Article de méthode

Construction de modèles de puce microfluidique pour la construction et l’analyse multi-omique

DOI :

10.3791/68915

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14 octobre 2025

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1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un système microfluidique modélisant la dynamique métabolique neuronale post-lésion axonale, permettant l’imagerie, l’analyse multi-omique et les études mécanistes du remodelage métabolique intrinsèque.

Résumé

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Les neurones se polarisent pour former des dendrites et des axones, permettant la communication intercellulaire. Les lésions axonales perturbent ces connexions et transmettent des signaux de dommages au soma, entraînant souvent une dégénérescence neuronale. Ainsi, le maintien de l’homéostasie axonale est essentiel pour favoriser la régénération axonale locale et protéger contre la neurodégénérescence. Ce processus s’appuie sur le métabolisme cellulaire pour fournir de l’énergie et des précurseurs biosynthétiques et est soutenu par des mécanismes qui régulent l’équilibre métabolique et éliminent les sous-produits. Cependant, le métabolisme neuronal est compartimenté entre le soma et l’axone et est en outre influencé in vivo par le microenvironnement environnant, tel que l’activité métabolique dérivée des astrocytes (par exemple, la navette astrocytes-neurones lactate). Ces facteurs compliquent l’étude des mécanismes métaboliques intrinsèques des neurones. Pour relever ces défis, nous avons développé une plateforme microfluidique pour la culture in vitro de neurones corticaux primaires qui préserve les principales caractéristiques métaboliques observées in vivo, notamment le flux glycolytique physiologique et la respiration mitochondriale. Ce système fournit un modèle simplifié pour l’étude du remodelage métabolique intrinsèque dans les neurones après une lésion axonale. Les puces microfluidiques conventionnelles prennent en charge les modèles de lésions axonales in vitro et sont compatibles avec l’imagerie de cellules vivantes, la coloration par immunofluorescence et le traitement de l’hypoxie. Pour permettre des analyses transcriptomiques et métabolomiques à grande échelle impliquant des millions de cellules, nous avons en outre conçu et fabriqué des puces microfluidiques à haut débit avec des protocoles opérationnels optimisés. Le dispositif comporte des chambres soma et axonales disposées en alternance reliées par des microcanaux, et les lésions axonales sont induites par l’aspiration intra-utérine du liquide du compartiment axonal. Cette plateforme permet une évaluation rapide de la dynamique des métabolites et des enzymes, améliorant ainsi la précision et la reproductibilité des études multi-omiques.

Introduction

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Les neurones établissent deux types distincts de protubérances avec des fonctions spécialisées, les axones et les dendrites, via la polarisation au cours du développement 1,2. La régénération nerveuse fait référence au processus de repousse axonale après une lésion neuronale3, avec un accent de recherche sur la réparation du système nerveux central (SNC). Contrairement au système nerveux périphérique, le SNC a une capacité de régénération limitée 4,5,6, entraînant souvent des déficiences fonctionnelles persistantes ou des handicaps permanents chez les patients atteints de lésions de la moelle épinière ou de lésions cérébrales traumatiques 7,8. Ainsi, il est crucial de développer des stratégies pour améliorer la réparation du SNC et d’élucider les mécanismes sous-jacents à la régénération axonale.

Les dispositifs microfluidiques, fonctionnant comme des systèmes de culture in vitro intégrés, rentables et à haut débit, ont montré des avantages remarquables dans la recherche sur les cellules et les neurones au cours des dernières années 9,10. Par rapport aux méthodes traditionnelles, la technologie microfluidique permet une régulation précise du stress de cisaillement des fluides, des gradients de concentration et des structures spatiales, simulant ainsi étroitement des microenvironnements physiologiques et pathologiques authentiques pour favoriser la croissance, la migration, la différenciation et les interactions cellulaires 11,12,13,14. Les modèles de lésions axonales in vitro basés sur la microfluidique permettent la culture compartimentée des corps et des processus cellulaires neuronaux par polarisation spatiale, fournissant un outil indispensable pour explorer la capacité de régénération intrinsèque des neurones et leurs adaptations métaboliques après une lésion15,1 6,17,18. Il fournit une fenêtre critique sur la façon dont les neurones réagissent aux blessures, régulent les processus métaboliques19 et favorisent la régénération axonale20. Cependant, les plateformes microfluidiques existantes pour les lésions axonales et la recherche métabolique sont toujours confrontées à des défis, notamment de faibles rendements de cellules neuronales, une précision réduite des mesures métaboliques et un manque de procédures opérationnelles standardisées.

En réponse à ces limites, cette étude a développé une nouvelle plateforme microfluidique à grande échelle qui permet l’induction standardisée et à haut débit des lésions axonales et fournit suffisamment de matériel cellulaire pour les analyses multi-omiques compartimentées. Cette conception intégrée s’attaque directement au besoin critique non satisfait dans la recherche sur les lésions neuronales. Plus précisément, la puce microfluidique que nous avons conçue présente un arrangement alterné de chambres somiques et axonales reliées par des microsillons, avec une section axonale réalisée par aspiration intra-utérine contrôlée. Cette approche est idéale pour les études qui nécessitent des modèles reproductibles de lésions axonales à haut débit et un profilage métabolique précis, comme l’étude des mécanismes métaboliques sous-jacents à la régénération axonale. Par rapport aux méthodes traditionnelles, cette technique offre un débit plus élevé, une plus grande précision métabolique et la possibilité d’établir des modèles de blessures standardisés. Par exemple, des études antérieures ont démontré l’importance du transport mitochondrial dans la régénération axonale 20,21,22,23, tandis que notre plateforme révèle en outre le rôle du métabolisme du glucose dans la régénération axonale après une lésion. Ce protocole établit un système technique d’axotomie et d’analyse métabolique à grande échelle, à la fois vérifiable visuellement et standardisé sur le plan opérationnel.

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Protocole

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Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives du comité d’éthique de l’Université de Beihang et ont été approuvées par le comité (code d’approbation : BM20210060). La figure 1 présente la chronologie de l’expérience.

1. Conception du dispositif microfluidique conventionnel et à grande échelle

  1. Concevez le dispositif microfluidique à l’aide d’AutoCAD pour créer des schémas bidimensionnels (2D) et des modèles structurels tridimensionnels (3D).
  2. Utilisez ces conceptions pour fabriquer un moule maître sur une plaquette de silicium avec la photolithographie négative SU-8.
  3. Répliquez le moule maître en coulant du polydiméthylsiloxane (PDMS), ce qui permet d’obtenir une puce microfluidique fonctionnelle de haute précision.
  4. Concevez chaque microcanal pour qu’il ait une hauteur de 5 μm, ne laissant passer que les axones tout en bloquant les somas.
  5. Faites en sorte que les microcanaux aient une largeur de 10 μm pour augmenter la capacité axonale.
  6. Concevoir les chambres pour qu’elles aient une hauteur de 120 m et une largeur de 220 m, offrant ainsi suffisamment d’espace pour le soma neuronal.
  7. Utilisez cette plateforme microfluidique pour simuler des lésions axonales in vivo en contrôlant le flux de fluide et le placement des neurones.
  8. Préparez des échantillons métabolomiques et transcriptomiques à l’aide de l’appareil pour une manipulation cellulaire de haute précision, et permettez un traitement à haut débit pour améliorer la précision et la validité biologique des échantillons.

2. Fabrication de dispositifs microfluidiques conventionnels et à grande échelle

  1. Pesez la base PDMS et l’agent de durcissement à un rapport de 10:1 (p/p) et placez-les dans un tube à centrifuger.
  2. Placez le tube à centrifuger contenant le mélange PDMS dans un mélangeur centrifuge. Centrifuger à 2000 × g pendant 4 min pour mélanger, puis centrifuger à nouveau à 2000 × g pendant 4 min pour dégazer.
  3. Versez 13 à 15 g de PDMS dégazé dans le moule microfluidique, en veillant à ce que le fond du moule soit complètement couvert.
  4. Placez le moule dans un dessiccateur sous vide. Utilisez une pompe à vide pour évacuer l’air pendant 5 à 10 minutes afin d’éliminer complètement les bulles du PDMS.
  5. Utilisez une poire en caoutchouc pour tapoter doucement la surface du PDMS afin de briser les bulles de surface restantes.
  6. Placez le moule dans un four à convection et faites cuire à 80 °C pendant 100 min pour durcir le PDMS.
  7. Une fois que le PDMS est complètement durci, glissez doucement la pointe d’un scalpel sous le bord du PDMS pour le soulever et le séparer délicatement du moule.
  8. Utilisez un poinçon de biopsie d’un diamètre de 2,0 à 2,5 mm pour créer des trous dans le PDMS pour la perfusion de milieu de culture et le chargement cellulaire.
  9. Enlevez toutes les impuretés de surface du PDMS à l’aide de ruban adhésif, puis placez-le dans un plat en verre propre et enveloppez-le de papier d’aluminium pour le stockage.
  10. (Facultatif) Traitez la surface du PDMS avec du plasma d’oxygène (30 W, 20 s), puis pressez-la contre une autre surface pour un collage irréversible.
  11. Avant l’expérience, autoclavez le dispositif microfluidique à 121 °C et 101 kPa pendant 5 min pour garantir la stérilité.

3. Préparation des neurones corticaux

  1. Anesthésier 3 rats Sprague-Dawley (SD) postnatals (dans les 12 h suivant la naissance) en les plaçant sur de la glace pendant 5 min, puis les décapiter rapidement.
  2. Disséquez la zone motrice du cortex cérébral et placez le tissu dans un tampon de dissection pré-refroidi (par exemple, 2 mL de HBSS sans calcium ni magnésium).
    REMARQUE : Effectuez toutes les procédures de dissection tissulaire sur de la glace à l’aide de solutions pré-réfrigérées.
  3. Hachez le tissu en3 morceaux d’environ 1 mm à l’aide de ciseaux stériles et transférez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml.
  4. Laisser reposer 5 minutes, puis aspirer soigneusement le surnageant pour éliminer le sang résiduel et le tampon.
  5. Ajouter une solution de papaïne préchauffée (1 mg/mL) dans 5 mL de HBSS avec du calcium et du magnésium chauffés à 37 °C.
  6. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 40 min, en retournant doucement le tube 3 fois toutes les 10 min.
  7. Après la digestion, triturez doucement la suspension 100 fois à l’aide d’une pipette de 200 μL.
    REMARQUE : Évitez d’introduire des bulles d’air pour éviter le stress cellulaire.
  8. Centrifuger à 300 × g pendant 3 min et jeter le surnageant.
  9. Ajouter une solution de terminaison contenant 1 mg/mL d’inhibiteur de protéase (p. ex., 600 μL de kit d’inhibiteur du système de dissociation de la papaïne, flacon dans 5 mL de HBSS avec du calcium et du magnésium) pour remettre les cellules en suspension.
  10. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 μm et collectez le filtrat dans un nouveau tube de centrifugation.
  11. Centrifuger le filtrat à 200 × g pendant 10 min et jeter le surnageant.
  12. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de milieu de culture neuronal complet contenant 2 % de B27 et 1 % de GlutaMAX.
  13. Comptez les cellules (environ 3 millions/rat) et ajustez la densité à 1 × 10à 6 cellules/mL pour une utilisation ultérieure.

4. Revêtement

REMARQUE : Traitez les lamelles ou les boîtes de culture avec une solution de poly-D-lysine (PDL) pour améliorer l’adhésion des neurones et créer un environnement optimal pour la croissance neuronale.

  1. Revêtement des lamelles
    1. Placer une lamelle destinée aux dispositifs microfluidiques conventionnels (Φ25 mm, épaisseur 0,17 mm) dans une boîte de culture de 35 mm, et ajouter 2 mL de solution PDL à 0,1 mg/mL.
    2. Incuber à 37 °C pendant 6 h ou toute la nuit.
    3. Après l’incubation, récupérez soigneusement la solution PDL pour la réutiliser ou l’éliminer correctement.
    4. Ajoutez 2 ml d’eau stérile ultrapure dans le plat et tournez-le 50 fois dans le sens des aiguilles d’une montre, puis 50 fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (pour plusieurs plats, faites-les pivoter simultanément dans un plat plus grand).
    5. Aspirer l’eau à l’aide d’une pompe à vide reliée à une pointe de pipette stérile, en recueillant les déchets dans un conteneur de déchets liquides.
    6. Répétez la procédure de lavage (étapes 4.1.4-4.1.5) trois fois au total.
    7. Laissez les lamelles sécher naturellement à l’air libre dans une enceinte de biosécurité avant de les utiliser.
  2. Enrobage du plat de culture
    1. Ajouter une quantité appropriée de solution de LDP de 0,1 mg/mL dans la boîte de culture ou la plaque de puits (p. ex., ajouter 2 mL dans une boîte de 35 mm pour la microfluidique conventionnelle et 5 mL dans une boîte de 10 cm pour la microfluidique à grande échelle).
      REMARQUE : Assurez-vous que l’enceinte de biosécurité fonctionne correctement avec un flux d’air stérile pour éviter toute contamination.
    2. Assurez-vous que la solution recouvre complètement le fond et incubez-la à 37 °C pendant 6 h ou toute la nuit.
    3. Après avoir récupéré la solution de LDO, laver la boîte de culture trois fois avec une quantité appropriée d’eau ultrapure stérile, comme décrit à l’étape 4.1.4.
    4. Retirez toute eau ultra-pure résiduelle et faites sécher la boîte de culture à l’air libre dans une hotte à flux laminaire pour une utilisation ultérieure.

5. Préparation du milieu neuronal

  1. Préparez le milieu complet pour la culture de neurones de routine.
    1. Retirez le piston d’une seringue jetable de 50 ml. Placez la seringue avec la tête en caoutchouc vers le haut sur un banc propre à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.
    2. Ajouter 500 μL de pénicilline streptomycine (PS), 1 mL de B27, 125 μL de GlutaMAX et 500 μL de sérum fœtal bovin (FBS) dans la seringue en séquence. Changez l’embout de la pipette pour chaque composant afin d’éviter la contamination croisée.
      REMARQUE : Ajoutez chaque composant dans l’ordre spécifié pour maintenir la cohérence.
    3. Prenez un nouveau tube à centrifuger stérile de 50 ml. Étiquetez-le comme « Neurobasal-A (NBA) + 2 % B27 + 0,25 % GlutaMAX + 1 % FBS + 1 % PS ».
      REMARQUE : Utilisez NBA si vous n’avez pas de neurones embryonnaires ; utiliser neurobasal (NB) pour les neurones embryonnaires.
    4. Fixez un filtre de seringue de 0,22 μm à l’extrémité de la seringue.
      REMARQUE : Assurez-vous que le filtre est bien connecté à la seringue pour éviter les fuites.
    5. Utilisez NBA pour remplir la seringue avec un liquide allant jusqu’à 50 ml, y compris le volume d’additifs. Réinstallez le piston.
    6. Poussez lentement le piston à environ 2 ml/s pour filtrer le liquide dans le tube à centrifuger étiqueté.
    7. Serrez le capuchon du tube de centrifugation. Retournez le tube 3 à 5 fois pour mélanger le milieu.
  2. Milieu complet contenant du glucose [U-13C6](pour l’analyse du flux métabolique) : Pour l’analyse du flux métabolique du métabolisme du glucose dans les neurones endommagés, utilisez du NBA sans sucre pour préparer un milieu complet contenant du [U-13C6]-glucose.
    1. Utilisez du NBA sans glucose comme solution de base et ajoutez du [U-13C6]-glucose à une concentration finale de 25 mM avant la filtration (si le [U-13C6]-glucose est solide, calculez-le et pesez-le à l’avance). Suivez le même ordre pour l’ajout des autres composants, ainsi que les étapes de filtration et de mélange, comme décrit à la section 5.1.

6. Comptage cellulaire

  1. Essuyez soigneusement l’hémocytomètre avec de l’éthanol à 75 %. Assurez-vous que toutes les surfaces sont complètement sèches avant de continuer.
  2. Ajouter 90 μL de tampon salin tamponné au phosphate (PBS) stérile dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 mL.
  3. Remettez doucement en suspension la suspension de cellules neuronales collectée en pipetant de haut en bas 3 à 5 fois pour assurer un mélange complet.
  4. À l’aide d’une pipette de 10 μL, transférez 10 μL de la suspension à cellules mixtes dans le tube à centrifuger contenant 90 μL de PBS (dilution 1:10).
  5. À l’aide d’une pipette de 200 μL, mélangez délicatement la solution 10 fois, en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme.
  6. Remplacez l’embout de la pipette par un nouvel embout de 10 μL. Prélevez 10 μL du mélange et ajoutez-le dans la chambre d’échantillonnage de l’hémocytomètre.
  7. Placez l’hémocytomètre sur la platine du microscope et faites la mise au point à l’aide de l’objectif 20x. Localisez la grille centrale 4 × 4 et comptez les cellules dans les 16 carrés en suivant les règles standard de l’hémocytomètre.
  8. Enregistrez le nombre total de cellules des 16 carrés. Calculer la concentration cellulaire à l’aide de la formule suivante : (Nombre total × 10) ×10 4 cellules/mL.
    REMARQUE : Travaillez toujours dans une enceinte de biosécurité avec un équipement de protection individuelle approprié.

7. Culture in vitro de neurones corticaux dans des dispositifs microfluidiques conventionnels ou à grande échelle

  1. Protocole A (Dispositifs microfluidiques conventionnels).
    1. Vérifiez que la surface vitrée de la boîte de culture de 35 mm est complètement sèche.
    2. À l’aide d’une pince stérile à pointe fine, placez la puce microfluidique autoclavée au centre de la surface du verre, les microcanaux vers le bas.
    3. Appuyez doucement la puce sur la surface du verre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL pour assurer une adhérence complète.
    4. Marquez la chambre gauche d’un point (·) à l’aide d’un marqueur permanent pour désigner le compartiment soma.
    5. Aspirer 10 μL de suspension neuronale (10 millions de cellules/mL) à l’aide d’une pipette de 10 μL.
    6. Distribuez lentement la suspension dans le port de chargement au-dessus du compartiment soma marqué.
    7. Confirmez que le fluide s’écoule correctement dans le réservoir inférieur de la chambre gauche.
    8. Transférez la boîte de culture dans un incubateur humidifié (37 °C, 5 % CO2) pendant 20 min.
    9. Retirez la boîte de culture de l’incubateur.
    10. À l’aide d’un microscope à contraste de phase de 20 ×, confirmez la perfusion du milieu du compartiment soma au compartiment axonal à travers les microcanaux.
    11. Ajoutez 150 μL de milieu basal neuronal à l’orifice supérieur du compartiment axonal (chambre droite), permettant un écoulement par gravité vers le réservoir inférieur.
    12. De même, ajoutez 15 μL de milieu neuronal complet dans l’orifice supérieur du compartiment soma (chambre gauche).
      REMARQUE : À ce stade, les neurones devraient adhérer visiblement, la plupart des débris cellulaires étant évacués dans le puits inférieur. Ne pas remplacer le milieu pendant la culture ; Utilisez un seul ajout de milieu neuronal complet comme décrit à l’étape 5.1.3.
    13. Versez 20 ml d’eau ultrapure dans une boîte de culture de 150 mm pour créer une chambre d’humidité. Placez la boîte de culture de 35 mm à l’intérieur du grand plat.
    14. Transférez l’ensemble du système de culture dans l’incubateur et maintenez-le pendant la durée requise (p. ex., 7 jours).
      REMARQUE : Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité. Portez un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire et gants). Décontaminer les surfaces de travail avant et après les procédures.
  2. Protocole B (puces microfluidiques à grande échelle).
    REMARQUE : Le protocole standard des spécifications conventionnelles a été suivi avec deux modifications.
    1. Utilisez une boîte de Pétri de 10 cm pour placer l’appareil.
    2. Choisissez l’ensemencement à canal complet ou à canal interal en fonction des besoins expérimentaux, car chaque méthode nécessite des protocoles de lésions axonales différents.
    3. Une fois l’ensemencement terminé, ajoutez 5 ml de milieu de culture de neurones complet dans la boîte de Pétri de 10 cm pour maintenir la croissance des neurones.
    4. Ajoutez 20 ml d’eau ultrapure dans un plat de 150 mm de large pour créer une chambre d’humidité. Ensuite, placez le plat de 10 cm à l’intérieur du grand plat.
    5. Identique à l’étape 7.1.14.

8. Établissement d’un modèle de lésion axonale in vitro dans des dispositifs microfluidiques conventionnels

  1. Marquez le côté gauche du dispositif microfluidique comme le compartiment somal (comme indiqué par le repère « · »), et le côté droit comme le compartiment terminal axonal.
  2. Ensemencez les neurones corticaux dans le compartiment somal.
  3. Cultivez les neurones in vitro jusqu’au jour 7 (DIV7), permettant aux axones de s’étendre à travers les microcanaux jusqu’au compartiment terminal axonal.
  4. À DIV7, effectuez des procédures de lésions axonales dans le compartiment terminal axonal pour établir un modèle de lésions axonales in vitro .
  5. Prenez une quantité appropriée de milieu NBA et transférez-la dans un nouveau tube à centrifuger de 15 ml pour une utilisation ultérieure.
  6. Cultivez les neurones corticaux dans le dispositif microfluidique pendant la période spécifiée. Transférez ensuite l’appareil sur un banc propre.
  7. Utilisez du papier non pelucheux pour sécher le fond de la boîte de culture de 35 mm. À l’aide d’une pipette de 200 μL, aspirez le fluide par les deux trous latéraux droits du dispositif microfluidique.
  8. Connectez le tube de la pompe à vide à une pointe de pipette stérile et sans filtre de 200 μL, allumez la pompe à vide (taux d’aspiration de 60 L/min) et dirigez la pointe vers le point de connexion entre le trou inférieur de la chambre terminale axonale et la chambre pour aspirer l’ancien fluide (à ce stade, les axones se cassent en raison de la pression négative).
  9. Replacez la pointe de la pipette de 200 μL et prélevez 150 μL de NBA, en l’ajoutant lentement par le trou inférieur de la chambre droite.
    REMARQUE : Si l’écoulement du liquide est trop lent et que des bulles se forment, expulsez rapidement le liquide de la pointe pour remplir rapidement la chambre.
  10. Alternez à l’aide des deux trous du côté droit pour l’ajout de liquide : après chaque ajout de NBA, utilisez immédiatement la pompe à vide pour aspirer le liquide de l’autre trou afin de sectionner les axones. Répétez cette opération 4 fois, et après la dernière aspiration, remplacez-la par un milieu neuronal complet frais.
  11. Aspirez l’ancien milieu du trou latéral du corps cellulaire et ajoutez un nouveau milieu neuronal complet contenant des médicaments (si nécessaire).
  12. Placez le dispositif microfluidique avec la boîte de culture dans une boîte de culture de 150 mm et poursuivez la culture pendant la durée spécifiée (par exemple, 24 h).
    REMARQUE : L’opération de lésion axonale nécessite un milieu NBA, car le milieu neuronal complet produira des bulles affectant l’effet de section.

9. Lésion axonale du dispositif microfluidique à grande échelle

  1. Méthode 1 : Lésion axonale manuelle.
    1. Insérez des neurones dans toutes les chambres du dispositif microfluidique.
    2. Incuber l’appareil à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 pendant trois jours, puis retirer l’ensemble de l’appareil microfluidique.
      REMARQUE : Pour éviter les contraintes mécaniques ou la déchirure des axones développés dans les microcanaux, retirez le dispositif microfluidique à DIV3 au lieu de DIV7. Ceci est particulièrement important si la conception expérimentale comprend un groupe témoin non endommagé.
    3. À la DIV7, retirez la boîte de culture contenant le dispositif microfluidique de l’incubateur et placez-la sur une platine stérile.
    4. Préparez un microscope avec un grossissement de 20x et stérilisez la zone de travail avec de l’éthanol à 75 %.
    5. Tenez une pointe de pipette filtrée stérile de 10 μL et identifiez les faisceaux axonaux dans les microcanaux d’origine sous guidage au microscope.
    6. Effectuez des rayures longitudinales le long de chaque faisceau d’axones à l’aide de la pointe de la pipette.
    7. Observez la rupture de l’axone au microscope en temps réel après le grattage.
      REMARQUE : Lorsque vous manipulez des neurones vivants, portez des gants en nitrile et travaillez dans un environnement de laboratoire stérilisé aux UV
  2. Méthode 2 : Lésion axonale assistée par le vide.
    1. Grainez les neurones corticaux en alternance dans le dispositif microfluidique de grand format.
    2. Allumez la pompe à vide et réglez-la à 60 L/min.
    3. Connectez l’extrémité du tube de la pompe à vide à l’orifice de la chambre axonale à l’aide d’une pointe de pipette stérile.
    4. Séparation complète de l’axone en appliquant une pression de vide à l’aide de protocoles microfluidiques conventionnels.
    5. (Facultatif) Pour prélever spécifiquement les axones lésés, à un moment défini après l’axotomie, aspirez rapidement le contenu du compartiment du corps cellulaire à l’aide d’une pompe à vide (avec un taux d’aspiration de 60 L/min) pour retirer les corps cellulaires, ne laissant ainsi que les axones dans les microcanaux.

10. Traitement hypoxique de dispositifs microfluidiques conventionnels ou à grande échelle

  1. Ensemencer les neurones primaires dans le dispositif microfluidique et cultiver jusqu’à DIV7 dans des conditions normoxiques (37 °C, 5 % CO2).
  2. Placez le dispositif microfluidique dans une chambre d’incubation d’hypoxie et alimentez-le avec un mélange gazeux composé de 1 % d’O2, 5 % de CO2 et d’N2 équilibré.
  3. Utilisez un rotamètre pour contrôler le débit de gaz et réglez-le à 25 L/min.
  4. Rincez la chambre pendant 5 minutes pour déplacer l’air.
  5. Tout en serrant l’entrée de la chambre hypoxique, fermez le réducteur de pression de sortie.
  6. Clampez le tube de sortie de la chambre hypoxique et, enfin, fermez bien le robinet de la bouteille de gaz.
  7. Incuber le dispositif microfluidique dans la chambre hypoxique à 3 °C pendant 1 h.

11. Préparation d’échantillons de neurones cultivés in vitro à l’aide de dispositifs microfluidiques à grande échelle pour l’analyse omique

  1. Exemple pour la transcriptomique.
    1. Transférez le dispositif microfluidique avec les axones endommagés dans une hotte à flux laminaire 6 h après la fin de la lésion axonale.
    2. Après avoir jeté l’ancien milieu, lavez les cellules neuronales 2 à 3 fois avec du PBS stérile.
    3. Utilisez un kit d’extraction d’ARN standard pour isoler et purifier l’ARN selon les instructions du fabricant.
    4. Effectuer le séquençage de l’ARN. Effectuer une analyse bio-informatique de suivi sur les données de séquençage acquises.
  2. Échantillon pour l’analyse des flux métaboliques.
    REMARQUE : Pour surveiller les changements dans le flux métabolique de glucose dans les neurones après une lésion à l’aide d’un dispositif microfluidique à grande échelle, nous avons utilisé l’analyse du flux métabolique de traçage du glucose [U-13C6]24. Le protocole de préparation des échantillons pour l’analyse LC-MS est le suivant :
    1. Utilisez des ratillons P0 SD pour les expériences. Disséquer des neurones corticaux et les cultiver in vitro à court terme (DIV5-DIV7) ou à long terme (DIV15-DIV30).
    2. Pour les neurones jeunes (DIV5-DIV7) et matures (DIV15-DIV30), établissez des groupes de blessures et des groupes témoins non blessés.
    3. Remplacer le milieu par un milieu contenant 25 mM [U-13C6]-glucose (Neurobasal-A sans glucose, 1 % FBS, 2 % B27, 25 mM [U-13C6]-glucose) et incuber pendant 4 h à 37 °C.
      REMARQUE : Pour éviter le stress neuronal et l’apoptose causés par des changements osmotiques ou de pH pendant l’échange de milieu, préparez des neurones supplémentaires cultivés dans un milieu contenant 25 mM [U-13C6]-glucose au moment de l’ensemencement, et utilisez ce milieu pour l’échange.
    4. Après avoir rincé doucement deux fois avec 5 ml de HBSS préchauffé (contenant du calcium et du magnésium), congelez rapidement les échantillons dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C.
      REMARQUE : Portez des gants en nitrile et une blouse de laboratoire lorsque vous manipulez de l’azote liquide.

12. Coloration par immunofluorescence neuronale basée sur des dispositifs microfluidiques conventionnels et à grande échelle

REMARQUE : Lors de la culture de neurones in vitro à l’aide de dispositifs microfluidiques, il faut tenir compte des dommages potentiels aux axones neuronaux dans les microcanaux qui peuvent se produire lors du démontage de ces dispositifs pour la fixation de cellules vivantes.

  1. À l’aide d’une pompe à vide pour les microdéchets, retirez le milieu de culture des quatre puits du dispositif microfluidique.
    REMARQUE : Conservez le liquide dans deux chambres tout au long du processus de coloration par immunofluorescence. Les paramètres d’aspiration ne doivent pas être trop élevés (2,5 L/min est optimal) pour éviter d’endommager ou d’aspirer les corps cellulaires neuronaux et les axones.
  2. Ajoutez 100 μL de 1x PBS dans chacun des deux puits supérieurs du dispositif microfluidique (le PBS s’écoulera naturellement vers les puits inférieurs).
  3. Replacez l’embout sans filtre à l’extrémité de la pompe à vide, aspirez le PBS des puits inférieurs et répétez le processus trois fois. Lors de la dernière itération, aspirez tous les PBS des quatre puits.
  4. Ajouter 150 μL de solution de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans chacun des deux puits supérieurs et fixer à température ambiante pendant 10 à 15 min.
    REMARQUE : Évitez de démonter le dispositif pendant la fixation de cellules vivantes pour maintenir l’intégrité structurelle neuronale. Cette approche permet de distinguer plus clairement les emplacements des somas neuronaux et des axones.
  5. Laver trois fois avec 1x PBS, puis incuber des neurones avec un tampon bloquant contenant 5 % de sérum de chèvre, 0,3 M de glycine, 2 % d’albumine sérique bovine (BSA), PBS et 0,1 % (ou 0,5 %) Triton X-100 pendant 1 h.
  6. Diluez l’anticorps primaire (p. ex., tubuline βIII, souris, 1:2000) dans le tampon de blocage, ajoutez 100 μL dans le puits supérieur gauche et 50 μL dans le puits supérieur droit, puis incubez avec les neurones pendant une nuit à 4 °C.
  7. Après avoir aspiré l’anticorps primaire, laver trois fois avec 1x PBS comme décrit aux étapes 12.2-12.3. Ajoutez ensuite l’anticorps secondaire préparé avec un tampon de blocage dans les puits supérieurs du dispositif microfluidique comme décrit à l’étape 12.6, et incubez dans l’obscurité pendant 30 minutes (couvrez d’une feuille d’aluminium si nécessaire).
  8. Après avoir lavé trois fois avec 1x PBS, rincez une fois à l’eau ultra-pure. Utilisez soigneusement une pince à épiler incurvée pour saisir et retirer l’appareil en haut à droite de la configuration microfluidique.
  9. Ajouter 1 mL de PBS dans la boîte de culture pour séparer la grande lamelle de la boîte.
  10. À l’aide d’une pipette, prélever 15 μL de fluide de montage et le déposer sur la lamelle à l’endroit désigné pour les lamelles.
  11. Abaissez doucement le côté de la cellule sur le support de montage, placez la lamelle et retirez l’excès de liquide.
  12. Laissez le support de montage sécher complètement à température ambiante.
  13. Une fois que le support de montage a séché à température ambiante, utilisez un microscope confocal à disque rotatif pour effectuer l’imagerie.
  14. Sélectionnez un objectif aérien 20x, réglez le temps d’exposition sur 100-200 ms par image, et réglez la puissance laser sur 5-10 % du maximum avec une excitation de 488 nm pour la protéine fluorescente verte (GFP) et/ou 561 nm pour la protéine fluorescente rouge (RFP).

13. Imagerie de cellules vivantes dans les dispositifs microfluidiques conventionnels

  1. Cultivez des neurones corticaux dans le dispositif microfluidique jusqu’à DIV7.
  2. Préparez un colorant à cellules vivantes (p. ex., une sonde pour le potentiel de la membrane mitochondriale) selon les instructions du fabricant.
  3. Diluer le colorant dans un milieu d’entretien neuronal préchauffé (37 °C).
  4. Chargez la solution de colorant dans le compartiment somatique du dispositif microfluidique.
  5. Incuber pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 .
  6. Lavez délicatement les compartiments 3 fois avec 3 ml de HBSS préchauffé (37 °C) contenant du calcium et du magnésium.
  7. Ajoutez une solution d’imagerie de cellules vivantes sans rouge de phénol à la puce microfluidique.
  8. (Facultatif) Inclure GlutaMAX (0,25 %) et B27 (2 %) pour l’imagerie prolongée.
  9. Placez la puce microfluidique sur la platine du microscope avec la chambre somatique à gauche et la chambre terminale axonale à droite.
  10. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion dans la lentille de l’objectif, en vous assurant que l’huile entre en contact avec la lamelle sous la puce.
  11. Utilisez un objectif 40x avec une exposition de 150 ms et une puissance laser maximale de 10 à 15 % pour l’imagerie.
    REMARQUE : Ajustez ces paramètres en fonction de la photostabilité du colorant.

14. Analyse des données

  1. Utilisez le logiciel ImageJ pour analyser les images de microscopie. Évaluez la qualité de l’ARN à l’aide d’un bioanalyseur. Effectuez et analysez le séquençage de l’ARN à l’aide d’une plateforme appropriée.
  2. Pour les études métabolomiques, extraire les données brutes de spectrométrie de masse à l’aide du programme MRMPROBS (version 2.60) et recueillir des informations sur les métabolites identifiés, y compris les détails isotopiques et les zones de pic.
  3. Utilisez GraphPad Prism (version 8.4.3) pour toutes les analyses statistiques. ±Utilisez des tests t bilatéraux non appariés ou des tests de Mann-Whitney pour les comparaisons de groupes, et appliquez une ANOVA à deux facteurs pour les comparaisons entre plusieurs points temporels au sein des groupes (Signification : ns, non significatif ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001).

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Résultats

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Afin d’établir une plate-forme de recherche complète pour étudier les mécanismes de régulation métabolique dans les neurones corticaux, nous avons d’abord cultivé des neurones corticaux dans un dispositif microfluidique conventionnel, contrôlant avec précision la croissance axonale le long des microcanaux (Figure 2A). Avec une conception appropriée, les microcanaux ont été construits avec une faible hauteur (5 μm) et une largeur plus grande (10 μm), permettan...

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Discussion

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L’établissement de modèles in vitro avancés pour l’étude des lésions axonales et de la régénération est essentiel pour découvrir les mécanismes moléculaires et métaboliques impliqués dans la réparation neuronale16,19. Dans cette étude, nous présentons un flux de travail standardisé qui intègre des dispositifs microfluidiques, des cultures neuronales à grande échelle et des protocoles précis de lésions axonales, permettan...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de Pékin (subventions n° L222080, F251031, Z240011, 7192103) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions n° 82271513)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Neurobasal-A MoyenGibco10888022Milieu de culture
Alexa Fluor 488 chèvre anti-sourisInvitrogenA-21042Immunofluorescence
Balance analytiqueShanghai Shunyu Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.FA1004Pesage précis des réactifs/échantillons
B27 (50x)Gibco17504044Milieu de culture
Dosage des protéines BCABosterAR1189Concentrations en protéines
BioanalyseurAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Albumine sérique bovineGenviewFA016Immunofluorescence
Mélangeur centrifugePENSERARE-310Mélanger PDMS et dégazage
Analyseur CLARIOstarPlus-ACUBMG LABTECHCLARIOstar PlusConcentrations en protéines
Incubateur CO2Thermo Fisher Scientific (Asheville) LLC3111Incubation en culture cellulaire à 37 ° ; C, 5 % de CO ?
Pompe à vide à membrane résistante à la corrosionShanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.LC-85DLCAspirer les déchets liquides et fournir une aspiration pour l’axotomie
D-GLUCOSE (U-13C6, 99 %)Laboratoires d’isotopes de CambridgeRéférence CLM-1396Flux métabolique
DNase IRoche11284932001Culture neuronale
Plateforme Dr.TOM2BGI GénomiqueEffectuer et analyser le séquençage de l’ARN.
Four de séchage électrique à air chaudBIOM Huahong Bonn / Huaying BosiDHG-9070ADurcissement du PDMS
Balance électroniqueShanghai Huachao Industrial Co., Ltd.HC313 (en anglais)Pesage de routine des matériaux
Milieu d’enrobage aqueux FluoromountSigma-AldrichRéf. F4680Immunofluorescence
GlutaMAXGibco35050061Milieu de culture
GlycineSolarbioG8200Immunofluorescence
HBSSGibco14025092Culture neuronale
HBSS, sans calcium, sans magnésiumGibco14175095Culture neuronale
Stérilisateur à vapeur haute pressionSTIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.HMJ-54AStérilisation du matériel et des milieux de laboratoire
Chambre hypoxiqueSTEMCELL Technologies27310Traitement hypoxique
ImageJNIHUtilisé pour analyser des images de microscopie
Leica MicroscopeLeica Microsystems CMS GmbHDMIL LED FluoObservation en direct et en fluorescence
Solution d’imagerie de cellules vivantesInvitrogenA14291DJImagerie de cellules vivantes
Boîte de stockage médicale à basse température (-80 ° ; C)Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.DW-86L388JStockage à long terme de l’échantillon à -80 ° ; C
Mini pompe à vide de bureauHaimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.GL-805Applications du vide à petite échelle
MitoTracker Orange CMTMRosInvitrogenRéférence M7510Coloration potentielle de la membrane mitochondriale
Programme MRMPROBSVersion 2.60Pour extraire des données brutes de spectrométrie de masse  ;
Milieu neurobasalGibco21103049Milieu de culture
Neurobasal-A sans glucoseGibcoA2477501Milieu de culture
PapaïneWorthingtonLS003127Culture neuronale
ParaformaldéhydeSigma-AldrichRéf. P6148Fixation cellulaire
PDMSDow CorningDC184Fabrication de dispositifs
Flacon inhibiteur du kit PDSWorthingtonLK003182Culture neuronale
Pénicilline StreptomycineGibco15140122Milieu de culture
Saline tamponnée au phosphateBiosharpBL302ADiluez les substances et nettoyez les conteneurs des cellules
Nettoyeur plasmaHarrick PlasmaODC-32G-2Activation
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Culture neuronale
Prisme  ;Pavé graphiqueÉdition 8.4.3Analyses statistiques
Centrifugeuse réfrigéréeEppendorf AG (Allemagne)Référence 5430RSéparation des échantillons à température contrôlée
RNArep Pure Cell/Bacterial Kit d’extraction d’ARN totalTiangenDP430Transcriptomique
RotamètreDwyerRMA-23-SSVContrôler le faible débit d’oxygène
StéréomicroscopeOlympus CorporationSZ2-ILSTObservation et dissection d’échantillons
Agitateur orbital StuartKylin-BellLe TS-200Mélange de cultures cellulaires/solutions à des vitesses réglables
Triton X-100Sigma-AldrichX100Immunofluorescence
Pompe à vide à palettes rotatives ULVACULVAC (Ningbo) Co., Ltd.GLD-N202Création d’un vide pour la filtration/le séchage
&bêta ; III-tubulinePromegaRéf. G7121Immunofluorescence

Références

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