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Article de méthode

Modèle de gliome circulant pour l’investigation de la thérapie par cellules T à récepteur antigénique chimérique

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DOI :

10.3791/68881

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17 octobre 2025

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1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole établit un modèle de gliome circulant par injection dans le ventricule latéral afin d’étudier l’effet thérapeutique de la thérapie par cellules T à récepteur antigénique chimérique in vivo.

Résumé

Les cellules tumorales circulantes dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) sont un facteur important de récidive tumorale et de métastases intracrâniennes dans le gliome. De nombreuses études tentent d’identifier des stratégies efficaces pour cibler et éliminer la tumeur circulante dans le LCR. La thérapie par cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR) a été fréquemment utilisée pour diverses tumeurs circulantes. Cependant, la recherche est limitée en raison de l’absence d’un modèle approprié de gliome circulant. Ici, un modèle de gliome circulant a été développé et appliqué dans les investigations de thérapie cellulaire CAR-T. Ce modèle a été construit à l’aide de l’injection du ventricule latéral, qui est largement utilisée dans le traitement local des maladies intracrâniennes. Les cellules de gliome ont été injectées dans le ventricule latéral pour former la tumeur primaire intracrânienne. Les tumeurs qui ont été excrétées du ventricule latéral ont été utilisées pour indiquer la tumeur circulante dans le LCR. Le modèle est facile à construire et peut être appliqué dans diverses études sur la thérapie par cellules CAR-T du gliome circulant. En conséquence, le modèle de gliome circulant fournit un modèle unique de métastase de gliome pour des études efficaces de thérapie par cellules CAR-T de la tumeur circulante.

Introduction

Le gliome est la tumeur cérébrale maligne primitive la plus fréquente chez les adultes 1,2. Les traitements actuels, y compris la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, montrent une efficacité limitée, avec une survie médiane de seulement 14 à 15 mois 3,4,5. Les cellules de gliome circulantes dans le LCR jouent un rôle crucial dans la récidive tumorale et les métastases intracrâniennes 6,7. Par conséquent, il est urgent de développer des stratégies de traitement plus efficaces pour éliminer les cellules de gliome circulantes.

Les recherches récentes sur le gliome se sont principalement concentrées sur les tumeurs primaires intracrâniennes 8,9. Cependant, le problème le plus important qui doit être abordé en clinique est de savoir comment cibler et éliminer les cellules de gliome circulantes. Par conséquent, les études sur le gliome circulant avant ou après la chirurgie nécessitent plus d’attention. La thérapie par cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR) est la stratégie la plus couramment utilisée dans les études sur les cellules tumorales circulantes10,11. Cependant, en raison de la structure anatomique particulière des tumeurs intracrâniennes, il est difficile de développer un modèle de gliome circulant approprié, ce qui est essentiel pour l’étude du gliome circulant 12,13,14,15,16.

Cette étude a généré un modèle unique de gliome circulant basé sur l’injection du ventricule latéral. Dans ce modèle, les cellules de gliome sont injectées dans le ventricule latéral, et la tumeur primaire intracrânienne et la tumeur circulante dans le LCR sont détectées par imagerie bioluminescente in vivo et analyse par cytométrie en flux au jour 10. La thérapie CAR-T a été initiée lorsque la charge tumorale chez les souris modèles de gliome circulant a atteint environ 6,5 × 105p/s. La charge tumorale a été surveillée tous les 5 jours pour évaluer l’effet thérapeutique des cellules CAR-T. Ce modèle imite l’état de desquamation des cellules tumorales des patients atteints de gliome et peut être utilisé dans diverses études sur le gliome circulant.

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Protocole

Les expériences sur les animaux de cette étude ont toutes été approuvées et supervisées par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine de Nanjing (IACUC-1905048). Des souris femelles C57BL/6J, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des animaux

  1. Placez les souris dans une barrière, cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h, température ambiante de 24 °C et humidité relative de 50 % de la cage.
  2. Pesez les souris et anesthésiez-les (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement) avec une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique et de 10 mg/kg de xylazine17.
    REMARQUE : L’association de pentobarbital sodique et de xylazine est largement utilisée dans les procédures d’injection stéréotaxique chez la souris. L’anesthésie appropriée a été confirmée par l’absence de réponse à un pincement de l’orteil, ce qui a permis de s’assurer que l’animal était complètement inconscient avant l’opération. Pour prévenir la sécheresse et les lésions de la cornée, une pommade ophtalmique vétérinaire a été appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie.
  3. Retirez les poils de la tête d’une souris à l’aide d’un rasoir pour animaux de laboratoire et fixez la tête et les membres de la souris sur l’appareil stéréotaxique.
  4. Stérilisez la tête de la souris à l’aide de l’iodophore avec un coton-tige et couvrez le reste du corps de la souris avec la serviette chirurgicale stérile.
  5. Coupez le cuir chevelu d’environ 1 cm le long de la ligne médiane sur le haut du front droit avec un scalpel.
    REMARQUE :Tous les instruments chirurgicaux doivent être correctement stérilisés avant d’être utilisés pour prévenir l’infection. Il faut prendre soin de manipuler les instruments avec prudence pour éviter les blessures, et toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement stérile.
  6. Ajustez le clip nasal et la tige auriculaire en vous assurant que la différence de hauteur de l’axe Z entre la suture lambda et le bregma est inférieure ou égale à 0,05 mm.

2. Construction du modèle du gliome circulant

  1. Marquez le point à 1,5 mm sur le côté droit de la ligne médiane et à 1,1 mm sur le côté postérieur du bregma à l’aide d’un coton-tige trempé dans du violet de gentiane (coordonnées : AP -1,1 mm, ML -1,5 mm du bregma).
  2. À l’aide d’une perceuse crânienne miniature d’un diamètre de 0,5 mm, percez des trous aux coordonnées de la cible pour exposer la dure-mère.
  3. Rincer avec une solution saline pour enlever les débris osseux.
  4. Prélever 5 μL de suspension de cellules tumorales à l’aide d’une microseringue avec bouchon limitant la profondeur (GL261-Luc-Gfp, 1×105 cellules/μL dans du PBS contenant 0,1 % de BSA).
  5. Insérez l’aiguille à une vitesse de 0,2 mm/s jusqu’à une profondeur de 3,0 mm et remettez l’aiguille de 0,5 mm, faites une pause de 10 s pour stabiliser la pression tissulaire.
  6. Injecter les cellules à 1 μL/min à l’aide d’une pompe de micro-injection calibrée, avec un temps de séjour de 10 minutes après l’injection pour minimiser le reflux.
  7. Retirez lentement la microseringue, appliquez une pression sur le site d’injection avec un coton-tige stérile pendant 30 à 60 s.
  8. Suturez le cuir chevelu avec une suture chirurgicale résorbable (6-0), et désinfectez à nouveau l’incision avec de l’iodophore.
  9. Placez la souris sur un coussin chauffant à 37 °C contrôlé avec précision pour le réchauffer et surveillez son état de santé.
  10. Remettez la souris dans une cage propre après avoir démontré un réflexe de redressement soutenu et une locomotion spontanée.
  11. Imagez la souris avec un système d’imagerie bioluminescente in vivo (IVIS Spectrum) pour détecter la tumeur transplantée le 10e jour après la mise en place de la tumeur.
  12. Injecter à la souris par voie intrapéritonéale du sel de potassium D-luciférine (150 mg/kg).
    REMARQUE :Diluez le sel de potassium D-Luciférin à l’aide de D-PBS stérile.
  13. Induire l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 2 % dans 1 L/minO2 pendant la période d’attente de 10 minutes.
    REMARQUE : L’isoflurane doit être utilisé dans une hotte chimique ventilée pour minimiser l’exposition aux vapeurs anesthésiques. Il s’agit d’assurer la sécurité des animaux et des chercheurs pendant la procédure.
  14. Maintenir l’anesthésie à 1,5 % d’isoflurane via le cône nasal.
  15. Réalisez une imagerie bioluminescente à l’aide de l’IVIS Spectrum.
  16. Effectuer le prélèvement du LCR en perforant la citerne cérébelle-lémomédullaire chez la souris.
    REMARQUE : Le LCR a été recueilli par perforation de la citerne cérébelleuse chez des souris sous anesthésie à l’isoflurane. Toutes les procédures, y compris l’anesthésie, l’exposition chirurgicale et le prélèvement d’échantillons, ont été effectuées dans des conditions SPF afin de minimiser le risque de contamination et d’infection. Les souris ont été placées en position couchée sur un cadre stéréotaxique, et la citerne magna a été soigneusement exposée sous un microscope à dissection. Une aiguille de seringue Hamilton de 27 g a été utilisée pour percer la citerne et recueillir le LCR à l’aide d’une technique à main levée. Environ 5 à 10 μL de LCR clair ont été obtenus de chaque souris. Pour réduire davantage le risque d’infection, le site chirurgical a été stérilisé à l’iodophore avant la ponction, et tous les instruments chirurgicaux ont été autoclavés. Après le prélèvement du LCR, le site de ponction a été doucement comprimé avec du coton stérile pour arrêter toute fuite de liquide. Les souris ont ensuite été placées sur un coussin chauffant et surveillées en permanence jusqu’à ce qu’elles se remettent complètement de l’anesthésie. Des analgésiques postopératoires ont été administrés pour soulager l’inconfort. Les animaux ont été observés quotidiennement pendant au moins trois jours consécutifs pour s’assurer de l’absence de symptômes neurologiques ou de signes d’infection.
  17. Effectuer une cytométrie en flux pour détecter les cellules tumorales dans le LCR. La population GFP+ représente les cellules tumorales.
    REMARQUE : La lignée cellulaire de gliome murin GL261 a été conçue pour transporter la luciférase (Luc). Lorsque la valeur de fluorescence atteint ~5 × 10cellulestumorales 5 p/sable sont détectées dans le LCR, la procédure est réussie. Le logiciel d’imagerie utilisé était Living Image 4.5.2 et les paramètres d’imagerie étaient réglés sur Luminescent.
  18. Sélectionnez les souris dont la tumeur a réussi à porter une tumeur pour évaluer l’efficacité thérapeutique des cellules CAR-T.

3. Traitement du gliome circulant par injection de cellules CAR-T dans le ventricule latéral

  1. Lorsque la taille de la tumeur chez les souris modèles de gliome circulant devient ~6,5 × 105 p/s, sélectionnez ces souris pour le traitement CAR-T.
  2. Pesez les souris modèles de gliome circulant et anesthésiez les souris avec une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique et de 50 mg/kg de xylazine.
  3. Répétez le processus des étapes 1.3 à 1.5.
  4. Séparez le cuir chevelu et le crâne, et localisez précisément le trou de forage réalisé lors de la construction du modèle de gliome circulant, et suivez la procédure mentionnée aux étapes 2.2-2.3.
  5. Aspirez 10 μL de suspension de cellules CAR-T à l’aide d’une micro-seringue, insérez soigneusement l’aiguille dans le ventricule latéral de la souris, ajustez la profondeur d’injection à l’aide de l’appareil stéréotaxique et administrez lentement la solution de cellules CAR-T.
    REMARQUE : Conformément à l’injection de cellules GL261, des cellules CAR-T ont été injectées dans le ventricule latéral droit (coordonnées : AP -1,1 mm, ML -1,5 mm à partir du bregma), avec une profondeur d’injection de 2,5 mm.
  6. Maintenez l’aiguille pendant 10 min, puis retirez lentement l’aiguille et appuyez légèrement sur le point d’injection avec de la gaze stérile pour éviter tout saignement après la fin de l’injection. Suturez le cuir chevelu avec une suture chirurgicale résorbable (6-0) et désinfectez l’incision.
  7. Placez la souris sur un coussin chauffant à 37 °C contrôlé avec précision pour le réchauffer et surveillez son état de santé.
  8. Remettez la souris dans une cage propre après avoir démontré un réflexe de redressement soutenu et une locomotion spontanée.
  9. Réaliser une imagerie bioluminescente in vivo pour suivre la croissance des tumeurs chez la souris. L’imagerie optique permet d’évaluer l’efficacité thérapeutique des cellules CAR-T.
  10. Pesez les souris tous les deux jours et effectuez une imagerie BLI tous les 5 jours pour suivre plus précisément la croissance tumorale jusqu’à ce que le point final soit atteint.
  11. Euthanasier la souris et fixer le tissu cérébral dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 à 48 h.
  12. Incorporez les tissus dans de la paraffine et coupez-les en tranches de 5 m d’épaisseur.
  13. Déparaffinisez les sections, réhydratez-les à l’aide d’alcools gradués, colorez-les à l’hématoxyline, contre-colorez à l’éosine et fixez les sections à l’aide d’une lamelle.
    REMARQUE : Pour la présente étude, le critère d’évaluation final était le 30e jour, et les souris ont été euthanasiées par une surdose de pentobarbital sodique avec une injection intrapéritonéale. Les carcasses de souris ont été remises au Centre médical expérimental pour animaux de l’Université de médecine de Nanjing pour élimination. Les aiguilles jetées ont été placées dans un conteneur pour objets tranchants et remises au département de gestion des laboratoires et des équipements de l’Université de médecine de Nanjing pour une élimination centralisée.

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Résultats

Le schéma du modèle de gliome circulant pour la thérapie CAR-T est présenté à la figure 1. Des cellules CAR-T ont été injectées dans le ventricule latéral à l’aide d’une microseringue pour démontrer leur effet thérapeutique. Cette méthode permet l’administration directe des cellules CAR-T au cerveau, en ciblant les cellules de gliome circulantes. La procédure d’injection a été réalisée le 11e jour, après l’implantation de cellules GL261 dans le ventricule lat...

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Discussion

Le modèle de gliome circulant établi dans cette étude à l’aide de l’injection ventratrile latérale constitue une avancée significative, offrant plusieurs avantages par rapport aux modèles existants. La technique d’injection du ventricule latéral est hautement reproductible, ce qui permet une modélisation cohérente de la tumeur dans un laps de temps relativement court. Cela en fait un outil précieux pour les chercheurs qui cherchent à étudier la dissémination des cellules tumorales dans l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82230059), le Programme de développement de la recherche clé de la province du Jiangsu (BE2022770).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Suture chirurgicale résorbableShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdRéf. R611
CAR-TBiolabs créatifs
Sel de potassium D-LuciférinMCEHY-12591B
GL261-LUC-GFPShanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.ZQ0932
Système d’imagerie bioluminescente in vivoTanonTanon ABL X6
Rasoir pour animaux de laboratoireBiotechnologie BeyotimeFS600
SourisPlate-forme animale de l’Université de médecine de Nanjing
Pompe de micro-injectionRWDR462
MicroseringueHamilton87943
Mini exercice crânienRWD78001
Pentobarbital sodique  ;ChemSrc57-33-0
Appareil stéréotaxiqueRWD68043
XylazineChemSrc7361-61-7

Références

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

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