombre de puits détermine le nombre maximal de follicules par moule d’agarose. La conception du moule maître adapté sera ensuite utilisée dans la section suivante pour créer des moules en silicone biocompatibles pour la coulée d’agarose.

  1. Ouvrez le fichier .step de conception de base de moule maître à 24 puits à l’aide d’un logiciel de CAO (Figure 2A).
  2. Sélectionnez la surface interne de l’objet, puis accédez à l’onglet Solide dans l’espace de travail Conception , puis sélectionnez Créer une esquisse pour insérer la conception de micromoule souhaitée (Figure 2Bi).
  3. Entrez les dimensions xy souhaitées et le nombre de micropuits et sélectionnez Esquisse de finition dans la barre d’outils (Figure 2Bii).
    REMARQUE : Pour les follicules secondaires multicouches, une forme géométrique de stade de 500 x 700 μm a été utilisée précédemment57. La résolution d’impression peut varier en fonction des résines et des imprimantes SLA utilisées ; permettre un espacement minimal de 400 μm entre les micropuits.
  4. Créez les micropuits de 800 μm de profondeur à l’aide de la fonction d’extrusion (cliquez sur Solide | Créer | Extruder). Assurez-vous de sélectionner l’opération de coupe , créant ainsi la cavité du micropuits (Figure 2Biii).
  5. Sélectionnez un congé de raccordement de 0,100 mm de rayon (cliquez sur Conception | Solide | Modifier | Filet) pour le haut des micropuits
    REMARQUE : Pour créer un micropuits à fond rond, utilisez à nouveau l’opération d’angle pour le fond du puits de culture et ayez une valeur de rayon égale au rayon de la conception du micropuits. Par exemple, lors de la conception de puits de 500 μm x 700 μm, sélectionnez une valeur de rayon de 0,250 mm (Figure 2Biv).
  6. Exportez une copie du nouveau design de moule maître au format .step (cliquez sur Fichier | exporter).

2. Création de contenants de moule en silicone

REMARQUE : Pour éviter la lixiviation des composés cytotoxiques des pièces imprimées en 3D, deux moules en silicone biocompatibles seront fabriqués. Cette section décrit les dernières étapes de la phase de conception (figure 1) et aboutira aux deux contenants utilisés pour le moulage du silicone. Ici, trois fichiers CAO différents seront utilisés, à savoir la nouvelle conception de moule maître créée à partir de la section 1 et les conteneurs en silicone moulés à 24 puits 1 et 2 (figure 2Ci-ii et fichier supplémentaire 2, fichier supplémentaire 3, respectivement).

  1. Ouvrez le fichier 1.step du récipient moulé en silicone à 24 puits et insérez la nouvelle conception de moule maître en tant que composant externe (accédez à Solide | Insérer | Insérer un composant).
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le composant et sélectionnez Rompre le lien pour supprimer la référence liée à la nouvelle conception de moule maître.
  2. Centrez la nouvelle conception de moule maître avec un récipient en silicone moulé à 24 puits 1 surface, en vous assurant qu’il est tourné vers l’intérieur.
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le nouvel objet de conception de moule maître dans le navigateur et sélectionnez l’option déplacer/copier .
    2. Sélectionnez l’opération Déplacement libre dans la section Type de déplacement et faites pivoter l’objet de 180° sur l’axe des x si nécessaire.
    3. Sélectionnez l’opération Point à Point dans la section Déplacer le type avec le milieu du nouvel objet de conception de moule maître comme point d’origine et le centre de la surface du récipient en silicone moulé à 24 puits 1 comme point cible.
    4. Sélectionnez OK pour aligner les objets.
  3. Sélectionnez l’opération de coupe avec le récipient comme corps cible et le moule maître comme conception du corps de l’outil (Figure 2Ciii). Cela crée le récipient pour la première étape du moulage du silicone (Figure 2Civ).
    REMARQUE : Les micropuits qui ont été conçus dans la première section sont maintenant des micropiliers qui seront imprimés en 3D comme décrit à la section 3. L’impression SLA est une méthode de fabrication additive ; Par conséquent, l’impression de micropiliers améliore la résolution d’impression par rapport à l’impression de micropuits.
  4. Enregistrez et exportez le nouveau moule en silicone 24 puits 1 obtenu sous forme de fichier .stl et .step.

3. 3D impression de contenants en silicone

REMARQUE : Cette section décrit les premières étapes effectuées au cours de la phase de fabrication (Figure 1) où les nouvelles conceptions CAO avec les caractéristiques de conception de micropuits souhaitées sont imprimées en 3D.

  1. Ouvrez les fichiers .stl du nouveau moule en silicone 24 puits 1 et du conteneur en silicone moulé 24 puits 2 avec un logiciel de préparation d’impression 3D.
  2. Orientez l’impression avec les micropiliers vers le haut et utilisez la fonction de perçage pour créer une ouverture de 1 mm de large (Figure 2D). Assurez-vous que ce canal est ouvert sur le côté de l’impression.
    REMARQUE : Le trou d’alésage qui évite les effets de bombement pendant l’impression et peut être rempli après l’impression, ou l’excès de matériau en silicone peut être retiré après le premier moulage en silicone.
  3. Imprimez les deux modèles de conteneur sur une épaisseur de couche de 25 μm (Figure 3A).
    REMARQUE : Imprimez chaque modèle en trois exemplaires pour tenir compte des imperfections d’impression ou des dommages pendant le traitement.
  4. Retirez les moules de la plate-forme d’impression et lavez-les à l’isopropanol à 95 % selon les instructions du fabricant. Vaporisez abondamment la section des micropiliers avec de l’isopropanol à 95 % (figure 3B). Retirez tout éthanol restant avec de l’air comprimé.
  5. Laissez l’éthanol restant s’évaporer pendant au moins 30 min.
    REMARQUE : À ce stade, le canal de perçage de 1 mm de large peut être scellé. Cela peut être fait en appliquant une petite goutte de résine non polymérisée avec une pointe de pipette p200 à l’extérieur de l’impression. Les forces capillaires rempliront le canal.
  6. Durcissez les impressions 3D à 60 °C avec une lumière ultraviolette pendant 15 min.
  7. Inspectez chaque impression à l’aide d’un stéréomicroscope et jetez toutes les impressions 3D présentant des imperfections (Figure 3C-F). Inspectez soigneusement chaque impression visuellement, en vous assurant que tous les micropiliers sont séparés et uniformes en taille et en apparence (Figure 3D). Jetez les moules maîtres de défauts avec des micropiliers fusionnés (Figure 3E).
    REMARQUE : Les problèmes courants sont les micropiliers ou les ponts endommagés par la résine non lavée restante (Figure 3Fi,ii).
  8. Couvrez l’extérieur de l’impression avec du parafilm si le canal de perçage n’est pas rempli et rangez-le jusqu’à une utilisation ultérieure.

4. Fabrication de moules en silicone

REMARQUE : Cette section décrit les dernières étapes de la phase de fabrication (Figure 1), où deux étapes de moulage de silicone auront lieu. Ceci est nécessaire pour éviter la libération de lixiviats toxiques par les pièces imprimées en 3D.

  1. Préparez le silicone selon les instructions du fabricant, en résumé :
    1. Mélangez soigneusement le contenu des récipients des parties A et B , placez un bécher sur une balance et versez dans le récipient dans un rapport de 1A :1B en poids. Assurez-vous d’avoir un excès de matériel.
    2. Bien mélanger pendant 3 min, en prenant soin de racler les côtés et le fond.
    3. Placez le matériau dans un dessiccateur sous vide et laissez agir 5 min pour éliminer les bulles d’air emprisonnées. Répétez le dégazage jusqu’à 2 fois s’il reste des bulles d’air.
  2. Versez le mélange avec un écoulement uniforme dans le récipient du moule en silicone 1. Assurez-vous que le niveau de mélange est au même niveau que celui de l’impression 3D ou légèrement en dessous pour assurer la planéité du moule en silicone (Figure 4Ai,ii).
    1. Éliminez l’air emprisonné à l’aide d’une pointe de pipette p200 et utilisez le dégazage sous vide si nécessaire.
  3. Faites durcir le silicone à température ambiante pendant au moins 5 h et de préférence toute la nuit avant de le démouler.
  4. Retirez le silicone du moule imprimé en 3D et confirmez visuellement l’intégrité des micromoules à l’aide d’un stéréomicroscope (Figure 4Aiii,B). Retirer l’excédent de matériau du canal de forage si nécessaire (Figure 4Aiv). Jetez les moules avec des ponts ou des micropuits compromis (Figure 4C).
  5. Placez le moule en silicone dans le récipient 2 pour la deuxième étape de moulage en silicone (Figure 4Av). Le récipient en silicone 2 a une ouverture de 1 mm dans la paroi latérale qui sera recouverte une fois le moule en silicone placé.
  6. Vaporisez légèrement le moule en silicone avec de l’huile minérale sans danger pour les embryons et retirez tout excès d’huile des micropuits. Cela agira comme un agent de démoulage pour séparer les deux pièces en silicone après durcissement.
  7. Répétez les étapes de mélange décrites à l’étape 4.1 et versez le mélange dans le récipient 2 du moule en silicone. Assurez-vous que le niveau de mélange est inférieur ou à la même hauteur que l’impression 3D pour assurer la planéité du moule en silicone (Figure 4Avi).
  8. Laissez le silicone durcir à température ambiante pendant au moins 5 h, de préférence toute la nuit, avant de le démouler.
  9. Retirez le silicone du moule imprimé en 3D et séparez les moules en silicone 1 et 2 l’un de l’autre (Figure 4Avii). Confirmer visuellement l’intégrité des micropiliers à l’aide d’un stéréomicroscope (figure 4D). Jetez le moule s’il y avait des bulles ou un excès d’huile dans les micropuits (figure 4E).
  10. Lavez le moule en silicone avec de l’éthanol à 70 % et laissez sécher à l’air libre pendant 30 min dans une hotte à flux laminaire.
  11. Placer dans un sachet de stérilisation et un autoclave en utilisant un cycle de séchage pour stériliser (pression de la chemise : 20 psi, température de la chambre : 250 °F, temps de stérilisation : 15 min).

5. Préparation des milieux de culture

REMARQUE : La digestion du tissu ovarien pour l’isolement et la culture des follicules, la maturation in vitro des ovocytes et la lutéinisation nécessitent six types de milieux : les milieux de dissection (DM), les milieux enzymatiques (EM), les milieux d’entretien (MM), les milieux de croissance (GM), les milieux de maturation (IVM) et les milieux de lutéinisation (LM). La préparation de ces milieux peut être trouvée comme décrit précédemment par Converse et al.38 avec une explication de l’importance des différents composants du média analysée par Simon et al.33, et leur objectif est brièvement mentionné dans le tableau 1.

  1. Préparez le support jusqu’à 1 semaine à l’avance et conservez-le à 4 °C.

6. Moulage et stockage de moisissures d’agarose personnalisées et de culture de follicules

REMARQUE : Cette section décrit comment couler des moules d’agarose personnalisés pour la culture de follicules à partir des moules en silicone générés dans la section 4. Les moules à l’agarose peuvent être fabriqués et stockés à 4 °C jusqu’à 2 semaines avant la culture des follicules.

  1. Placez les moules dans un sachet de stérilisation et un autoclave en utilisant un cycle de séchage tel que décrit à la section 4.11. Laissez refroidir les moules avant de les utiliser.
  2. Préparez une solution d’agarose en dissolvant une solution stérile d’agarose à 1,5 % (p/v) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) au micro-ondes ou sur une plaque chauffante. Utilisez un tube conique stérile qui est placé dans un bécher avec de l’eau pour permettre un chauffage plus uniforme de l’agarose et pour ralentir la solidification de la solution d’agarose liquide.
  3. Pipeter la solution stérile d’agarose dans des moulages de silicone dans une hotte à flux laminaire. Pipetez lentement et en douceur pour minimiser la formation de bulles et assurez-vous que le haut du moule est plat et non convexe ou concave. Le haut lors de la coulée sera le fond du moule lors de la culture et doit reposer à plat. Utilisez environ 600 μL d’agarose pour un micromoule à plaque de 24 puits et 85 μL pour un micromoule qui s’adapte à une plaque de 96 puits.
  4. Laisser refroidir les micromoules pendant ~3 min jusqu’à ce qu’ils se solidifient. Retournez le moulage en silicone pour expulser les micromoules sur une boîte de Pétri de 100 mm.
  5. Évaluez les micromoules au microscope pour détecter toute déformation, y compris les fissures, la fusion des micropuits ou les bordures incomplètes. Placez les micromoules dans du PBS stérile + 1 % de pénicilline-streptomycine et conservez-les à 4 °C jusqu’à 2 semaines avant de les utiliser.
    REMARQUE : Fabriquez plus de moules que nécessaire pour tenir compte de la dégradation au fil du temps ou des dommages aux micromoules lors du transfert entre les plaques.
  6. Équilibrer les micromoules dans 750 μL de milieu d’entretien 2x pendant au moins 1 h (total de deux incubations) le jour de l’isolement des follicules.
  7. Retirer tous les milieux d’entretien, ajouter 750 μL de milieu de culture et placer dans l’incubateur pendant 1 h.
  8. Remplacer par un milieu de croissance frais et équilibré avant l’ensemencement.

7. Isolement et culture de follicules secondaires tardifs

REMARQUE : Cette section explique comment isoler et ensemencer les follicules dans les micromoules d’agarose pour la culture des follicules. Les secondaires multicouches sont cultivées pendant 8 jours, doivent avoir une viabilité supérieure à 80 % et produire des ovocytes matures. L’isolement et la culture des follicules secondaires ont été décrits en détail ailleurs38. L’isolement et la sélection des follicules pour l’encapsulation établie de l’alginate et pour l’ensemencement dans des moisissures d’agarose sont cohérents.

  1. Disséquer les ovaires de souris et retirer du tissu adipeux périovarien et de la bourse. Placez les ovaires dans 2,5 mL de milieu enzymatique et incubez dans un agitateur orbital à 37 °C pendant 20 min comme décrit précédemment57.
  2. Pipeter 2 ml de milieu d’entretien dans une boîte de FIV et placer dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2) avant l’isolement des follicules.
  3. Réaction de trempe avec 250 μL de FBS. Sélectionnez les follicules secondaires tardifs après isolement enzymatique et transférez-les dans une boîte de FIV avec DM.
  4. Transférez les follicules dans une boîte de FIV avec des milieux d’entretien pré-équilibrés et placez-les dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 1 h.
    REMARQUE : La taille de départ des follicules secondaires tardifs est de 150-180 μm avec plus de deux couches de cellules de la granulosa présentes.
  5. Ajouter 750 μL de GM frais dans des micromoules d’agarose et les stocker dans l’incubateur pour préparer l’ensemencement. Ajouter du PBS stérile dans les puits adjacents entourant les micromoules d’agarose pour maintenir l’humidité et minimiser l’évaporation du milieu tout au long de la période de culture.
  6. Transférez des follicules secondaires multicouches de haute qualité dans des micromoules d’agarose au microscope à l’aide d’une pointe de décapant de 200 μm. Assurez-vous que 10 follicules sont transférés dans chaque micromoule dans une plaque à 24 puits et que chaque follicule se trouve dans un micropuits séparé mais adjacent.
    1. Pliez l’embout du décapant pour permettre une manipulation plus précise et un transfert des follicules dans les micropuits.
    2. Transférez rapidement les follicules pour minimiser les changements de température et de pH, car le MM et le GM sont tamponnés au CO2 .
    3. Assurez-vous que les follicules à l’intérieur d’un micromoule sont d’une taille de départ similaire une fois que les 10 follicules sont transférés.
  7. Remettez les micromoules ensemencés dans l’incubateur pendant au moins 1 h pour permettre aux follicules de récupérer avant l’imagerie.
  8. Imagez les follicules à un grossissement de 4x et 10x tous les deux jours pour quantifier la survie et la croissance des follicules.
    REMARQUE : L’imagerie timelapse peut également être configurée pour effectuer des mesures morphocinétiques et sont décrites plus en détail dans la section 9.
  9. Changez 50 % des milieux de culture tous les deux jours.
  10. Congelez les supports usagés avec de la glace sèche, puis conservez-les à -80 °C. Utilisez ce milieu conditionné pour évaluer la production d’hormones par le biais d’ELISA d’œstradiol.
    REMARQUE : Si les OGM sont fabriqués le jour de l’ensemencement (début de la période de culture), le milieu peut être stocké à 4 °C et utilisé pendant toute la période de culture.
  11. Retirer et congeler en un clin d’œil tous les milieux de croissance (750 μL) au jour 8 de la culture.
  12. Remplacez le milieu de croissance par un milieu IVM pour permettre l’ovulation in vitro .
    REMARQUE : L’ovulation peut également se produire sous imagerie timelapse pour évaluer les caractéristiques de synchronisation et de rupture.
  13. Éliminer les complexes cumulus-ovocytes (COC) 14 à 16 h après l’ajout d’un milieu de MIV et évaluer l’état de maturation.
    1. Définir l’état de maturation est le suivant : identifier l’IIM par extrusion du premier globule polaire (résultat attendu pour les ovocytes sains), le GVBD/MI par l’absence de globule polaire ou de vésicule germinale (maturation retardée), le GV par le noyau sphérique visible au centre de l’ovocyte (absence de progression méiotique) ou l’ovocyte aplati dégénéré et/ou foncé.
  14. Facultatif : Comme les paramètres du fuseau des ovocytes MII, y compris l’alignement chromosomique, la forme et le volume, sont étroitement corrélés avec la qualité des ovocytes et les résultats de l’embryon58,59, utilisez-les pour évaluer le succès de l’ovogenèse in vitro. Pour évaluer la morphologie du fuseau, fixer et colorer les œufs MII par immunocytochimie entière.
    1. Fixation : Fixer les œufs dans 3,8 % de PFA avec 0,1 % de Triton X-100 à 37 °C pendant 20 min. Lavez les œufs 3 fois dans un tampon bloquant (PBS avec calcium et magnésium (PBS +/+) avec 10 % de Tween-20 et 0,3 % de BSA).
    2. Coloration du fuseau :
      1. Incuber les œufs dans un tampon de perméabilisation (PBS +/+ avec 0,1 % de Triton X-100 et 0,3 % de BSA) pendant 15 min à température ambiante
      2. Rincer 2 fois dans un tampon de blocage.
      3. Incuber les œufs dans de l’anti-alpha-tubuline conjuguée à Alexa Fluor 488 à une concentration de 1 μg/mL sur une bascule enveloppée dans du papier d’aluminium pendant 2 h à température ambiante.
      4. Laver les œufs pendant 3 x 20 min dans un tampon de blocage avant de les monter sur des lames de microscope avec un milieu de montage contenant du DAPI.
      5. Pour observer le cytosquelette de l’ovocyte, incluez de la rhodamine phalloïdine 1:50 lors de la coloration.
    3. Imagez des échantillons sur un microscope confocal à l’aide d’un objectif 63x avec une pile z d’une largeur de 1,0 μm sur l’ensemble de la broche.

8. Applications en aval des moules à agarose personnalisés

REMARQUE : Les micromoisissures d’agarose peuvent être utilisées pour l’analyse histologique, permettant la quantification et la localisation de différents gènes ou protéines d’intérêt. Les micromoules créent un microréseau de follicules qui permet de colorer plusieurs follicules en parallèle. La tomographie par cohérence optique (OCT) peut également être réalisée sans avoir à transférer de follicules (Figure 1, Application). La tomographie par cohérence optique est une technique d’imagerie qui permet la reconstruction 3D d’échantillons et a une profondeur de pénétration et une résolution plus élevées que la microscopie confocale, ce qui permet d’améliorer l’imagerie d’échantillons 3D tels que les follicules cultivés in vitro60.

  1. Pour les applications histologiques, préparez une solution d’agarose (1,5 % p/v) comme décrit à l’étape 6.2.
    1. Retirez tous les supports entourant les micromoules d’agarose dans le puits et retirez soigneusement les supports dans la cavité du micromoule à l’aide d’une pipette P200 aux coins de la cavité.
    2. Pipeter soigneusement 100 μL de solution d’agarose liquide pour remplir et sceller les micropuits et la cavité sans agiter les follicules ; Assurez-vous que le dessus est plat. Retirez toutes les bulles à l’aide d’une pointe de pipette P10 stérile.
    3. Laissez l’agarose se solidifier à température ambiante pendant 2 min. Assurez-vous au microscope que le micromoule est entièrement scellé.
    4. Fixez les micromoules pendant la nuit à 4 °C en les balançant doucement dans 750 μL de fixateur (solution de Davidson modifiée ou paraformaldéhyde à 3,8 %).
    5. Aspirez le fixateur et lavez les micromoules scellés à des concentrations croissantes d’éthanol, en commençant par 50 % et enfin 70 % d’EtOH.
    6. Procédé à l’aide d’un processeur de tissus automatisé utilisant des protocoles de traitement standard (tableau 2) et incorporé dans de la cire de paraffine. Lors de l’enrobage, notez l’orientation des micromoules. Assurez-vous qu’il y a de la cire avant et après l’échantillon pendant le processus d’enrobage afin de minimiser la perte de tissu pendant la section.
    7. Sectionnez en série des échantillons encastrés à 5 μm d’épaisseur et placez-les sur des lames de microscope chargées.
    8. Effectuez la coloration H&E à l’aide d’un colorant automatique et scellez-les avec un support de montage avant l’imagerie.
  2. Lors de l’OCT, placez le micromoule avec les follicules dans une boîte de 50 mm contenant un support IVM.
    1. Pour suivre la procédure utilisée pour générer les images OCT représentatives, imagez à l’aide d’un système OCT construit sur mesure fonctionnant dans la gamme spectrale de la lumière visible avec une résolution axiale de 1,3 μm et une résolution latérale de 9,4 μm61,62.
    2. Scannez les follicules dans un champ de vision de 1,58 x 1,58 mm2 , composé de 512 lignes A et 512 B-scans, répétés 2x par B-scan et 3x par volume.
    3. Traitez des images OCT à l’aide d’ImageJ pour visualiser la structure 3D des follicules et quantifier les volumes.
      1. Téléchargez des images dans ImageJ en tant que pile Z en faisant glisser des fichiers dans l’application ouverte.
      2. Visualisez la z-stack sous forme d’image 3D en allant dans Plugins|3D|Visualiseur de volume. Faites pivoter l’image 3D pour afficher différents angles à différents points temporels.
      3. Accédez à Fichier| Enregistrer sous |Tiff pour enregistrer l’image à l’emplacement souhaité.

9. Analyse en accéléré de la culture folliculaire

REMARQUE : Les follicules cultivés dans le système de culture sans échafaudage résident dans le même plan focal et sont compatibles avec l’imagerie timelapse dans l’incubateur. L’imagerie en accéléré peut être démarrée après l’ensemencement des follicules à l’étape 7.7 (Figure 1, Application).

Assurez-vous que toutes les modifications sont exactes tout au long du timelapse. Par conséquent, passez en revue toute la pile après chaque étape pour vous assurer qu’il n’y a pas d’écarts dans les mesures.

  1. Configuration du timelapse :
    1. Placez un capuchon de porte-oculaire/concentrateur de lumière sur le microscope portable.
    2. Placez le microscope portable avec support de monture dans l’incubateur et connectez-le à un ordinateur portable avec un logiciel installé.
    3. Placez et alignez bien la culture sous le microscope et ajustez la hauteur et la mise au point du microscope pour que tous les follicules soient nets. À l’aide de la balance des blancs automatique (AWB), choisissez des conditions d’éclairage optimales à l’aide du contrôle LED, désactivez l’exposition automatique ( AE) et sélectionnez le temps d’exposition optimal.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’alignement du moule est le même avant et après chaque changement de support ; Sinon, l’analyse devra être faite séparément tous les 2 jours de culture.
    4. Démarrez l’imagerie timelapse, en sélectionnant une durée de 8 jours et un intervalle de 30 min. Sélectionnez la photo et éteignez la LED lorsque vous ne prenez pas de photos.
  2. Spécifiez les mesures à enregistrer dans la boîte de dialogue Définir les mesures (cliquez sur Analyser | définir les mesures) avant l’analyse ImageJ.
    REMARQUE : Pour plus d’informations sur les mesures possibles intégrées dans le logiciel ImageJ, consultez le guide de l’utilisateur sous-section 30.763.
  3. Placez toutes les images dans un dossier d’analyse distinct pour commencer l’analyse.
  4. Faites glisser et déposez le dossier d’analyse dans le logiciel ImageJ pour ouvrir le timelapse sous forme de pile. Assurez-vous que l’option Noms de tri numérique est sélectionnée et si les séquences d’images ne tiennent pas dans la RAM de l’ordinateur, sélectionnez Pile virtuelle.
  5. Utilisez l’outil de sélection rectangulaire pour sélectionner une zone où tous les follicules du timelapse sont présents. Pour cela, utilisez d’abord la dernière image et faites défiler la pile pour vous assurer qu’aucun des follicules ne sera coupé. Ensuite, recadrez la sélection (accédez à Image | Recadrer ou Ctrl+Maj+X, Figure 5Ai,ii).
  6. Définissez la barre d’échelle pour la pile timelapse (Analyser | Définir l’échelle). Utilisez l’image du jour 0 réalisée avec l’imageur et mesurez trois caractéristiques identifiables telles que des follicules ou des micropuits. Utilisez l’image du même jour 0 de la pile timelapse et définissez l’échelle de l’une des mesures ; Utilisez les deux autres mesures pour confirmer que l’échelle précise est réglée.
  7. Alignez toutes les images à l’aide du plug-in SIFT (accédez à Plug-ins | Inscription | Alignement linéaire de la pile avec SIFT (Figure 5Bi,ii). Utilisez les paramètres standard suivants, qui peuvent être ajustés au cas par cas : Alignement linéaire de la pile avec SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 Le plus proche/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation = Interpolation rigide.
  8. Conversion de la pile en niveaux de gris 8 bits (Image | Type | 8 bits).
  9. Supprimez l’arrière-plan à l’aide de la soustraction d’arrière-plan Rolling Ball (cliquez sur Traiter | Soustraire l’arrière-plan, Figure 5Ci,ii) à l’aide des paramètres suivants, qui peuvent être ajustés au cas par cas : Rayon de la balle roulante = 70,0 pixels ; Sélectionnez Désactiver le lissage.
  10. Seuilz l’image (accédez à Image | Ajuster | Threshold) pour diviser les images timelapse en deux classes de pixels, en utilisant les paramètres suivants : setThreshold(35, 255, « raw ») ; run(« Apply LUT », « stack ») ; setOption(« BlackBackground », true) ; run(« Convert to Mask », « method=Intermodes background=Dark calculate black »).
  11. Mesurez chaque follicule individuellement à l’aide de la sélection rectangulaire, puis sélectionnez la fonction d’analyse de particules (cliquez sur Analyser | Analyser les particules). Utilisez les paramètres suivants : Analyser les particules... », « size= 8000-Infinity display exclude include summarize overlay add composite stack (Figure 5Di,ii).
    1. Avant d’enregistrer les résultats, vérifiez que le retour sur investissement de chaque image est exact (Figure 5Ei,ii). Enregistrez le résumé et les résultats dans le fichier . CSV.
    2. Répétez cette opération pour tous les autres follicules.

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Résultats

Pour déterminer si la survie et la croissance des follicules ont été soutenues à l’aide de cette nouvelle technologie telle que décrite à la section 7 du protocole, les follicules des mêmes souris ont été isolés et cultivés en parallèle dans des micromoisissures d’agarose ou encapsulés dans de l’alginate à 0,5 %. Des images représentatives de follicules prises tous les deux jours de culture ont montré le développement, la croissance et la formation normaux d’une cavité antrale tout au lo...

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Discussion

La gamétogenèse et la maturation in vitro sont des technologies clés pour la compréhension fondamentale de la biologie des ovocytes, avec des applications potentielles dans les technologies de reproduction assistée, la préservation de la fertilité et la conservation des espèces. Les méthodes de soutien à l’IVG reposent souvent sur la co-culture avec des cellules somatiques pour créer des ovaires reconstruits30. L’importance de ces cellules de soutien est ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par les National Institutes of Child Health and Human Development (R01HD105752 to F.E.D et T32HD094699 to E.J.Z) et le programme SenNet du NIH Common Fund (U54AG075932 et UH3CA268105 to F.E.D.) et la subvention de la Fondation Bill & Melinda Gates (INV-003385 à F.E.D.). Selon les conditions de subvention de la Fondation Bill & Melinda Gates, une licence générique Creative Commons Attribution 4.0 a déjà été attribuée à la version du manuscrit accepté par l’auteur qui pourrait découler de cette soumission.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériaux et Produits Chimiques
  ; Tubes centrifugeuses en polystyrène de 50 mLGlobe Scientific941-11017-CS
Tubes microcentrifuges de 1,5 mLFisher ScientificMCT-150Pour congeler et stocker des médias
Antenne 100 mm, non traitéeFisher Scientific08-757-100D  ;Pour fabriquer et stocker des micromoules d’agarose
100 % éthanolMercedes Scientific1200Traitement tissulaire
1000 & micro ; L  ; Pointes de pipette, faible rétentionMIDSCIPR-1000BKConseils culturels   ;
200 & micro ; L  ; Pointes de pipette, faible rétentionMIDSCIPR-200BKConseils culturels   ;
Plaque à 24 puitsCorning353047Culture
Antennes de 35 mmFaucon351008Isoler les ovaires et incuber dans des milieux enyzmatiques
95 % d’éthanolMercedes Scientific1210Traitement tissulaire
AgaroseHoeferGR140Micromoules
Huile minérale BioXtra, huile légère, adaptée à la culture cellulaire d’embryons de sourisSigma-AldrichM5310-500MLUtilisé comme agent biocompatible de démoulage
Albumine sérique bovine   ;MP Biomédicals103700Supports de croissance
Plumeuse, 10 oz., pack de 6Office Depot  ;110284Air comprimé
Résine V4 transparente 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-04Impression 3D de la résine
Bécher en plastique réutilisable Corning à faible forme de 100 mL, polypropylène, graduéCorning1000P-100Bécher pour mélanger des composants en silicone & nbsp ;
DNAse IQiagen79254Médias enzymatiques
Ecoflex 00-45 Presque dégagéSmooth-On, IncB09M8Y9PTVMatériau silicone
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Supports de croissance
Fœtine bovine fœtaleSigmaF-3385Supports de croissance
Sérum fœtal bovin (FBS)Sérum de picPS-FB2Médias de dissection, médias enzymatiques,   ; Supports de maintenance & Médias de maturation
Fisherbrand  ; Sachets de stérilisationFisher Scientific01-812-50  ;Sachets de stérilisation
Hormone folliculostimulante (FSH)EMD Serono, Inc.Gonal-F Rx seulement  ;Médias de croissance & Médias de maturation
Gibco & nbsp ; DPBS, calcium, magnésiumFisher Scientific14-040-182  ;Le sérum tamponné phosphate de Dulbecco
Gonadotrophine chorionique humaine (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLMédias de maturation
Insuline-transférrine-sélénium (ITS)ThermoFisher41400045Supports de croissance
Sondes moléculaires Invitrogen Rhodamine PhalloïdineFisher ScientificR415Tache cytosquelettique d’œuf
Plats de FIVThermo Scientific150260Isoler, sélectionner et pré-équilibrer les follicules
Leibovit’z 15 (L15)Gibco11415-064Dissection Media & Médias enzymatiques
LibéraseSigma Aldrich5401119001Médias enzymatiques
MEM ? + GlutaMAXGibco32561-037Supports de maintenance,   ; Médias de croissance & Médias de maturation
Facteur de croissance épidermique de la souris (EGF)BD Biosciences354010Médias de maturation
Dessiccateur Nalgene Transparent en Polycarbonate Classic DesignThermo Scientific5311-0250Dessiccateur sous vide   ;
ParaffineFisher Scientific83-30Traitement des tissus & Intégration
Pénicilline-streptomycineGibco15140-122Médias de dissection, milieux enzymatiques et Supports de maintenance
Embouts de strip-teaseuseOrigioMXL3-200Culture
Média de montage antifade VECTASHIELD PLUS avec DAPILaboratoires VectorH-2000Coloration du noyau d’œuf
XylèneMercedes Scientific9840Traitement tissulaire
&alpha ;-Tubuline (11H10) Rabbit mAb (conjugué Alexa Fluor 488)Technologie de signalisation cellulaire5063SColoration à la tubuline d’œuf
Équipement
Construire la plateforme 2Formlabs, IncBP-F3-02-01  ;Composant imprimante 3D
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLImageur pour la configuration en accéléré
Formulaire 3 Réservoir de résine V2.1 & nbsp ;Formlabs, IncRT-F3-02-01Composant imprimante 3D
Imprimante 3D Formulaire 3B+Formlabs, IncF3B-P-IMPRIMANTEImprimante 3D stéréolithographie (SLA) de Formlabs
Forme cure   ;Formlabs, IncFH-CU-01Plateforme de durcissement   ;
Lavage de coffrageFormlabs, IncFH-WA-01Plateforme de lavage
Vaporisateur avec vaporisateur à pompeVWR0309-3005Appliquer un agent de démoulage
Capsule de focuseur/concentrateur de lumière pour la série Edge (à l’exception des modèles T5, T8)Dino-LiteN3C-RComposant d’imagerie pour la configuration en timelapse
Ensemble de support de montage combinant le rack RK-10 et l’extension de bras RK-10-EXDino-LiteRK-10AComposant d’imagerie pour la configuration en timelapse
Incorporateur de tissuLeicaHistoCore ArcadiaIntégrer des micromoules
Processeur tissulaireLeicaTP1020Pour traiter les micromoules
Incubateur secouant 211DS (Secoueur orbital)Labnet InternationalI-5211-DSIncuber les ovaires dans des milieux enzymatiques pour la libération des follicules
Software  ;
Autodesk FusionAutodesk, IncLogiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Autodesk offre un accès éducatif gratuit via le programme Autodesk Education.
DinoCapture 3.0 version 1.1.1.3  ;Dino-Lite
ImageJInstituts nationaux de la santéAnalyser les images OCT et mesurer les follicules
PréformeFormlabs, IncLogiciel gratuit de préparation à l’impression conçu pour fonctionner avec les imprimantes stéréolithographie (SLA) de Formlabs.

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