Article de méthode

Évaluation complète des outils d’imputation de génotypes pour des données de séquençage à ultra-faible profondeur du génome entier

DOI :

10.3791/68879

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12 décembre 2025

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1College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2Shenzhen Key Laboratory of Transomics Biotechnologies, BGI Research, 3State Key Laboratory of Genome and Multi-omics Technologies, BGI Research, 4The Innovation Centre of Ministry of Education for Development and Diseases, School of Medicine, South China University of Technology, 5Shanxi Medical University-BGI Collaborative Center for Future Medicine, Shanxi Medical University, 6State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Health Science Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trois outils d’imputation — STITCH, QUILT2 et GLIMPSE2 — ont été évalués selon différentes profondeurs de séquençage et tailles d’échantillon, en utilisant des panneaux de référence CKB et EAS. Les résultats fournissent un cadre pratique pour sélectionner des stratégies d’imputation appropriées dans les données de séquençage ultra-faible en profondeur, facilitant des études génomiques et complexes de populations à grande échelle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le séquençage ultra-faible en profondeur (ULDS) est une stratégie rentable pour les études génomiques à grande échelle, mais son utilité dépend de l’imputation exacte du génotype. Cette étude évalue trois outils d’imputation — STITCH, QUILT2 et GLIMPSE2 — selon différentes profondeurs de séquençage et tailles d’échantillon, en utilisant les panels de référence de la China Kadoorie Biobank (CKB) et The 1000 Genomes Project (1KGP) d’Asie de l’Est (EAS). Des divergences de performance critiques sont démontrées : Sensibilité à la taille de l’échantillon : La précision de STITCH s’est nettement améliorée avec des échantillons plus importants, tandis que QUILT2 et GLIMPSE2 ont montré une dépendance minimale à la taille de l’échantillon. Optimisation du panneau de référence : Le CKB spécifique à la population a considérablement amélioré la précision pour QUILT2 et GLIMPSE2 mais a eu un impact négligeable sur STITCH, qui repose sur l’inférence interne de l’haplotype. Seuils de profondeur : Tous les outils ont obtenu une précision robuste à des profondeurs de séquençage modérées (≥ 0,5x), mais STITCH a été très sous-performant à des profondeurs ultra-basses (≤ 0,1x). GLIMPSE2 avec CKB offrait la plus grande précision globale, tandis que QUILT2 équilibrait précision et efficacité de calcul. Pour les données de tests prénataux non invasifs (NIPT), GLIMPSE2+CKB a maintenu une précision suffisante pour les analyses en aval. Un cadre décisionnel est proposé, privilégiant les panels appariés par population et les outils adaptés en profondeur, offrant des lignes directrices concrètes pour optimiser les ULDS-WGS dans divers contextes de recherche. Ces connaissances relient les avancées méthodologiques à la mise en œuvre pratique, permettant une mise à l’échelle rentable des études génomiques sans compromettre la qualité des données.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le séquençage ultra-basse profondeur (ULDS), défini comme une couverture de séquençage inférieure à 1x, a gagné en popularité grâce à son faible coût, sa large couverture génomique et sa compatibilité avec la diversité des types d’échantillons. Il a déjà démontré une valeur clinique dans des applications telles que le dépistage prénatal non invasif (NIPT)1, la surveillancedu cancer 2, et la détection de la variation du nombre de copies chromosomiques (CNV) 3,4. Au-delà du diagnostic clinique, la baisse du coût du séquençage et les avancées rapides en bioinformatique ont permis aux ULDS de jouer un rôle croissant dans la génomique des populations et la recherche sur les traits complexes. En combinant les données ULDS avec des panels de référence d’haplotypes à l’échelle de la population, l’imputation du génotype permet la récupération d’informations variantes à l’échelle du génome au niveau individuel. En conséquence, l’ULDS s’est imposé comme une alternative rentable aux réseaux traditionnels de polymorphisme à nucléotide unique (SNP) et au séquençage à génome complet en profondeur (WGS)5, notamment dans des études à grande échelle telles que les études d’association génomique (GWAS) et les analyses de structure de population.

Des recherches antérieures ont démontré la faisabilité de mener diverses études génétiques utilisant les données de séquençage NIPT, incluant l’appel des variants, la reconstruction de l’historique de population, l’inférence des schémas d’infection virale et GWAS6.

Malgré ces avantages, la nature extrêmement rare des données ULDS présente des défis uniques. Au niveau de la variante, de nombreux sites sont totalement non observés ou représentés par un seul allèle par individu, ce qui conduit à une qualité des données insuffisante pour les analyses en aval. L’imputation des génotypes est donc essentielle, en tirant parti de la structure des haplotypes provenant de grands panels de référence (par exemple, 1000Genomes 7 ou des ressources spécifiques à la population) pour déduire statistiquement des génotypes manquants ou incertains. Des travaux antérieurs ont montré que l’imputation à partir des données NIPT peut atteindre une grande précision et conserver une puissance statistique robuste en GWAS pour identifier les variants associés auxtraits 8. En utilisant l’algorithmeSTITCH 9 , les données NIPT (profondeur moyenne ~0,15x) dans une cohorte de 20 900 femmes enceintes chinoises ont été imputées avec succès, permettant l’identification de loci associés à la grossesse. Les génotypes imputés ont montré une forte concordance avec les données WGS à haute profondeur dans les résultats GWAS (Pearson R² > 0,8)10.

Le succès des analyses basées sur ULDS dépend de manière critique de la précision de l’imputation, qui est influencée par la profondeur du séquençage, la qualité du panneau de référence et la correspondance de population, la performance de l’algorithme d’imputation, la taille de l’échantillon et le spectre des fréquencesallélétiques 11. Parmi celles-ci, le choix du panel de référence est un facteur déterminant majeur de la précision de l’imputation. Les panels couramment utilisés incluent des ressources mondialement représentatives telles que le projet 1000 Genomes (1KGP)7, TOPMed12 et le Haplotype Reference Consortium (HRC)13, ainsi que des panels de plus en plus disponibles par population ou région, tels que Singapore 10,000 Genomes (SG10K)14, la China Kadoorie Biobank (CKB)15. Un autre facteur clé dans la performance de l’imputation est le choix de l’algorithme. Plusieurs outils ont été développés pour répondre aux défis uniques du séquençage à faible profondeur, faisant progresser de manière significative l’utilisation pratique de l’imputation dans la recherche génétique à grande échelle. Bien que des méthodes d’imputation telles que Beagle (v5+)16, Minimac417 et IMPUTE511 soient largement utilisées pour les données de réseaux SNP et WGS de profondeur moyenne à élevée, elles fonctionnent souvent de manière sous-optimale dans les environnements ULDS. Plus récemment, des outils spécialisés ont été développés pour relever ces défis. STITCH9 déduit des haplotypes directement à partir de lectures de séquençage à faible profondeur, ce qui le rend particulièrement adapté aux grandes cohortes homogènes. QUILT218 utilise une bibliothèque d’haplotypes compressés et un modèle de vraisemblance localisé, permettant une imputation efficace grâce à d’immenses panels de référence et offrant des applications uniques en génomique prénatale. GLIMPSE219, une extension du cadre original GLIMPSE, apporte des améliorations supplémentaires tant en précision qu’en efficacité computationnelle.

Bien que ces outils représentent des avancées majeures, leurs performances relatives sous différents plans expérimentaux (par exemple, profondeur de séquençage, taille de cohorte et choix du panel de référence) n’ont pas été systématiquement évaluées, laissant les chercheurs sans directives claires pour choisir la stratégie la plus appropriée. Pour combler cet écart, trois outils d’imputation ULDS largement utilisés — STITCH, QUILT2 et GLIMPSE2 — ont été systématiquement évalués selon plusieurs profondeurs de séquençage et tailles d’échantillon. Leur performance a été évaluée à l’aide de deux panels de référence est-asiatiques très pertinents pour les populations chinoises. Les résultats indiquent que l’imputation ULDS est généralement fiable à des profondeurs de séquençage ≥0,5x, tandis que des profondeurs <0,1x nécessitent des cohortes nettement plus grandes pour obtenir une précision acceptable. La sélection des panels de référence doit être adaptée au contexte de l’étude, avec des panels appariés par population tels que CKB améliorant la précision de l’imputation. De plus, ces approches sont directement applicables aux données ultra-peu approfondies générées lors d’études de population à grande échelle et du TPNI. Cette étude établit ainsi un cadre pratique pour la sélection d’outils dans la recherche basée sur les ULDS, fournissant des orientations méthodologiques pour de futures applications en génétique des populations et analyses complexes de traits.

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Protocole

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Tous les participants ont donné un consentement éclairé écrit avant la participation. L’étude portant sur des données WGS très approfondies a été examinée et approuvée par le Conseil d’Examen Institutionnel du BGI (BGI-IRB 23058-T2), et l’approbation pour la collecte des ressources génétiques humaines a été obtenue auprès de l’Administration des ressources génétiques humaines de Chine ([2023] CJ0262). L’étude portant sur les données ULDS du NIPT a été approuvée par le Conseil d’éthique institutionnelle de l’Hôpital pour enfants de Wuhan (2021R062) et le Comité d’examen institutionnel BGI (BGI-IRB 21088), avec une approbation supplémentaire de l’Administration des ressources génétiques humaines de Chine ([2021] CJ2002).

REMARQUE : Cette étude comprenait deux types de données WGS. Le premier type consistait en des données WGS très approfondies (30xx) obtenues à partir d’échantillons sanguins de 500 individus recrutés dans une cohorte naturelle de population à Shenzhen. Ces données ont été utilisées pour construire un ensemble de données de qualité sur le terrain et pour des évaluations ultérieures de sous-échantillonnage et de précision. Le second type comprenait des données ULDS issues du NIPT portant sur 10 000 femmes enceintes de la région de Wuhan.

1. Données de séquençage du génome complet très approfondies

  1. Prélèvez 500 échantillons de sang périphérique (5 mL chacun) d’une cohorte de population générale après consentement éclairé. Stockez les échantillons dans des tubes EDTA et transportez-les à 2-8 °C.
  2. Centrifugez le sang à 1 600 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour séparer plasma et couche buffy. Prélever soigneusement le pelage buffy et le conserver à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ADN.
  3. Extraire l’ADN génomique de la couche buffy à l’aide d’un kit à billes magnétiques en suivant les instructions du fabricant.
  4. Quantifiez la concentration d’ADN à l’aide d’un test fluorométrique et évaluez l’intégrité de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose. Sélectionner des échantillons dont le rendement total de l’ADN est ≥1 μg, la concentration ≥12,5 ng/μL, et la longueur du fragment >20 kb sans dégradation visible pour la préparation à la bibliothèque.
  5. Cisaillez 80 à 200 ng d’ADN génomique de haute qualité à une taille moyenne de 350 à 400 pb par ultrasonicisation.
  6. Effectuer la réparation finale à 20 °C pendant 30 minutes, la ligation de l’adaptateur à 20 °C pendant 15 minutes, et la circularisation à 37 °C pendant 30 minutes pour construire des bibliothèques sans PCR. Générez des nano-boules d’ADN (DNB) en utilisant l’amplification par cercle roulant (RCA). Bibliothèques de séquence à extrémités appariées (PE100, longueur de lecture 100 pb) sur une plateforme DNBSEQ jusqu’à une profondeur cible de ~30x (moyenne 100 Go par échantillon). Stockez les lectures de séquençage brut au format FASTQ pour l’analyse en aval.
    REMARQUE : Manipuler tous les échantillons d’origine humaine dans des conditions de laboratoire BSL-2. Évitez les cycles répétés de gel-dégel pour éviter la dégradation de l’ADN. Éliminer les matières issues du sang comme déchets bio-dangereux ; Éliminez les réactifs chimiques conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets dangereux.

2. Données NIPT ultra-basse (~0,1x WGS)

  1. Prélever 10 000 échantillons de sang maternel (5 mL chacun) pour un test prénatal non invasif de routine (NIPT). Utiliser des tubes EDTA et transporter à 2-8 °C ; Traiter le plasma dans les 8 heures suivant la collecte.
  2. Pour les tubes d’ADN circulant stabilisés (tubes K ou G), transportez à 6-35 °C à l’aide de supports à température contrôlée et procédez en moins de 96 heures selon les procédures standard du fabricant.
  3. Centrifugez le sang à 1 600 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour séparer le plasma. Prélever soigneusement la couche supérieure de plasma sans déranger la couche buffy ou la pellete cellulaire à l’aide d’une pipette et transférer dans un nouveau tube. Centrifugez à nouveau le plasma récupéré à 16 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer les cellules résiduelles ou les débris. Transférez soigneusement le surnageant clarifié (plasma sans cellules) dans un tube frais pour l’extraction de l’ADN.
  4. Extraire l’ADN circulant sans cellules (cfDNA) du plasma à l’aide d’un kit d’extraction d’acide nucléique. Effectuer la réparation finale à 20 °C pendant 30 minutes, la ligation de l’adaptateur à 20 °C pendant 15 minutes, et l’amplification PCR (12 cycles, dénaturation à 98 °C 10 s, recuit 60 °C 30 s, extension 72 °C 30 s).
  5. Purifiez les produits PCR et circulez les bibliothèques à 37 °C pendant 30 minutes. Générez des DNB via RCA. Bibliothèques à séquence à extrémité unique (SE35, longueur de lecture 35 pb) sur une plateforme BGISEQ-500. Stockez les données brutes de séquençage au format FASTQ.
    REMARQUE : Manipuler les échantillons de plasma comme étant potentiellement infectieux dans des conditions BSL-2. Minimisez les cycles de gel-dégel pour diminuer la dégradation du cfDNA. Éliminez les déchets plasmatiques et les consommables plastiques comme substances bio-dangereuses.

3. Pipeline de prétraitement des données

  1. Pour évaluer systématiquement les performances des outils d’imputation de génotypes à différentes profondeurs de séquençage, effectuer un flux de travail standardisé de prétraitement sur les données WGS originales à haute profondeur (30x) et les données NIPT ultra-basses (<0,1x), incluant un échantillonnage simulé de downshing, le contrôle qualité, l’alignement des lectures, la suppression des doublons et le recalibrage du score de qualité de base (BQSR).
    REMARQUE : Les étapes allant de ce point jusqu’à l’évaluation de la précision de l’imputation constituent le Protocole principal (Figure 1) de cette étude. Le code spécifique se trouve dans le Fichier Supplémentaire 1.
  2. Sous-échantillonnage
    1. Générez une série de jeux de données sous-échantillonnés à partir des échantillons de séquençage 30x à haute profondeur originaux. Employez deux stratégies pour imiter de manière réaliste les caractéristiques de séquençage des données NIPT comme décrit ci-dessous.
    2. Sous-échantillonnage aléatoire : Utilisez seqtk v1.5 (https://github.com/lh3/seqtk) avec une graine aléatoire fixe de 100 pour créer quatre niveaux de données à faible profondeur (0,05x, 0,1x, 0,5x et 1,0x).
    3. Simulation de structure de lecture de type NIPT : Conserver uniquement la première lecture (R1) de chaque lecture à extrémité jumelée et tronquer toutes les lectures conservées à 35 pb avec seqtk trimfq -L 35, conformément à la nature typique d’une seule extrémité et de lecture courte du séquençage NIPT ultra-basse profondeur.
  3. Contrôle qualité
    1. Traitez tous les fichiers bruts FASTQ avec fastp v0.23.420. Utilisez les paramètres suivants : --qualified_quality_phred=5 (seuil de qualité de base), --unqualified_percent_limit=50 (pourcentage maximal de bases de faible qualité autorisées), --n_base_limit=10 (maximum de N bases par lecture), et suppression personnalisée de l’adaptateur avec --adapter_sequence=AAGTCGGAGGCCAAGCGTCTTAG
      GAAGACAA (R1) et --adapter_sequence_r2=AAGTCGGATCGTAGCC
      ATGTCGTTCTGTGAG
      CCAAGGAGTTG (R2).
    2. Désactivez la coupe de queue Poly-G (--disable_trim_poly_g), et générez des rapports aux formats JSON et HTML pour chaque échantillon.
  4. Alignement et suppression des doublons
    1. Aligner des lectures de haute qualité avec le génome de référence humain GRCh38 (hg38)21 en utilisant BWA v0.7.16a-r118122.
    2. Effectuez l’alignement avec l’algorithme ALN (-e 10 -t 4 -i 5 -q 0), suivi de samse pour l’alignement à une extrémité avec les informations du groupe de lecture.
    3. Convertir les fichiers SAM résultants en BAM, trier (samtools sort -@ 8), et supprimer les doublons à l’aide de SAMtools v1.323 (samtools rmdup). Indexez tous les fichiers BAM.
  5. Recalibrage du score de qualité de base (BQSR)
    1. Exécutez BQSR avec GATK v4.0.4.024. Entraînez le modèle de recalibration sur trois ensembles de données variants à haute confiance : dbSNP build 14625, Mills et 1000G gold standardindels 21, et le fichier indels connus du GATK resourcebundle 24 pour GRCh38. Les fichiers bundle utilisés font référence à l’exemple officiel GATK (https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json). Au total, téléchargez trois fichiers et leurs fichiers index correspondants.
    2. Exécutez BaseRecalibrator suivi d’ApplyBQSR pour générer des fichiers BAM recalibrés. Indexez tous les BAM avec SAMtools v1.3.
      REMARQUE : Tous les ensembles de données simulés ont subi des étapes de prétraitement identiques — downsampling, contrôle qualité, alignement, suppression des doublons et BQSR — afin d’assurer la cohérence et la comparabilité dans les évaluations de performance des imputations ultérieures.

4. Imputation du génotype

  1. Préparation des données
    1. Mise en place des jeux de données d’imputation : Construire plusieurs ensembles de données d’évaluation pour comparer systématiquement les outils d’imputation de génotypes à différentes profondeurs et tailles d’échantillon comme décrit ci-dessous. Un total de neuf combinaisons sont formées en fonction des différentes tailles d’échantillons et profondeurs de séquençage mentionnées ci-dessus. Les fichiers d’entrée consistent en les données de séquençage des listes de fichiers BAM (bamlist.txt) pour les neuf sous-ensembles mentionnés ci-dessus après contrôle qualité, stockées dans les fichiers bamlist.txt correspondants. D’autres fichiers d’entrée incluent le génome de référence humain (GRCh3821) et la carte génétique du projet1000 Genomes 7.
      1. Données WGS à haute profondeur sous-échantillonnées : Sélectionnez au hasard deux sous-ensembles (200 et 500 échantillons) parmi 500 individus séquencés à 30 fois la profondeur. Réduisez chaque sous-ensemble à quatre profondeurs (1x, 0,5x, 0,1x et 0,05x) pour générer huit conditions expérimentales.
      2. Jeu de données ULDS basé sur le NIPT : Combinez 10 000 échantillons NIPT ultra-basse profondeur (profondeur moyenne de 0,102x, Figure 2) avec 50 échantillons à haute profondeur réduits à 0,1x.
    2. Spécification de la région d’analyse : Restreindre toutes les analyses à la région du chromosome 1 chr1:150 500 000-160 500 000 (10 Mb), avec un tampon de 500 kb pour l’imputation, afin d’assurer une comparabilité directe entre les outils.
    3. Sélection du panel de référence : Utilisez deux panels de référence (Tableau 1) : le panel CKB, construit à partir des données de population chinoise, et le panel 1KGP-EAS, dérivé du sous-ensemble est-asiatique du projet 1000 génomes.
      REMARQUE : Le panel de référenceCKB 15 a été construit à partir de données de séquençage du génome complet très approfondies (~15x) provenant de 9 964 adultes chinois de la China Kadoorie Biobank, une grande étude prospective de cohorte. Ces échantillons proviennent d’une population naturelle avec un biais phénotypique minimal, une ascendance Han homogène et une structure de population cohérente, ce qui les rend particulièrement adaptés à l’imputation de génotypes dans les cohortes chinoises. Yu et al. 15 ont démontré que, dans un GWAS à phénotype réel pour la hauteur, l’imputation via le panel CKB triplait le nombre de SNP détectés et doublait le nombre de variants significatifs à l’échelle du génome. Le projet 1000 génomes (1KGP)7,26, la référence génomique la plus utilisée, comprend 585 individus dans son sous-ensemble de la phase 3 de l’Asie de l’Est (EAS). Ce sous-ensemble couvre cinq populations d’Asie de l’Est, dont la profondeur de séquençage est d’environ 30x, incluant les Han chinois à Pékin (CHB), les Han du Sud (CHS), les Dai chinois à Xishuangbanna (CDX), les Kinh à Ho Chi Minh-Ville, Vietnam (KHV), et les Japonais à Tokyo (JPT).
  2. Outils d’imputation
    1. Évaluer trois algorithmes d’imputation, choisis pour leurs stratégies de modélisation distinctes et leur applicabilité aux données de séquençage ultra-basse profondeur (ULDS).
      1. STITCH : STITCH (v1.6.6) est un algorithme d’imputation basé sur des haplotypes sans référence qui peut incorporer en option des haplotypes de référence externes. Inclure des listes BAM, le génome de référence humain (GRCh38) comme fichiers d’entrée. Préparez les fichiers du panneau de référence (hap/legend/pos) lors de l’imputation basée sur les références. Incluez les paramètres clés suivants : méthode = diploïde, tampon = 500 kb, K = 10 haplotypes ancestraux, et nGen = 4x taille d’échantillon/K (comme recommandé dans la documentation STITCH). Générez des fichiers de sortie contenant les dosages de génotype par SNP pour tous les individus.
        REMARQUE : Selon la documentation officielle de STITCH, K est le nombre d’haplotypes ancestraux dans le modèle. Un K plus grand améliore la précision de l’imputation pour des échantillons plus importants et des couvertures plus élevées, mais il augmente aussi le temps de calcul, et la précision peut diminuer avec une couverture plus faible.
      2. QUILT2 : QUILT2 applique une approche bayésienne guidée par référence optimisée pour les données ULDS. Préparez le panneau de référence en utilisant le script prepare_reference fourni, en spécifiant la carte génétique et les coordonnées régionales. Exécutez le mode diploïde d’imputation avec la même taille de tampon (500 kb) et le même réglage nGen que STITCH pour garantir la comparabilité.
      3. GLIMPSE2 : GLIMPSE2 est un outil d’imputation basé sur la HMM et basé sur des références, conçu pour des ensembles de données de séquençage à grande échelle et très peu approfondis. Exécuter l’imputation avec GLIMPSE2_phase_static, spécifier la liste BAM d’entrée, le panel VCF de référence humain, la carte génétique, la région d’entrée = chr1:150 000 000-161 000 000, la région de sortie = chr1:150 500 000-160 500 000 (pour maintenir un tampon de 500 kb). Le fichier de liste BAM saisi ici doit contenir deux colonnes : l’une est le chemin BAM, et la seconde colonne est le nom de l’exemple. Si la deuxième colonne n’est pas saisie, chaque nom de fichier BAM sera utilisé comme nom d’exemple dans le fichier VCF de sortie.

5. Évaluation de la précision de l’imputation

  1. Définition de l’ensemble de vérité
    1. Sélectionnez 50 individus séquencés à 30 fois la profondeur comme ensemble de données de base sur le terrain. Inclure ces échantillons dans les conditions de sous-échantillonnage expérimentale afin d’assurer la comparabilité.
    2. Effectuer l’appel variant pour l’ensemble de vérité en utilisant le pipeline suivant : SOAPnuke27 pour le contrôle qualité, BWA pour l’alignement, Picard pour le marquage des doublons, GATK v4.0.4.0 BQSR et HaplotypeCaller pour l’appel variant, DPGT (https://github.com/BGI-flexlab/DPGT) pour l’appel conjoint, et BCFtools v1.1123 pour le filtrage de qualité variant.
    3. Conservez uniquement les variantes PASS à haute confiance pour générer un fichier VCF de référence. Limitez l’évaluation à chr1:150 500 000-160 500 000, conformément aux ensembles de données imputés.
  2. Harmonisation et filtrage des données
    1. Traiter les fichiers VCF imputés de tous les outils en utilisant PLINK2.028. Extraire les données de dosage et convertir en format pgen.
    2. Appliquer un contrôle qualité au niveau SNP avec les filtres suivants : fréquence des allèles mineurs (MAF) ≥ 0,05 (--MAF 0,05), valeur p d’équilibre Hardy-Weinberg (HWE) ≥ 1e-6 (--hwe 1e-6), SNP bialléliques uniquement (--max-allèles 2).
    3. Exportez les variantes passant du QC vers le format traw pour une comparaison en aval.
  3. Indicateurs de précision
    1. Comparez les doses imputées avec les doses basiques pour chaque SNP. Calculer les coefficients de corrélation de Pearson (R) sur une base SNP par SNP, conserver uniquement les sites communs aux deux ensembles de données, et calculer la moyenne des coefficients de corrélation quadratique (R²) sur tous les SNP évalués afin de quantifier la précision globale de l’imputation pour chaque condition.
    2. Utilisez cette métrique de précision pour capturer la concordance des estimations de dosage de génotypes entre les génotypes imputés et vrais.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Impact de la taille de l’échantillon sur la précision de l’imputation
Augmenter la taille de l’échantillon de N = 200 à N = 500 a amélioré la précision de l’imputation de STITCH, en particulier dans des conditions de faible couverture. Par exemple, avec le panneau de référence CKB à une couverture 1x, STITCH a obtenu un R2> de 0,916 (N=500) contre 0,882 (N=200), ce qui représente une augmentation de 3,4 % (Figure 3

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a évalué systématiquement la performance de trois outils d’imputation de génotypes largement utilisés pour les ULDS, le WGS à haute profondeur servant de référence. Une force méthodologique clé réside dans l’adoption d’un pipeline de prétraitement unifié — englobant l’alignement, le contrôle qualité et le recalibrage du score de qualité de base — qui minimise les effets de batch et assure la comparabilité entre outils et conditions. En réduisant le échantillonnage d’échantill...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le Shenzhen Medical Research Fund (B2404004), le Programme national clé de recherche et développement de Chine (2023YFC2605400, 2022YFC2502402), le Shenzhen Science and Technology Program (SYSPG20241211173852024), le projet de recherche ouvert au Laboratoire clé d’État d’homéostasie vasculaire et de remodelage (Université de Pékin) (2025-SKLVHR-013), et le Programme de recherche et développement dans les domaines clés de la province du Guangdong (2023B0303040001).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Données
10 000 échantillons NIPT à faible profondeurCe documentDonnées de séquençage du génome complet ultra-faible et en profondeur utilisées pour le benchmark d’imputation.
500 échantillons WGS à haute profondeurCe document30 et fois ; WGS à haute profondeur utilisé comme référence d’excellence/ensemble de vérité.
Panel de référence
Panneau de référence 1KGP-EASProjet 1000 Génomes (Asie de l’Est)Sous-ensemble de 1KGP pour l’imputation spécifique à l’ascendance est-asiatique.
Panneau de référence CKBBanque biobiologique chinoise KadooriePanel personnalisé spécifique à la population pour l’imputation du génotype.
logiciel et algorithmes
BCFtools v1.11GitHub (samtools/bcftools)Utilisé pour fusionner et trier les résultats au niveau des chromosomes, ainsi que filtrer les variantes.
BQSR de l’ensemble d’outils GATK 4.0.4.0Institut BroadUtilisé pour le recalibrage du score de qualité de base (BQSR).
BWA-MEM .7.16a-r1181Heng Li / GitHubPour l’alignement des lectures brutes sur GRCh38.
DPGT (Outil de génétique des populations distribuées)BGIUn outil distribué d’analyse génétique des populations qui a permis la consultation conjointe de millions d’échantillons WGS. Disponible sur [GitHub - BGI-flexlab/DPGT](https://github.com/BGI-flexlab/DPGT)
fastp.0.23.4Open source (Chen et al., 2018)Pour le contrôle qualité et le découpage des adaptateurs.
GLIMPSE2Université d’OxfordPhasage rapide du génotype et imputation pour WGS à faible couverture
Code original pour les analysesCe documentFichier supplémentaire 1 Code original pour les analyses
Boîte à outils PicardInstitut BroadUtilisé pour marquer les doublons et convertir les formats de fichiers.
Plink 2.0C. Chang, S. Purcell / Institut BroadPour la conversion du format génotype et l’analyse d’association.
Python 3.8Fondation Python SoftwareUtilisé pour le scripting, l’automatisation et l’analyse de données.
QUILT2Institut Oxford Big DataImputation basée sur HMM à l’aide de panels de référence externes
R 4.1.3La Fondation RUtilisé pour exécuter STITCH, QUILT2 et tracer des statistiques.
SAMtools v1.3GitHub (samtools/samtools)Pour manipuler les fichiers SAM/BAM.
Seqtk-1.5GitHub (lh3/seqtk)Boîte à outils pour traiter des séquences aux formats FASTA/Q. Disponible sur [GitHub - lh3/seqtk](https://github.com/lh3/seqtk)
SOAPnukeBGIPour le contrôle de la qualité et le filtrage des données NGS.
STITCH v1.6.6Université d’OxfordOutil d’imputation optimisé pour le séquençage à très faible couverture
TabixGitHub (samtools/tabix)Utilisé pour indexer et interroger des fichiers VCF compressés par bgzip.
Autres Matériaux
Fichiers bundle GATKGATKDisponible à [https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json]
Carte génétique pour 1000G (GRCh38)Oxford / Projet 1000 GenomesNécessaire pour les outils de phase/imputation
GRCh38Consortium de Référence du GénomeUtilisé pour l’alignement des lectures et l’appel de variantes

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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