Dans cette étude, nous présentons un test cellulaire in vitro pour identifier les produits chimiques tératogènes. La dynamique de la signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF)/facteur de réponse sérique (SRF) a été mesurée dans les cellules rapporteures de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS), et le risque de tératogénicité a été évalué en quantifiant la perturbation chimique de cette voie de signalisation.
Article de méthode
Essai de toxicité pour le développement basé sur la surveillance en temps réel de la perturbation du signal du facteur de croissance des fibroblastes dans les cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Dans cet article
Résumé
Résumé
La toxicité pour le développement (Devtox) est généralement évaluée dans des modèles animaux. Cependant, il existe des défis pour garantir l’exactitude, tels que les faux négatifs dus aux différences entre les espèces et les préoccupations éthiques concernant le bien-être animal. Par conséquent, il est nécessaire de mettre en place de nouveaux systèmes de test pour évaluer le Devtox humain et aider à résoudre ces problèmes. Nous avons émis l’hypothèse que les tératogènes perturbent les voies de signalisation liées à Devtox essentielles à la morphogenèse, quelles que soient leurs cibles moléculaires. Pour tester cette hypothèse, nous avons développé un système de rapporteur du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) à l’aide de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS). Ce système permet de quantifier les perturbations du signal causées par des produits chimiques, atteignant un taux de précision de 83 % pour les composés tératogènes et non tératogènes connus. Étant donné que l’activité de signalisation Devtox change au fil du temps, il est important de capturer sa dynamique en continu plutôt que de la mesurer à un seul point final. L’utilisation d’un système de mesure de la luminescence en temps réel est facultative, mais il améliore la résolution temporelle avec moins de main-d’œuvre. L’ensemble du test peut être réalisé en 1 semaine, de l’ensemencement des cellules dans une plaque de culture à l’acquisition des données de luminescence.
Introduction
Certains produits chimiques provoquent une toxicité pour le développement (Devtox), notamment des retards de croissance, des malformations, des déficits fonctionnels et la mort1. L’évaluation de Devtox est essentielle pour garantir la sécurité des produits pharmaceutiques et des pesticides2. Les tests Devtox actuels reposent généralement sur plusieurs modèles animaux. Cependant, en raison des différences entre les espèces, les modèles animaux ont des limites inhérentes lors de l’extrapolation des résultats aux humains3. La thalidomide, une substance toxique bien connue pour le développement, a été prescrite pour la première fois aux femmes enceintes à la fin des années 1950 pour soulager les nausées matinales. Bien que la tératogénicité n’ait pas été observée chez les rongeurs, de graves malformations des membres chez les nouveau-nés humains ont été signalées dans le monde entier. Cette tragédie a mis en évidence les limites des tests de sécurité sur les animaux et a incité la communauté internationale à déployer des efforts pour introduire et réviser les directives de test Devtox4. De plus, le bien-être des animaux, ainsi que le temps et les coûts considérables nécessaires aux essais sur les animaux, soulèvent des préoccupations. Par conséquent, d’autres tests in vitro capables de prédire avec précision le Devtox humain sont nécessaires5.
Ici, nous proposons un essai in vitro pour évaluer les toxiques pour le développement en fonction de la perturbation des voies de signalisation qui sont essentielles au développement embryonnaire 6,7,8. Le test est réalisé à l’aide de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) génétiquement modifiées pour exprimer la luciférase NanoLuc (Nluc), un gène rapporteur luminescent, sous le contrôle de l’élément de réponse sérique (SRE). Le SRE est le site de liaison du facteur de réponse sérique (SRF), un facteur de transcription dans la voie de signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF). La SRF intègre les signaux de plusieurs ligands et régule l’expression de plus de 200 gènes qui jouent un rôle essentiel dans divers processus biologiques, y compris le développement embryonnaire9.
Dans cet essai, les cellules rapporteures ont été exposées à un produit chimique d’essai et stimulées avec du FGF pour activer la signalisation et amplifier toute interférence du produit chimique. L’une des principales caractéristiques de ce test est la capture de la dynamique de l’activité de signalisation lorsque l’intensité de la luminescence change. Étant donné que l’activité de signalisation varie au fil du temps, les mesures du point final à un seul point temporel peuvent être imprécises10. En effet, les mesures effectuées à sept points temporels sur une période de 24 heures ont démontré une meilleure précision prédictive, avec une valeur d’aire sous la courbe (AUC) de 0,837.
Les produits chimiques d’essai peuvent être appliqués à une large gamme de concentrations, de 0,01 ng/mL à 1000 μg/mL, en fonction de la cytotoxicité et de la solubilité. Environ 1,4 × 104 cellules sont nécessaires pour ensemencer une seule plaque de 96 puits. L’une des limites de ce test est que les produits chimiques tératogènes peuvent ne pas être détectables s’ils agissent par l’intermédiaire de cibles non exprimées dans des cellules iPS humaines indifférenciées. De plus, ce test peut ne pas capturer les métabolites tératogènes. De plus, il ne fournit pas d’informations sur les mécanismes détaillés sous-jacents à la toxicité tératogène ou ses résultats spécifiques.
L’utilisation d’un système de surveillance de la luminescence en temps réel améliore encore la résolution temporelle, réduit la main-d’œuvre nécessaire aux mesures continues et minimise les artefacts dus à la manipulation répétée des plaques de culture. Nous présentons ici un protocole détaillé pour le test Devtox basé sur la perturbation du signal. L’ensemble de la procédure peut être terminé en une semaine. Cette approche peut être automatisée, ce qui la rend adaptée au dépistage chimique et contribue à une réduction des tests sur les animaux.
Protocole
Des cellules iPS humaines (201B7) ont été utilisées dans cette étude, le gène Nluc étant sous le contrôle d’un élément de réponse sérique (SRE) introduit dans le locus AAVS1 (Adeno-Associated Virus Integration Site 1) à l’aide du système CRISPR-Cas9 (Figure 1A). Les détails de l’édition génomique pour les cellules rapporteures (cellules iPS humaines SRE-Nluc-knocked-in) ont été rapportés ailleurs6. Le protocole est principalement divisé en trois étapes : 1) un test de cytotoxicité d’un produit chimique pour déterminer sa concentration maximale d’exposition, 2) un test de perturbation du signal et 3) l’analyse des données.
Pour minimiser l’influence de l’évaporation du milieu, effectuez toutes les expériences de culture cellulaire en utilisant les 60 puits centraux d’une plaque de 96 puits, et ajoutez de l’eau dans les puits les plus extérieurs et les espaces interpuits. Recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité perméable aux gaz pendant l’incubation afin de réduire davantage l’évaporation.
1. Préparation cellulaire
- Cultivez les cellules rapporteures pendant au moins 2 semaines après la décongélation du bouillon congelé. Maintenez les cellules selon un calendrier répétitif de 7 jours et utilisez les cellules du jour 7 pour le test. Optimiser la densité de semis à ~80 % de confluence le jour du passage.
- Ensemencer des cellules uniques à 2,0 × 105 cellules/puits dans une plaque à six puits recouverte d’ECM avec 2 mL de milieu d’entretien frais complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM.
- Après 24 h, remplacer le milieu par 2 mL/puits de milieu d’entretien frais.
- À 72 h, prélever des cellules à l’aide d’un réactif de dissociation à base d’enzymes pour obtenir une suspension unicellulaire. Grainer à 1,0 × 105 cellules/puits dans une plaque à six puits recouverte d’ECM avec 2 mL de milieu d’entretien frais complété par un inhibiteur de ROCK 10 μM.
- Après 24 h, remplacer le milieu par 4 mL/puits de milieu d’entretien frais.
- Après 96 h, prélever les cellules sous forme de suspension unicellulaire à l’aide d’un réactif de dissociation à base d’enzymes. Utilisez ces cellules pour le test du rapporteur.
2. Essai de cytotoxicité
- Test préliminaire
- Semez des cellules uniques à 2,0 × 104 cellules/puits dans une plaque de 96 puits recouverte d’ECM avec 200 μL de milieu d’entretien frais complété par un inhibiteur de ROCK 10 μM. Scellez la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 24 h, remplacer le fluide par 200 μL/puits de fluide d’entretien frais et refermer la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 72 h, remplacer le milieu par 100 μL/puits de milieu de dosage et refermer la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 96 h, remplacer le milieu par 100 μL/puits de milieu de dosage.
REMARQUE : Si la confluence de 100 % n’est pas atteinte, interrompre le test. Étant donné que le taux de croissance peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre, optimisez la densité de semis pour assurer une confluence complète le jour de l’essai. - Dissoudre la substance d’essai dans le milieu d’essai jusqu’à sa solubilité maximale.
REMARQUE : Lorsque le diméthylsulfoxyde (DMSO) est utilisé comme solvant, la concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,1 %. - Préparer une dilution en série en cinq points et en cinq fois la substance d’essai dans le milieu d’essai à l’aide de la solution décrite à l’étape 2.1.5.
- Ajouter 11 μL/puits des solutions chimiques de l’étape 2.1.6. Pour le contrôle du véhicule, ajouter 11 μL/puits de milieu de dosage contenant la même concentration de DMSO.
- Après 48 h, incuber les plaques à 25 °C pendant 30 min.
- Ajouter 111 μL/puits de réactif d’essai de viabilité cellulaire luminescente pré-équilibré à base d’ATP à 25 °C. Pour le blanc, préparer un puits contenant 111 μL de milieu de dosage et 111 μL de réactif.
- Agitez la plaque à 300 tr/min pendant 2 min à l’aide d’un agitateur de microplaques.
- Transférez 200 μL du mélange sur une plaque noire pour la mesure de la luminescence. Incuber les plaques à 25 °C pendant 10 min.
- Mesurez l’intensité de la luminescence pour estimer le nombre de cellules.
- Calculez la viabilité cellulaire à l’aide de la formule suivante :
Viabilité cellulaire ( %) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
REMARQUE : Déterminez les étapes subséquentes en fonction de la viabilité cellulaire. Si la viabilité est de >50 % à toutes les concentrations testées, passer à l’étape 2.2 avec la concentration maximale de solubilité. Si la viabilité dépasse 50 % à l’intérieur de la plage d’essai, passer à l’essai de détermination en utilisant la concentration la plus élevée avec une viabilité de >50 %. Si la viabilité est de <50 % à toutes les concentrations, répéter l’essai préliminaire en commençant par une concentration plus faible.
- Test de détermination
- Semez des cellules uniques à 2,0 × 104 cellules/puits dans une plaque de 96 puits recouverte d’ECM avec 200 μL de milieu d’entretien frais complété par un inhibiteur de ROCK 10 μM. Scellez la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 24 h, remplacer le fluide par 200 μL/puits de fluide d’entretien frais et refermer la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 72 h, remplacer le milieu par 100 μL/puits de milieu de dosage et refermer la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 96 h, remplacer le milieu par 100 μL/puits de milieu de dosage.
REMARQUE : Si la confluence de 100 % n’est pas atteinte, interrompre le test. Optimiser la densité de semis pour assurer une confluence complète le jour 4. - Dissoudre la substance d’essai dans le milieu d’essai selon les résultats de l’essai préliminaire (étape 2.1).
- Préparer une dilution en série en neuf points, en deux volets, de la substance d’essai dans le milieu d’essai à l’aide de la solution décrite à l’étape 2.2.5.
- Ajouter 11 μL/puits des solutions chimiques de l’étape 2.2.6. Pour le contrôle du véhicule, ajouter 11 μL/puits de milieu de dosage contenant la même concentration de DMSO.
- Après 48 h, incuber les plaques à 25 °C pendant 30 min.
- Ajouter 111 μL/puits de réactif d’essai de viabilité cellulaire luminescente pré-équilibré à base d’ATP à 25 °C. Pour le blanc, préparer un puits contenant 111 μL de milieu de dosage et 111 μL de réactif.
- Agitez la plaque à 300 tr/min pendant 2 min à l’aide d’un agitateur de microplaques.
- Transférez 200 μL du mélange sur une plaque noire pour la mesure de la luminescence. Incuber les plaques à 25 °C pendant 10 min.
- Mesurez l’intensité de la luminescence pour estimer le nombre de cellules.
- Calculez la viabilité cellulaire à l’aide de la formule suivante :
Viabilité cellulaire ( %) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100 - Générer une courbe dose-réponse à l’aide des données de neuf concentrations et calculer la CI50 à partir de la courbe.
3. Dosage du rapporteur en temps réel (Figure 1B)
- Semis de cellules uniques à 2,0 × 104 cellules/puits dans une plaque de 96 puits recouverte d’ECM avec 200 μL de milieu d’entretien frais complété par un inhibiteur de ROCK 10 μM. Scellez la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 24 h, remplacer le fluide par 200 μL/puits de fluide d’entretien frais et refermer la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 72 h, remplacer le milieu par 100 μL/puits de milieu de dosage et refermer la plaque avec un film perméable aux gaz.
- À 96 h, remplacer le milieu par 100 μL/puits de milieu de dosage contenant 1 % de substrat luminescent.
REMARQUE : Si la confluence de 100 % n’est pas atteinte, interrompre le test. Comme le taux de croissance peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre, optimisez la densité de semis pour assurer une confluence complète le jour 4. - Dissoudre la substance d’essai dans le milieu d’essai à la concentration déterminée au § 2.
- Préparer une dilution en série en huit points, en deux volets, de la substance d’essai dans un milieu de dosage, à partir de la solution préparée à l’étape 3.5.
- Deux heures après le remplacement du milieu à l’étape 3.4, ajouter 11 μL/puits des solutions chimiques de l’étape 3.6. Pour le contrôle du véhicule, ajouter 11 μL/puits de milieu de dosage contenant la même concentration de DMSO.
- Une heure après le début de l’exposition chimique (étape 3.7), ajouter 12 μL/puits de milieu d’essai contenant du bFGF à une concentration finale de 2 ng/mL.
- Mesurez la luminescence en continu pendant 48 h à l’aide d’un système de mesure de luminescence en temps réel sous atmosphère humidifiée, 5 % CO2 à 37 °C.
REMARQUE : Réglez le temps 0 au point d’addition FGF (voir Figure 1B).
4. Analyse des données (figure 1C)
- Calculer le log2 fold variation (LogFC) de l’intensité de luminescence en normalisant le groupe d’essai en fonction de la commande du véhicule :
LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle) - Intégrer LogFC sur la série chronologique de 48 heures pour estimer l’aire entre les courbes (ABC) pour les groupes d’essai et de contrôle du véhicule.
- Somme des valeurs ABC pour toutes les concentrations afin de quantifier l’ampleur globale de la perturbation du signal causée par la substance d’essai.
- Effectuez une analyse de la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) pour déterminer le seuil de classification Devtox.
Résultats
D’après notre expérience, la morphologie cellulaire est utile pour déterminer si un test a été effectué correctement. La figure 2A montre des images de microscopie confocale typiques de cellules immédiatement avant et après l’exposition aux produits chimiques. À la fin de l’essai, presque toute la surface des puits est recouverte de cellules. La figure 2B montre des images de coloration de cellules vivantes/mortes. Le nombre de cellules mortes colorées à l’iodure de propidium (PI) augmente après l’exposition à des produits chimiques ; cependant, la viabilité cellulaire est d’au moins 50 % et presque toutes les cellules sont colorées avec de la calcéine-AM.
Le tableau 1 énumère les produits chimiques d’essai utilisés dans nos études précédentes 7,8. Ces études démontrent que les produits chimiques Devtox peuvent être distingués avec une précision accrue en fonction de la perturbation du signal FGF dans les cellules iPS humaines. L’une des principales conclusions est que la surveillance continue de l’activité de signalisation est essentielle car elle change de manière dynamique au fil du temps. L’utilisation d’un système de mesure de la luminescence en temps réel offre une résolution temporelle considérablement plus élevée avec moins de travail de mesure. Nous décrivons ici un protocole qui utilise un système de surveillance en temps réel.
La figure 3A montre les variations de l’intensité de la luminescence sur 48 h dans six puits répétés dans les mêmes conditions sans le produit chimique d’essai. Les six courbes sont presque alignées, ce qui indique une bonne reproductibilité de puits à puits. Bien qu’ils n’aient pas été clairement identifiés dans les mesures manuelles sur 24 heures dans nos études précédentes, deux pics distincts - un pic initial immédiatement après l’ajout de ligands FGF et un second pic à environ 24 h - apparaissent dans les mesures en temps réel sur 48 heures. La figure 3B montre les changements d’intensité de luminescence lors de l’exposition à l’acide valproïque (VPA), une substance toxique bien connue pour le développement. Le VPA est un inhibiteur de l’histone désacétylase qui provoque des anomalies du tube neural, du cœur et des membres¹¹. VPA perturbe la signalisation FGF d’une manière dépendante de la concentration. Le système de mesure automatisé en temps réel a capturé la dynamique du signal avec plus de précision que les mesures manuelles.
Figure 1 : Test de perturbation du signal FGF/SRF. (A) Génie génétique de cellules iPS humaines pour générer des cellules rapporteures de signal FGF/SRF. Un plasmide contenant Nluc en aval de l’élément de réponse sérique, des bras homologues pour l’entraînement ciblé et le gène de résistance à la puromycine sous le contrôle du promoteur de la phosphoglycérate kinase humaine. Après la sélection de la puromycine, des cellules rapporteures de SRE-Nluc ont été établies. (B) Calendrier de l’essai. Les cellules rapporteures ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits et cultivées pendant 4 jours pour couvrir toute la surface. Le substrat luminescent et le produit chimique d’essai ont été ajoutés respectivement 3 et 1 h avant de commencer la mesure. Le temps d’ajout du ligand FGF a été fixé à 0 h, et l’intensité de la luminescence a été mesurée en continu pendant les 48 heures suivantes. (C) Analyse des données. La dynamique du signal a été enregistrée dans des cellules exposées et non exposées aux produits chimiques d’essai et normalisée à la commande du véhicule pour estimer l’aire entre les courbes en tant que degré de mesure de la perturbation du signal causée par un produit chimique. Des valeurs ABC ont été obtenues pour chaque produit chimique à des concentrations différentes, et leur somme a été calculée. L’analyse de la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur a été effectuée à l’aide de tous les toxiques pour le développement connus testés pour déterminer le seuil. Abréviations : iPS = cellules souches pluripotentes induites ; RLU = unité de lumière relative ; AUC = aire sous la courbe ; FGF = facteur de croissance des fibroblastes ; SRF = facteur de réponse sérique ; SRE = élément de réponse sérique ; HA = bras homologue ; L = gauche ; R = droite ; PuroR = gène de résistance à la puromycine ; hPGK = phosphoglycérate kinase humaine ; Nluc = NanoLuc luciférase ; ROC = caractéristique de fonctionnement du récepteur ; ABC = aire entre les courbes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie cellulaire et coloration des cellules vivantes/mortes. (A) Images microscopiques confocales de cellules avant (jour 4) et après (jour 6) exposition à un produit chimique d’essai. Les cellules restantes couvrant presque toute la surface des puits après l’essai sont un indicateur de la réussite de l’essai. Une couverture presque complète du puits à la fin de l’analyse indique une exploitation réussie. (B) Coloration des cellules vivantes/mortes avant et après l’exposition à un produit chimique d’essai. Les cellules vivantes ont été colorées en vert avec de la calcéine-AM, et les cellules mortes ont été colorées en rouge avec de l’iodure de propidium (PI). ont été colorés à la calcéine-AM (vert) et les cellules mortes à l’iodure de propidium (PI, rouge). La proportion de cellules mortes doit être inférieure à celle de < 50 % du total des cellules. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Exemples typiques de dynamique d’intensité de luminescence. (A) La luminescence temporelle modifie le cours temporel de la luminescence après la stimulation du ligand FGF, mesurée à l’aide d’un système de mesure de luminescence en temps réel. L’intensité de la luminescence a été surveillée toutes les 22 min pendant 48 h. Les six lignes colorées représentent les signaux provenant de différents puits. (B) Comparaison des mesures de luminescence manuelles et en temps réel avec l’acide valproïque. Une perturbation du signal a été observée avec les deux méthodes de mesure, tandis que la surveillance en temps réel a capturé plus clairement le signal amélioré au deuxième pic. Abréviations : RLU = Unité de Lumière Relative ; VPA = acide valproïque ; FGF = facteur de croissance des fibroblastes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
| Produit chimique d’essai | Abréviation | N° CAS | Étude animale (étude précédente) | Etude in vitro (cette étude) | Somme des valeurs ABC | Concentration maximale (μg/mL) |
| acide tout-trans-rétinoïque | L’ATRA | 302-79-4 | P | P | 65.9 | 0.0100 |
| Hydroxyurea | HU | 127-07-1 | P | P | 63.3 | 149 |
| Acide méthoxyacétique | MAA | 625-45-6 | P | P | 225 | 683 |
| Chlorure de méthylmercure | MeHg | 115-09-3 | P | P | 77.7 | 1.20 |
| Méthotrexate hydraté | MTX | 133073-73-1 | P | P | 80.5 | 5.00 |
| Salicylate de sodium | SA | 54-21-7 | P | P | 38.7 | 666 |
| Acide valproïque | APV | 99-66-1 | P | P | 63.3 | 100 |
| 6-aminonicotinamide | 6-AN | 329-89-5 | P | N | 24.9 | 1.00 |
| Acide borique | BA | 10043-35-3 | P | N | 24.2 | 250 |
| 5-Bromo-2'-désoxyuridine | BrdU | 59-14-3 | P | P | 83.9 | 50.0 |
| 5,5-diméthyl-2,4-oxazolidinedione | DMO | 695-53-4 | P | P | 50.3 | 840 |
| Chlorure de lithium | LiCl | 7447-41-8 | P | N | 29.8 | 250 |
| 5-Fluorouracile | 5-FU | 51-21-8 | P | P | 92.4 | 2.65 |
| Cyclophosphamide monohydraté | CPA | 6055-19-2 | P | N | 19.1 | 400 |
| Mésylate d’imatinib | IMA | 220127-57-1 | P | P | 42.4 | 12.5 |
| Lénalidomide | LEN | 191732-72-6 | P | P | 94.7 | 35.0 |
| Pomalidomide | POM | 19171-19-8 | P | P | 50.9 | 2.50 |
| Thalidomide | THA | 50-35-1 | P | P | 53.3 | 12.0 |
| Acrylamide | L’AcA | 79-06-01 | N | N | 37.1 | 454 |
| D-Camphre | CAME | 464-49-3 | N | N | 27.5 | 50.0 |
| Chlorhydrate de diphenhydramine | DHM | 147-24-0 | N | P | 68.2 | 262 |
| Ptalate de diméthyle | Le DMP | 131-11-3 | N | N | 24.4 | 100 |
| Pénicilline G sel de sodium | Peng | 69-57-8 | N | N | 22.1 | 1000 |
| Saccharine sodique | Le SAC | 82385-42-0 | N | N | 34.0 | 1000 |
| Acétaminophène | L’APAP | 103-90-2 | N | N | 22.3 | 20.0 |
| Amoxicilline trihydratée | AMX | 61336-70-7 | N | N | 28.4 | 25.0 |
| Cimétidine | CM | 51481-61-9 | N | N | 25.3 | 30.0 |
| Érythromycine | ERY | 114-07-8 | N | N | 20.0 | 15.0 |
| Hydrochlorothiazide | HCTZ | 58-93-5 | N | N | 21.9 | 20.0 |
| Sulfasalazine | SSZ | 599-79-1 | N | N | 30.8 | 100 |
| Chimique | AUC | Seuil | Sensibilité | Spécificité | Exactitude | |
| 30 substances | 0.819 | 37.9 | 0.778 | 0.917 | 0.833 |
Tableau 1 : Produits chimiques Devtox et non-Devtox classés dans les expériences sur les animaux et résultats estimés avec et sans perturbation du signal FGF. Abréviations : P = positif (Devtox) ; N = négatif (non-Devtox).
Discussion
Le développement embryonnaire-fœtal est étroitement régulé par les réseaux de signalisation12. Bien que la rétroaction au sein de ces réseaux offre une robustesse contre le bruit interne et externe, nous avons émis l’hypothèse que les produits chimiques Devtox peuvent exercer des effets au-delà d’une telle mise en tampon. Ici, nous présentons un protocole d’estimation des produits chimiques Devtox basé sur une perturbation excessive de la signalisation FGF/SRF. Cette approche ne fournit aucune information concernant les mécanismes moléculaires responsables de Devtox, tels que les protéines cibles d’un produit chimique, et se concentre uniquement sur la signalisation FGF/SRF. Néanmoins, il a été possible de classer efficacement les produits chimiques Devtox, avec une précision de 83 % et une AUC de 0,819 (tableau 1). Cela est probablement dû au fait que chaque voie de signalisation est étroitement associée à d’autres et forme des réseaux de signalisation denses, et que la perturbation au sein de ces réseaux entraîne une perturbation du signal FGF/SRF.
Plusieurs défis techniques doivent être relevés lors de la génération de cellules rapporteures. Nluc est environ 100 fois plus brillant que les luciférases conventionnelles dérivées de lucioles ou de Renilla, ce qui permet une surveillance continue à long terme des changements de signal13. Nluc contenant la séquence PEST a été utilisé pour capturer plus précisément la dynamique de l’activité de signalisation. La séquence PEST favorise la dégradation des protéines. Alors que la protéine Nluc est stable avec une demi-vie de plus de 6 h, l’étiquette PEST accélère la dégradation via la voie ubiquitine-protéasome, réduisant sa demi-vie à 10-30 min. De plus, le gène rapporteur a été introduit dans le locus AAVS1, une « sphère de sécurité » génomique, garantissant que l’expression n’est pas réduite au silence et que les gènes essentiels ne sont pas accidentellement perturbés14.
Lors de l’évaluation des méthodes d’essai, il est crucial de sélectionner des produits chimiques de référence pour Devtox et non-Devtox. Nous avons sélectionné des produits chimiques de référence à partir des listes de l’étude de validation internationale ECVAM, des lignes directrices de l’ICH S5 (y compris la thalidomide) et des études animales7. Nous avons répertorié 30 produits chimiques Devtox et non-Devtox, mais d’autres produits chimiques provenant de sources fiables doivent être ajoutés et testés. Par conséquent, le seuil de ROC (somme ABC = 37,9) indiqué ici doit être considéré comme préliminaire et nécessitera une validation avec un ensemble plus large et indépendant de composés pour assurer la robustesse statistique. Le cyclophosphamide (CPA) était l’un des trois produits chimiques dont les résultats étaient faussement négatifs. Le CPA est hydroxylé dans le foie en 4-hydroperoxycyclophosphamide, et le CPA et ses produits de dégradation sont tératogènes15. Les essais in vitro, y compris notre approche, ne tiennent généralement pas compte du métabolisme et ne peuvent pas détecter les produits chimiques qui induisent le Devtox via le métabolisme. Il s’agit d’une limite de l’approche proposée. En plus des faux négatifs dépendants du métabolisme (par exemple, CPA), nous avons également observé un faux positif avec le chlorhydrate de diphénhydramine (DHM). Les preuves épidémiologiques n’étayent pas fortement une association causale entre le DHM et les malformations congénitales, mais plusieurs études in vitro l’ont classé comme toxique pour le développement ; Cela a probablement contribué à sa classification erronée dans notre essai. À l’inverse, le 6-aminonicotinamide (6-AN) n’a pas perturbé la signalisation FGF/SRF et a donc été mal classé, ce qui suggère que son mécanisme de toxicité pour le développement peut se dérouler par des voies non saisies par ce rapporteur. Ensemble, ces exemples soutiennent l’élargissement du panel de tests pour inclure des voies de signalisation développementales supplémentaires afin de réduire à la fois les faux positifs et les faux négatifs.
Plusieurs facteurs ont une influence majeure sur ce dosage. L’un de ces facteurs est la préparation cellulaire avant le test. Pour minimiser cela, les cellules ont été maintenues selon un calendrier répété de 7 jours pour s’assurer que les cellules utilisées dans l’essai étaient collectées dans les mêmes conditions de croissance. Les cellules sont ensemencées le lundi, passées le jeudi, et une partie est utilisée pour l’essai et ensemencée pour le passage suivant. Un autre facteur est la densité cellulaire au moment de l’exposition à un produit chimique d’essai. Le test n’a été effectué que lorsque les cellules ont atteint 100 % de confluence le jour de l’exposition chimique. Les effets de bord dans les plaques à 96 puits sont bien connus. Dans cet essai, seuls les 60 puits intérieurs de la plaque de 96 puits ont été utilisés pour éviter les effets de bord. En plus des considérations générales, une variabilité technique peut se produire au cours d’un essai. Un problème courant était l’intensité inégale de la luminescence entre les puits du groupe témoin véhicule, ce qui peut avoir résulté d’un ensemencement cellulaire inégal ou d’une qualité cellulaire sous-optimale. Nous recommandons de maintenir les cellules à environ 80 % de confluence pour minimiser cette variabilité et de vérifier la croissance uniforme dans les puits le lendemain de l’ensemencement. L’ajustement de la densité de semis iPSC peut également améliorer la reproductibilité du test. De plus, une mort cellulaire excessive peut entraîner des fluctuations de luminescence non spécifiques sans rapport avec le signal expérimental. Par conséquent, évaluez la morphologie cellulaire à la fin du test pour vous assurer que les cellules sont dans un état approprié lors de la mesure. Dans les tests manuels, le retrait de la plaque de l’incubateur à chaque point de temps expose les cellules à de brefs changements de température et de niveaux de CO2. Pour limiter ces fluctuations environnementales, les mesures doivent être effectuées rapidement et de manière cohérente.
Ce dosage peut être effectué manuellement ou à l’aide d’un système de mesure en temps réel. L’approche manuelle ne nécessite pas d’équipement spécialisé, mais un système de mesure en temps réel permet une détection plus précise de la dynamique du signal. Bien qu’il n’ait pas été identifié dans les mesures manuelles, le système de mesure en temps réel a clairement capturé deux pics du signal de luminescence. Dans les mesures manuelles, un écart de 12 heures dans l’acquisition des données s’est produit pendant la nuit, ce qui peut avoir conduit à la sous-estimation ou à la perte du deuxième pic. Ces deux pics peuvent être causés par une rétroaction négative de la signalisation FGF et la présence d’un ligand FGF thermiquement stable. Notamment, la perturbation du signal FGF par un produit chimique semblait parfois plus importante dans le deuxième pic que dans le premier pic (Figure 3B).
Ce protocole représente une approche prometteuse pour le criblage chimique Devtox à l’aide d’un test de rapporteur humain basé sur l’iPSC pour évaluer quantitativement la perturbation du signal FGF. Plusieurs autres essais in vitro de toxicité pour le développement ont été mis au point au cours des dernières décennies, notamment l’essai sur cellules souches embryonnaires chez la souris (mEST)16, l’essai sur cellules souches embryonnaires basé sur Hand1 (Hand1-EST)17 et ReProGlo18. Par rapport à ces tests conventionnels, cette méthode a démontré une précision prédictive supérieure. Ces dernières années, des stratégies alternatives telles que l’utilisation de cellules souches embryonnaires humaines ou d’embryons de poisson-zèbre ont été introduites dans le cadre des efforts internationaux visant à établir des systèmes d’expérimentation non animale. Ces approches ont également fait état d’une grande précision prédictive pour les évaluations de la toxicité pour le développement. Pour améliorer encore les performances de ce test, l’incorporation de voies de signalisation supplémentaires impliquées dans le développement embryonnaire peut être bénéfique. Il existe plusieurs autres voies de signalisation majeures dans la morphogenèse du développement, telles que Wnt/β-caténine, BMP/SMAD et la signalisation Hedgehog/GLI19. Différentes combinaisons de cellules rapporteures utilisées pour évaluer ces voies de signalisation peuvent fournir une évaluation plus complète de divers produits chimiques. L’effet de l’étape de différenciation des cellules iPS, par exemple, le stade le plus précoce lorsque les trois couches germinales sont formées, sur la sensibilité de détection de ce test sera notre futur sujet de recherche. Les études futures pourraient également explorer la validation inter-espèces à l’aide de systèmes de cellules souches de rongeurs ou de lapins pour permettre une comparaison directe avec des ensembles de données in vivo chez ces espèces, tandis que notre objectif principal reste de se concentrer sur les cellules iPS humaines pour maximiser la pertinence humaine.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par JSPS, Japon [numéros de subvention KAKENHI 23K25021 et 25K03278] ; MHLW, Japon [subventions de programme numéros 23KD1003 et 24KD1003] ; KISTEC, Japon ; et AMED, Japon [numéros de subvention JP23mk0101252 et 25mk0121314].
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube microcentrifuge de 1,5 mL | FastGene | FG-MCT015C | Préparation chimique d’essai |
| Tube centrifugeuse de 15 mL | VIOLAMO | 1-3500-21 | Culture cellulaire |
| Tube PCR à 8 bandes | Watson | 137-333C | Préparation chimique d’essai |
| Plaque inférieure blanche/transparente à 96 puits, surface TC | Thermo Fisher Scientific | 165306 | Mesures de culture cellulaire et de luminescence |
| Microplaque noire à fond plat 96Well | ASONE | 3-3321-04 | Pour la mesure de la luminescence dans les tests de cytotoxicité |
| Respire-PLUS FACILEMENT | TOHO | BERM-2000 | Film d’étanchéité perméable au gaz |
| Dosage de viabilité des cellules luminescentes CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Essai de cytotoxicité |
| Centrifugeuse 5702 R | Eppendorf | Centrifugation | |
| ClipTip 300, filtré, stérile, rack | Thermo Fisher Scientific | 94420513 | |
| ClipTip 50, filtré, stérile, rack | Thermo Fisher Scientific | 94420253 | |
| Compteur automatisé de cellules Countess 3 FL | Invitrogen | Comptage cellulaire | |
| Lames de la chambre de comptage cellulaire Countess | Invitrogen | C10312 | Comptage cellulaire |
| Culture Bien sûr DMSO ; | FUJIFILM Wako | 031-24051 | Solvant pour produits chimiques |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako | 036-24023 | Inhibiteur ROCK pour l’ensemencement d’iPSC |
| DMEM/F12 HEPES, pas de rouge phénol | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | Revêtement pour culture cellulaire iPS |
| F1-ClipTip Pipettes multicanaux, 30 à 300 & micro ; L | Thermo Fisher Scientific | 4661180N | |
| F1-ClipTip Pipettes multicanales, 5 à 50 & micro ; L | Thermo Fisher Scientific | 4661160N | |
| Puce filtrante | Watson | ||
| Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit sans Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | Revêtement pour culture cellulaire iPS |
| HIENAI Mat 01R | COSMO BIO | HMAT01R | Pour maintenir la stabilité de la température de la plaque lors de la manipulation en culture cellulaire |
| Chauffe-tubes HIENAI GX01 | COSMO BIO | TWGX013 | Pour maintenir le moyen chaud lors de la manipulation expérimentale |
| Protéine recombinante bFGF stable à la chaleur humaine | Thermo Fisher Scientific | PHG0367 | Stimulation FGF pour le test de reporter |
| Cellules souches pluripotentes induites par l’humain (iPS) | 201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID : CVCL_A324) | Banque de cellules RIKEN BRC | |
| Vibrateur à microplaques | TAITEC | 0089532-000 | Secouage de la plaque pour le test de cytotocité |
| Lecteur multiplé | PerkinElmer | ARVO X4 | Mesure de la luminescence |
| Substrat cellulaire vivant à la nano-glo endurazine | Promega | N2571 | Substrat de luminescence |
| PBS (-) ; | FUJIFILM Wako | 166-23555 | Culutre cellulaire |
| Parafilim | AS One | 65-1681-93 | Stocké pour le revêtement de la plaque |
| Pipetto | eppendorf | ||
| WSL-1563 KronosHT | ATTO | 3510140 | Système de mesure de luminescence en temps réel ; |
| Réservoir | BMBio | BM-0850-1 | |
| STEMdif APEL2 Medium ; | STEMCELL Technologies | ST-05275 | Milieu d’essai |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Milieu d’entretien |
| Eau stérile, sans endotoxines | FUJIFILM Wako | 196-15645 | Contrôle de l’humidité pour la culture cellulaire iPS |
| Plaque de culture tissulaire VTC-P6 | VIOLAMO | 2-8588-01 | Culuture cellulaire |
| TrypL Select Enzyme (1X), pas de rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | Culture cellulaire |
| Acide valproïque | FUJIFILM Wako | 227-01071 | Produit chimique d’essai |
Références
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Réimpressions et autorisations
