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Article de méthode

Une évaluation quantitative de la phagocytose des érythrocytes allogéniques et xénogéniques par les macrophages de rat in vitro

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DOI :

10.3791/68904

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22 août 2025

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1Institute of Regenerative Medicine, and Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Jiangsu University, 2Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Large Animal Models for Biomedicine, and South China Institute of Large Animal Models for Biomedicine, School of Pharmacy and Food Engineering, Wuyi University, 4State Key Laboratory of Cell Biology, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 5Innovation and Transformation Center, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6Prometheus RegMed Tech Ltd, 7Department of Medicinal and Life Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit un protocole in vitro standardisé permettant de quantifier et de comparer les taux de phagocytose des globules rouges xénogéniques (humains) et allogéniques (rats) par des macrophages de rats isolés.

Résumé

La greffe de cellules xénogéniques est souvent confrontée à un rejet immunitaire important, même dans les modèles animaux immunodéficients. Parmi les composants immunitaires résiduels, les macrophages peuvent phagocyter activement les cellules humaines transplantées, ce qui pose un défi à la greffe à long terme. Pour résoudre ce problème, nous avons mis au point un test in vitro standardisé pour quantifier la phagocytose médiée par les macrophages des globules rouges humains par rapport aux globules rouges (GR) de rat. Les macrophages péritonéaux de rats ont été isolés, cultivés et exposés à des globules rouges humains ou de rats. Les globules rouges humains ont été identifiés à l’aide de CD235a, tandis que les globules rouges de rats ont été prémarqués avec DeepRed. L’analyse par cytométrie en flux a été effectuée à l’aide de CD163 pour identifier les macrophages et l’exclusion du propidium iodé (PI) aux cellules vivantes de porte. Les résultats ont montré une différence substantielle dans l’activité phagocytaire : 5,08 % des macrophages ont englouti des globules rouges humains, tandis que seulement 1,59 % ont phagocyté des globules rouges de rat, ce qui donne un indice de phagocytose relatif de 3,21. Ce protocole permet une évaluation quantitative de la compatibilité immunitaire et offre une méthode reproductible pour évaluer les réponses immunitaires innées dans la xénotransplantation. Il a le potentiel d’affiner la sélection donneur-receveur et d’orienter les stratégies immunosuppressives dans la recherche translationnelle.

Introduction

Le recours à la greffe de cellules xénogéniques, en particulier la greffe de cellules humaines dans des modèles animaux, est une stratégie essentielle dans la recherche biomédicale1. Il permet d’évaluer la survie cellulaire, la greffe et les réponses immunitaires dans un environnement in vivo contrôlé. Alors que les modèles murins ont historiquement dominé ce domaine en raison de leur génétique bien caractérisée et de leur facilité de manipulation, leur petite taille présente une limitation significative dans les études nécessitant de grands volumes sanguins ou des rendements cellulaires élevés. En revanche, les rats offrent plusieurs avantages, notamment une plus grande masse corporelle, une meilleure pertinence physiologique pour les systèmes humains et un rendement plus élevé d’échantillons biologiques tels que le sang ou les macrophages péritonéaux2. Par conséquent, les modèles de rats sont de plus en plus utilisés dans les études impliquant la recherche sur l’hématopoïétique et le système immunitaire3.

L’un des principaux défis de la transplantation xénogénique est le rejet immunitaire. Même dans les modèles immunodéficients où les lymphocytes T, B ou NK sont génétiquement ablatés, les cellules immunitaires innées résiduelles, en particulier les macrophages, restent fonctionnellement actives4. Les macrophages servent de défenseurs de première ligne du système immunitaire de l’hôte, reconnaissant et éliminant les cellules étrangères par phagocytose5. Ce processus est en partie régulé par l’interaction entre le signal Regulatory Protein alpha (SIRPα) sur les macrophages et CD47, un signal « don’t eat me » exprimé sur la plupart des types de cellules. Lorsque le CD47 des cellules humaines n’est pas reconnu par le SIRPα de rongeurs, ce décalage peut entraîner une phagocytose accrue. Même chez ces animaux immunodéficients permissifs, ce phénomène existe également 6,7.

La quantification de la phagocytose médiée par les macrophages dans ce contexte est essentielle pour évaluer la probabilité de survie cellulaire et pour optimiser les stratégies de transplantation8. Bien que diverses méthodes in vivo et ex vivo aient été mises au point pour évaluer le rejet immunitaire, les essais in vitro normalisés pour la phagocytose des macrophages restent limités. Les méthodes traditionnelles basées sur la microscopie sont souvent laborieuses et manquent de rigueur quantitative. La cytométrie en flux, en revanche, offre une plateforme quantitative et de dosage basée sur une cellule unique capable de distinguer avec précision les types de cellules et de mesurer l’absorption phagocytaire grâce à la détection de marqueurs de surface.

Dans cet article, nous avons développé un test in vitro standardisé pour évaluer la phagocytose différentielle des globules rouges humains et rat par les macrophages péritonéaux du rat. Les globules rouges constituent un modèle idéal pour les tests de phagocytose en raison de leur structure simple et de l’expression de CD47, qui agit comme un signal « soi » pour inhiber la clairance médiée par les macrophages9. Dans ce protocole, les macrophages péritonéaux de rat sont récoltés par lavage péritonéal, cultivés in vitro et exposés à des globules rouges humains ou à des globules rouges allogéniques de rat marqués avec DeepRed. Après la co-incubation, la cytométrie en flux est utilisée pour évaluer l’internalisation des globules rouges par les macrophages. Les macrophages sont identifiés par l’expression de CD163, les globules rouges humains par CD235a et les globules rouges de rat par fluorescence DeepRed. Les cellules mortes sont exclues par coloration PI, ce qui garantit que seuls les macrophages viables sont analysés.

Cette approche permet une évaluation quantitative précise de l’activité phagocytaire des globules rouges allogéniques et xénogéniques in vitro, ce qui donne un aperçu de l’étendue de la clairance immunitaire médiée par les macrophages. Dans nos expériences, les macrophages de rat ont montré une phagocytose significativement plus élevée des globules rouges humains (5,08 %) que des globules rouges de rat (1,59 %), ce qui donne un indice de phagocytose relatif de 3,21. Ces résultats soulignent l’importance des mécanismes immunitaires innés dans les contextes xénogéniques et soulignent la valeur de ce test dans la validation de modèles précliniques.

En conclusion, le protocole présenté ici offre une méthode reproductible et efficace pour mesurer la phagocytose des macrophages in vitro. Il est particulièrement utile pour les chercheurs travaillant dans les domaines de la xénotransplantation, de la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques et des tests de compatibilité immunologique. En fournissant un cadre standardisé pour la quantification de la phagocytose, ce test peut contribuer à améliorer la reproductibilité expérimentale et à améliorer la compréhension des réponses immunitaires innées dans des modèles de transplantation inter-espèces.

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Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été menées conformément aux politiques et procédures éthiques approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Jiangsu (UJS-IACUC) (Approbation no. UJS-IACUC-2021090102). Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’hôpital affilié de l’Université du Jiangsu. Tous les échantillons ont été prélevés chez des patients qui avaient donné leur consentement éclairé. Le surnageant retiré doit être placé dans un réservoir dédié aux déchets liquides et remis au service des maladies infectieuses de l’hôpital.

1. Isolement des macrophages

  1. Préparation : Préparez le matériel nécessaire, y compris des rats expérimentaux, des récipients d’anesthésie, des béchers et de l’isoflurane comme anesthésique, et pré-refroidissez la centrifugeuse à 4 °C.
  2. Anesthésie et sacrifice des rats : Conformément aux directives institutionnelles en matière de soins aux animaux, euthanasiez les rats après avoir inhalé un anesthésie excessive d’isoflurane.
  3. Désinfection à l’alcool : Placez le rat sacrifié dans un bécher et ajoutez une quantité suffisante d’éthanol à 75 % pour couvrir complètement le rat. Faire tremper pendant 10 min.
  4. Injection et mélange de liquide abdominal : Désinfectez l’abdomen du rat et injectez 50 ml de PBS stérile glacé dans la cavité abdominale le long de la ligne médiane à l’aide d’une seringue.
    1. Secouez doucement le rat et massez la paroi abdominale avec les doigts pour assurer un mélange complet du liquide dans la cavité abdominale. Masser pendant 2-3 minutes.
  5. Prélèvement du liquide abdominal : Faites une petite incision dans la paroi abdominale du rat, inclinez légèrement le corps et aspirez le liquide abdominal à l’aide d’une seringue.
  6. Centrifugation : Centrifuger le fluide collecté à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  7. Lyse des globules rouges : Ajouter 3 à 5 fois le volume des pastilles cellulaires du tampon de lyse des globules rouges et mélanger doucement pendant 1 à 2 minutes.
    REMARQUE : Par exemple, si le volume de la pastille cellulaire est de 1 ml, ajoutez 3 à 5 ml de tampon de lyse. Cette étape peut être effectuée à température ambiante ou à 4 °C, suivie d’une centrifugation à 400-500 x g pendant 5 min. La centrifugation à 4 °C est plus efficace. En raison de la pression osmotique, les globules rouges se lysent et la solution devient rouge. Après la centrifugation, retirez le surnageant rouge.
    1. Recette de tampon de lyse des globules rouges (RBC) : Dissoudre 8,3 g de NH4Cl, 1,0 g de KHCO3 et 1,8 mL d’EDTA à 5 % dans 800 mL de H2O distillé, et filtrer la stérilisation à travers un filtre de 0,2 μm, qs à 1000 mL avec du H2O distillé, et ajuster le pH 7,2 ~ 7,4. Si le précipité rouge est toujours visible, répétez cette étape jusqu’à ce que la solution devienne claire et transparente. En règle générale, une petite quantité de globules rouges résiduels n’affecte pas les dosages ultérieurs (s’il y a peu de globules rouges dans la pastille, cette étape peut être omise).
  8. Lavage des cellules : Lavez les cellules deux fois avec environ 10 ml de milieu RPMI 1640 pré-refroidi. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C à chaque fois et jeter le surnageant.
  9. Remise en suspension et comptage des cellules : Remettez les cellules en suspension dans un milieu pré-refroidi composé de RPMI 1640 + 1 % FBS + 1 % de PS, comptez les cellules à l’aide de la coloration au bleu trypan et évaluez la viabilité des cellules.
  10. Culture cellulaire : Si une culture est nécessaire, ensemencer les cellules à une densité de 1 × 106/mL dans une plaque de culture à 24 puits, avec 1 mL de milieu RPMI 1640-10 % FBS-1 % PS par puits. Après 2 h d’incubation, remplacez le milieu et lavez les puits 1 à 2 fois avec le milieu RPMI 1640 pour éliminer les cellules non adhérentes.
    REMARQUE : Les cellules adhérentes formeront une monocouche de macrophages. Si une extraction de l’ARN est nécessaire, ajoutez 1 mL de Trizol à la pastille cellulaire, pipetez plusieurs fois pour perturber les cellules et transférez le mélange dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour une extraction immédiate de l’ARN ou conservez-le à -80 °C. Pour l’analyse FACS, ajustez le nombre de cellules à 1 × 106 par tube, ajoutez 20 μL de tampon FACS et procédez à la coloration FACS. Tampon FACS : DPBS + 2 % FBS, filtre stériliser à travers un filtre de 0,22 μm, stocké à 4 °C).

2. Collecte de globules rouges chez le rat ou chez l’humain

  1. Préparation : Pré-rincer des tubes à centrifuger de 15 mL et des seringues de 10 mL avec de l’héparine.
  2. Collecte de sang de cœur de rat : Après avoir anesthésié et sacrifié le rat, coupez soigneusement une petite section de la queue du rat avec des ciseaux et prélevez du sang dans la veine de la queue.
  3. Prélèvement de sang humain : Prélevez du sang humain à l’aide de la technique de ponction veineuse.
  4. Mélange d’échantillons de sang : Mélanger 1 mL de PBS avec 1 mL de sang veineux humain ou de sang de rat.
  5. Séparation par gradient de densité de Ficoll : Ajouter 1,5 mL de solution de Ficoll d’une densité de 1,077 à un tube à centrifuger de 15 mL pour le sang périphérique humain ; ajouter 1,5 mL de solution de Ficoll d’une densité de 1,084 à un tube à centrifuger de 15 mL pour le sang de rat.
  6. Superposition d’échantillons de sang : superposez lentement les échantillons de sang dilués le long de la paroi du tube de centrifugation sur la solution de gradient de densité correspondante.
  7. Centrifugation : Centrifugeuse à 400 x g pendant 30 min à une température de 18-20 °C.
  8. Élimination des couches plasmatiques et lymphocytaires : Retirez la couche supérieure de plasma, la couche lymphocytaire et la couche de solution de Ficoll, ne laissant que la couche inférieure de globules rouges.
  9. Lavage des globules rouges : Lavez les globules rouges une fois avec 10 ml de PBS.
  10. Centrifugation et élimination du surnageant : Centrifuger à 400 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
  11. Resuspension et comptage des cellules : Ajouter 1 mL de milieu RPMI 1640 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, mélanger avec une quantité appropriée de pastilles de globules rouges et effectuer le comptage des cellules.

3. Dosage de la phagocytose in vitro

  1. Isolement et culture de macrophages : Isolez les macrophages et ensemencez-les à une densité de 1 × 106 cellules/puits dans une plaque de culture à 12 puits. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 h pour permettre aux cellules d’adhérer.
  2. Élimination des cellules non adhérentes : Après 2 h d’incubation, retirez soigneusement les cellules non adhérentes et lavez-les délicatement avec le milieu RPMI 1640.
  3. Culture continue : Continuer à cultiver les macrophages adhérents jusqu’à 2 h pour assurer une adhérence complète au fond de la plaque de culture.
  4. Traitement de famine : Après 2 h, remplacer le milieu par du RPMI 1640 sans sérum et incuber dans des conditions de famine pendant 2 h pour améliorer l’activité phagocytaire des macrophages.
  5. Ajout de cellules humaines : Ajouter des cellules humaines pré-colorées avec DeepRed dans la plaque de culture et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 h pour permettre aux macrophages de phagocyter les cellules humaines.
  6. Conclusion et analyse : Après le test de phagocytose, observez l’activité phagocytaire au microscope ou quantifiez à l’aide de la cytométrie en flux (FACS).

4. Cytométrie en flux

  1. Préparation cellulaire : Digérez les cellules avec 0,05 % de trypsine-EDTA et arrêtez la digestion à l’aide d’un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Centrifugez les cellules, jetez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans le tampon FACS et comptez-les. Préparez 1 × 106 cellules par tube dans deux tubes. De plus, préparez un tube de globules rouges humains et un tube de globules rouges pour rats.
  2. Préparation d’un tube monocolore : Ajoutez l’anticorps CD163 anti-rat de souris dans un tube d’échantillon, l’anticorps CD235a anti-humain de souris dans le tube de globules rouges humains et DeepRed dans le tube de globules rouges de rat.
    1. Incuber ces tubes sur de la glace, à l’abri de la lumière, pendant 30 min, en les mélangeant toutes les 10 min. Ajoutez 1 ml de tampon FACS pour éliminer tous les anticorps non liés, centrifugez et jetez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de tampon FACS.
  3. Préparation de l’échantillon : Ajoutez CD163 anti-rat de souris, des anticorps CD235a anti-humains de souris et DeepRed dans les tubes d’échantillon. Incuber sur glace, à l’abri de la lumière, pendant 30 min, en mélangeant toutes les 10 min. Ajoutez 1 ml de tampon FACS dans chaque tube d’échantillon pour éliminer tous les anticorps non liés, centrifugez et retirez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de tampon FACS.
  4. Analyse : Exclure l’adhésion cellulaire par contrôle sur FSC-H par rapport à FSC-A. Utilisez les tubes à coloration unique pour ajuster la tension et les paramètres de compensation appropriés avant d’analyser les échantillons (Figure 1). Analysez les données à l’aide du logiciel FlowJo v10.8.1.
    REMARQUE : Les commandes monocolorées CD163-FITC et PI ont été utilisées pour régler la compensation.

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Résultats

Grâce à l’analyse par cytométrie en flux, nous pouvons déduire le taux de phagocytose des macrophages de rat vers les globules rouges humains et les globules rouges de rats. Les cellules mortes sont d’abord exclues à l’aide de l’IP. Les macrophages CD163-positifs qui expriment CD235a-positif indiquent la phagocytose des globules rouges humains. La proportion de macrophages qui ont des globules rouges héréditaires phagocytés est définie comme le taux de phagocytose des macrophages de rat ...

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Discussion

Cette étude a permis d’établir un test in vitro robuste et reproductible pour évaluer la phagocytose médiée par les macrophages des globules rouges xénogéniques et allogéniques. Dans cette étude, les globules rouges humains ont été marqués avec CD235a-BV421, tandis que les globules rouges de rats ont été colorés avec le colorant DeepRed. Lorsque les macrophages phagocytent les globules rouges marqués, les anticorps conjugués (CD235a-BV421) ou le colorant (DeepRed) sont internali...

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Déclarations de divulgation

JYG est conseiller scientifique auprès de Prometheus RegMed Tech Ltd. Les auteurs de gauche ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Nous tenons à remercier Mme Mei Fang, Mme Min Ma, Mme Yu-Tong Meng et M. Quan-Kai Lei pour leurs premières contributions. Cette recherche a été financée en partie par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82270697), le Projet de planification scientifique et technologique de la province du Guangdong de Chine (2021B1212040016), la Fondation de recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (2023A1515012574), l’Unité de culture des disciplines médicales clés de la province du Jiangsu (JSDW202229) et le Fonds d’innovation de l’écosystème du Laboratoire Haihe (HH24KYZX0008), la Fondation chinoise pour l’entrepreneuriat et l’emploi des jeunes - Incaier Public Welfare Fonds (HH25KYHX0003).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % de trypsine-EDTAThermoFisher25300062
Détecteur de cellules rouges profondesThermoFisher  ; C34565La poudre (15 & mu ; g) a été dissous dans le DMSO (20 & mu ; L)
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)SigmaD2650
Solution séline tamponnée phosphate de Dulbecco (DPBS)ThermoFisherC10010500BT
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144002
Ficoll-Paque PREMIUMCytiva17544602
Anticorps anti-humain de souris CD235a BV421BD Biosciences562938
Anticorps anti-rat de souris CD163BIO-RADMCA342F
Protéine KSigmaP2308
RPMI 1640ThermoFisher11875093

Références

  1. Ito, M., et al. NOD/SCID/GAMMAC(null) mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  2. Szpirer, C. Rat models of human diseases and related phenotypes: A novel inventory of causative genes. Mamm Genome. 33 (1), 88-90 (2022).
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  4. Rongvaux, A., et al. Corrigendum: Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 35 (12), 1211(2017).
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  10. Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Cytometry A. 85 (4), 313-321 (2014).
  11. Joffe, A. M., Bakalar, M. H., Fletcher, D. A. Macrophage phagocytosis assay with reconstituted target particles. Nat Protoc. 15 (7), 2230-2246 (2020).

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