Procédure simple et efficace pour l’hémostasie dans les artères de la souris

Résumé

Cette étude vise à développer une méthode efficace pour atteindre l’hémostasie dans les artères de la souris.

Résumé

Lors de la ponction artérielle ou de la canulation chez la souris, une ligature permanente de l’artère est souvent nécessaire en raison de la difficulté à atteindre l’hémostasie après le retrait de l’aiguille. Cela conduit à une lésion ischémique permanente dans la région tissulaire irriguée. Une telle ischémie localisée induit fréquemment des complications secondaires, compromettant les résultats expérimentaux dans les modèles animaux. La méthode actuelle vise à sceller le site de la ponction après la procédure tout en maintenant un flux sanguin normal, évitant ainsi l’ischémie postopératoire. Cette méthode consiste à prélever un fragment de tissu adipeux sur l’animal expérimental lui-même, à effectuer une ponction artérielle selon des techniques standard, puis à envelopper le site de la ponction avec le coussin adipeux pour obtenir une hémostasie tout en maintenant le flux sanguin. Dans cette étude, une ponction bilatérale de l’artère carotide commune a été réalisée sur des souris, suivie d’une hémostasie utilisant une technique d’enveloppement graisseux. L’imagerie par contraste au laser de particules (LSCI) n’a révélé aucune différence dans les changements de flux sanguin cérébral entre les groupes simulés et opérés de souris, et aucun changement significatif n’a été observé dans les mesures préopératoires versus postopératoires du flux sanguin cérébral dans le groupe opéré. L’évaluation histologique réalisée à 7, 14 et 28 jours après l’opération a révélé que : (1) une architecture cérébrale préservée (coloration H&E), (2) une morphologie neuronale intacte sans modifications dégénératives (coloration de Nissl), et (3) l’absence d’altérations pathologiques dans les coupes cérébrales. Cette technique d’hémostasie artérielle tire parti de la nature souple du tissu adipeux et des mécanismes physiologiques de coagulation. La procédure consiste à : (1) enrouler la graisse autologue autour du site de ponction, (2) la fixer par des points de suture pour assurer un contact optimal avec l’adventite artérielle, et (3) permettre au sang s’échappant de pénétrer l’interface adipteuse-artère où elle subit la coagulation. Ce mécanisme à triple action permet d’assurer une hémostasie fiable tout en préservant la perpétuité artérielle et en prévenant les complications ischémiques après l’opération. La méthode démontre une simplicité procédurale remarquable, une efficacité clinique et un excellent potentiel de traduction.

Introduction

Dans les modèles animaux, la création de lésions artérielles est une approche expérimentale largement utilisée pour modéliser diverses pathologies, y compris les modèles d’ischémie cérébrale-reperfusion, les modèles d’athérosclérose carotide (CCA) ou aortique (AO), et les modèles d’ischémie de la moelle épinière.

En prenant le modèle de l’ischémie cérébrale et de la réperfusion (MCAO) de la souris comme exemple, l’approche standard^{actuelle 1,2,3} consiste : à isoler l’artère carotide externe (ECA), à liger son extrémité distale, à pincer l’ECA proximale avec un clip artériel tout en plaçant une suture de support, à créer un trou de perforation entre ces points, à insérer rétrogradement un filament à travers le CCA, fixer le vaisseau et le filament avec la suture de l’épaule, transpercer l’ECA entre le site de ponction et la ligature distale, libérer la clip artérielle, rediriger le filament vers l’artère carotide interne (ACI) pour obstruer l’artère cérébrale moyenne, et lors du retrait du filament, liger l’ECA proximale.

Bien que cette procédure atteigne la réperfusion, elle ne fait que rétablir le flux sanguin entre le courant et l’ACI, laissant l’ECA définitivement déconnectée. Cette transection ECA provoque des lésions ischémiques des régions faciales ipsilatérales, une blessure non intentionnelle qui complique non seulement la procédure chirurgicale, mais introduit également un traumatisme déconcertant chez les animaux d’expérimentation, compromettant potentiellement les résultats de l’étude. Plus inquiétant encore, dans certains protocoles^{expérimentaux 4,5}, les chercheurs réalisent une ponction CCA directe, une suture est insérée pour établir le MCAO, puis retirée immédiatement, puis une ligature permanente aux deux extrémités du site de ponction pour l’hémostasie. Cependant, cette méthode augmente directement la pression vasculaire, augmentant ainsi la charge cardiaque et pouvant entraîner une insuffisance cardiaque⁶.

En utilisant le modèle de lésions endothéliales CCA ou AO de la souris avec un régime riche en graisses pour établir l’athérosclérose comme exemple, la méthodologie^{conventionnelle} 7,8,9,10 consiste à effectuer une ponction artérielle dans le CCA, l’aorte abdominale (AA) ou l’artère fémorale (CFA), l’insertion d’un cathéter ballonnet pour induire la dénudation endothéliale, et l’atteinte d’une hémostasie en ligant définitivement les deux extrémités du site de ponction. Cette approche standard présente plusieurs limites critiques : la ligature obligatoire crée une ischémie localisée distale au site d’occlusion. Plus préjudiciable encore, l’accumulation lipidique se produit aux sites de ligaturage. La validité du modèle de compromis est modifiée par l’effet de l’hémodynamique locale, ce qui interfère avec l’administration du médicament vers les lésions ciblées et fausse les résultats de l’évaluation pharmacologique.

Dans le modèle d’ischémie de la moelle épinière murine, la procédure consiste en une ponction artérielle (via accès CCA, AA ou CFA) suivie de l’insertion d’un cathéter ballonnet pour induire une ischémie à des endroits^{ciblés 11}. Après le retrait du ballonnet, l’hémostase conventionnelle est obtenue en ligant de façon permanente le site de la ponction de façon bilatérale.

Dans les trois modèles mentionnés précédemment, l’hémostasie post-ponction est uniformément atteinte par ligature bilatérale du site de la ponction. Bien qu’efficace pour le contrôle des hémorragies, cette approche induit inévitablement une ischémie localisée, entraînant des complications secondaires qui compromettent finalement la validité du modèle. Le maintien de la permanence vasculaire lors des procédures hémostatiques est donc crucial sur le plan physiologique et expérimental. Ainsi, cet article présente une méthode d’hémostasie artérielle innovante, simple et efficace pour les expériences sur la souris. La procédure consiste d’abord à pincer les deux extrémités du site de la ponction avec des clips vasculaires artériels, puis à envelopper l’artère d’un coussin adipeux de 3 mm × 3 mm × 1 mm pour couvrir la perforation. Le coussin adipeux est fixé en place par une suture de ligature autour de l’artère. Les clips artériels sont progressivement relâchés, et la tension de la ligature est ajustée en fonction du saignement jusqu’à l’atteinte d’une hémostasie complète. Cette approche restaure le flux sanguin, maintient une hémodynamique normale et prévient les lésions ischémiques des tissus environnants causées par la ligature permanente des vaisseaux. Il est particulièrement avantageux pour l’observation post-modélisation à long terme des affections murines et pour évaluer les interventions pharmacologiques, renforçant ainsi significativement la rigueur expérimentale des études précliniques.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été menées en stricte conformité avec les Directives pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (Protocole d’approbation n° SNLL25040501 ; Licence d’utilisation animale n° SYXK(Liao)2021 - 0010) créée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université agricole de Shenyang. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation expérimentale

1. Détails et documentation sur les animaux : Documentez toutes les données de recherche animale en suivant les directives ARRIVE (Recherche animale : rapport d’expériences In Vivo). Utilisez des souris Balb/C mâles âgées de 6 à 8 semaines, pesant 22 g ± 4 g. Maintenir les conditions de logement à 24 ± 2 °C avec 55 % ± 5 % d’humidité relative sous un cycle clair/obscur de 12 heures.
2. Préparation animale
   1. Anesthésiez les souris à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane (selon les protocoles approuvés par l’institution). Induire une anesthésie avec 4 % d’isoflurane, puis maintenir avec 2 % d’isoflurane.
   2. Après anesthésie, dépilez les régions cervicales et crâniennes et désinfectez la peau exposée avec du povidone-iode, suivi d’un traitement à 75 % d’éthanol pour éliminer les résidus.
   3. Placez les souris sur une bouillotte à 37 °C pour toutes les procédures expérimentales ultérieures.
3. Mesure du flux sanguin cérébral de base chez la souris
   1. Placez les souris en position couchée. Faites une incision médiane du cuir chevelu pour exposer les os pariétaux. Disséquez soigneusement et retirez la couche fasciale sous-jacente à la surface du crâne.
   2. Ajustez le système LSCI pour scanner l’os pariétal de la souris exposé à un gros 10x, et enregistrez les données de base du flux sanguin cérébral.
4. Prélève le coussin graisseux et effectue la ponction artérielle
   1. Repositionnez les souris en position couchée. Faites une incision cervicale médiane. Prélever un greffon de tissu adipeux sous-cutané de 3 mm × 3 mm × 1 mm pour une utilisation ultérieure.
   2. Effectuer une dissection contondante de la glande sous-mandibulaire, du muscle sternohyoïdien et du muscle sternocléidomastoïdien. Exposez les deux CCA.
   3. Libérer la CCA pour exposer l’ICA et l’ECA.
   4. Appliquer la pince vasculaire 1 à l’extrémité distale du CCA, puis placer la pince vasculaire 2 à l’extrémité proximale.
   5. Percez le CCA entre les deux serrages à l’aide d’une aiguille de 23 G.
5. Application du coussin gras
   1. Après le retrait de l’aiguille, enroulez le CCA au point de la ponction avec la surface coupée (côté non sérosa) du coussinet graisseux.
   2. Placez une suture 4-0 sous la zone enveloppée de graisse ; puis attachez un seul coup délicatement sur la surface grasse pour appliquer une pression et assurer un contact sécurisé entre le coussin adipeux et la paroi du vaisseau ; Enfin, ajustez progressivement la ligature pour obtenir un équilibre de pression pour l’hémostasie.
   3. Élever le CCA distal avec un coton-tige humide. Relâchez la pince vasculaire 1 et retirez lentement le prélèvement pour permettre un flux sanguin progressif vers le site de la ponction.
   4. Vérifiez la circulation sanguine ; si un saignement actif a été observé, récupérer la CCA distale avec une pince vasculaire 1.
   5. Attendre 1 minute, puis relâcher lentement la pince vasculaire 1 ; en cas de saignement, repositionner le coussinet adipeux ou resserrer légèrement le coup unique de la ligature pour augmenter la pression ; Poursuivez ces ajustements jusqu’à ce que l’hémostasie complète soit atteinte.
   6. Élever la CCA proximale avec un coton-tige humidifié. Relâchez la pince vasculaire 2 et retirez progressivement le prélèvement pour permettre un flux sanguin contrôlé vers le site de la ponction.
   7. En cas de saignement, récupérez la CCA distale avec une pince vasculaire 2.
   8. Serrez légèrement le seul coup de suture pour augmenter la pression ; attendre 1 minute, puis relever la CCA proximale et libérer la pince vasculaire 2 ; Roulant lentement le coton humidifié vers le site de la perforation.
   9. Si le saignement persiste, répétez les deux étapes précédentes jusqu’à atteindre une hémostasie complète.
   10. Placez un coup supplémentaire avec la suture pour former un double nœud au-dessus du nœud initial, assurant ainsi une meilleure fixation du coussin adipeux à la paroi du vaisseau et permettant une hémostasie grâce à des pressions intravasculaires et externes équilibrées.
   11. Confirmer que les artères carotides communes de chaque côté du coussinet adipeux étaient remplies et présentent un diamètre constant des vaisseaux ; Considérez cela comme une restauration réussie du flux sanguin et une hémostasie.
   12. Répétez la même procédure pour réaliser une hémostasie par ponction sur l’artère carotide commune controlatérale.
   13. Exposez les artères carotides bilatérales communes chez les souris fausses sans effectuer de ponction artérielle ni d’enveloppement de coussinet graisseux, tout en conservant toutes les autres procédures identiques à celles du groupe opéré.
   14. Suture l’incision chirurgicale cervicale et appliquez un antiseptique.
6. Réalisation d’une évaluation postopératoire du flux sanguin cérébral
   1. Après la réalisation de l’hémostase bilatérale par ponction CCA chez la souris, on ajuste le système LSCI pour scanner l’os pariétal exposé et obtenir des images agrandies 10x ; Puis notez les changements de flux sanguin cérébral.
   2. Suturez l’incision du cuir chevelu et appliquez de l’antiseptique, laissez les souris récupérer sur une bouillotte à 37 °C avant de les remettre dans la cage pour des soins continus.
7. Réalisation de la surveillance postopératoire et de la collecte de tissus
   1. Surveillez et enregistrez quotidiennement l’état de survie, l’activité motrice et tout signe de saignement dans la région cervicomandibulaire des souris pendant la période postopératoire.
   2. Aux jours postopératoires 7, 14 et 28, euthanasiez les souris avec du dioxyde de carbone (selon les protocoles approuvés par l’institution) et fixez les tissus cérébraux avec 4 % de paraformodéhyde.

2. Examen pathologique

1. Après fixation de 24 heures, déshydratez les tissus cérébraux à travers un gradient d’éthanol, clarifiez avec du xylène, puis plongez-les dans la paraffine pour le sectionnement.
2. Effectuer une coloration H&E sur des sections hippocampiques et examiner la morphologie du tissu cérébral au microscope.
3. Effectuer une coloration de Nissl sur des sections hippocampiques et examiner l’architecture neuronale au microscope.

Résultats

L’analyse des données d’imagerie par contraste de speckle laser pré- et postopératoire ainsi que des mesures relatives de perfusion dans les groupes placebo et opéré n’a révélé aucun changement significatif, démontrant que cette technique d’hémostasie artérielle a réussi à sceller le site de ponction de l’artère carotide courant sans compromettre le flux sanguin cérébral (Figure 1).

Les souris du groupe opéré ont été surveillées e...

Discussion

Dans les modèles MCAO, la préservation de l’ECA reproduit mieux la pathologie clinique en prévenant les lésions ischémiques faciales associées à la ligature et à la transection ECA. Si l’approche conventionnelle d’insertion de filament par ponction CCA offre une simplicité technique, elle nécessite une ligature bilatérale du site de ponction, ce qui entraîne une perfusion cérébrale dépendant de la circulation collatérale du Cercle de Willis, une représentation sous-optimale de l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4-0 avec aiguille à coudre filée	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd
Souris Balb/C	Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd		6-8 femmes, homme
Four chauffant et séchage série DHG	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd	DHG-9123A
Hématoxyline et éosine (H& ; E) Kit de teinture haute définition	Servicebio	G1076-500ML
Isoflurane	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	R510-22
Analyseur de speckles laser	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	RFLSI ZW
Solution de colorant Nissl	Servicebio	G1036-100ML
Machine d’intégration organisationnelle	Leica	HistoCore Arcadia H
Système d’imagerie par diapositive	Shenzhen Shengqiang Technology Co., Ltd	SQS-40R
Machine d’anesthésie pour petits animaux	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd	R500
Déshydrateur tissulaire	Leica	Perle HistoCore
Système d’eau ultrapure	Thermo	50132370
Microtome semi-automatique ultra-fin	Leica	HistoCore MULTICUT