Article de méthode

Évaluation des interventions thérapeutiques dans le modèle murin déficient en SHIP de l’iléite et de la fibrose semblables à la maladie de Crohn

DOI :

10.3791/68928

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14 octobre 2025

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1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole démontre comment le modèle murin déficient en 5'-inositol phosphatase (5'-inositol phosphatase) de l’inflammation iléale et de la fibrose de type maladie de Crohn (MC) peut être utilisé pour tester de nouvelles thérapies pour la MC.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique et récurrente caractérisée par une inflammation transmurale segmentaire qui peut affecter n’importe quelle partie du tractus gastro-intestinal. L’une des caractéristiques de la MC est une altération de la fonction de barrière intestinale, et la fibrose intestinale est une complication courante. Les souris déficientes en SHIP (SHIP-/-) développent spontanément un dysfonctionnement de la barrière intestinale, une inflammation iléale et une pathologie fibrotique, récapitulant les principales caractéristiques de l’iléite de type CD. Les souris SHIP-/- servent de modèle précieux pour tester les thérapies anti-inflammatoires et anti-fibrotiques dans la MC.

Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les interventions thérapeutiques dans ce modèle, en utilisant la dexaméthasone comme exemple de thérapie efficace. Nous fournissons un protocole étape par étape pour caractériser la maladie et la réponse au traitement, y compris l’évaluation in vivo de la perméabilité intestinale mesurée par FITC-dextran, ainsi que l’examen pathologique macroscopique et les analyses histologiques détaillées. Les évaluations histologiques comprennent la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour l’inflammation, la coloration trichrome de Masson pour la fibrose et la coloration au bleu d’Alcian/Periodic Acid-Schiff (PAS) pour l’hyperplasie et l’hypertrophie des cellules caliciformes. De plus, les cytokines et les marqueurs inflammatoires dans le tissu iléal sont quantifiés pour évaluer l’état inflammatoire. Ensemble, ces méthodes fournissent un cadre complet pour évaluer l’efficacité du traitement dans le modèle murin SHIP-/- d’iléite de type CD. Ce protocole est largement applicable aux chercheurs qui étudient l’inflammation intestinale, la cicatrisation de la muqueuse et la fibrose intestinale.

Introduction

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Les deux principaux types de maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) sont la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU), qui sont toutes deux caractérisées par une inflammation gastro-intestinale chronique (GI) qui peut suivre une évolution récurrente-rémittente ou progressive1. Bien que les MICI aient toujours été considérées comme une maladie des pays occidentalisés, leur incidence augmente rapidement dans les pays en développement d’Amérique du Sud, d’Asie et d’Afrique2. Parallèlement, la prévalence continue d’augmenter en Amérique du Nord, en Europe et en Australie, avec une augmentation de près de 50 % de l’incidence et de la prévalence signalée entre 1990 et 2019, soulignant le fardeau croissant des MICI 2,3 pour la santé mondiale. Malgré d’importants efforts de recherche, la cause sous-jacente de la MII demeure inconnue. Les preuves actuelles suggèrent une interaction complexe entre la susceptibilité génétique, le dysfonctionnement du système immunitaire et les déclencheurs environnementaux, y compris les altérations du microbiome 4,5.

Il existe des différences clés entre le CD et la CU. Dans la colite ulcéreuse, l’inflammation est confinée au côlon et se caractérise par une atteinte continue limitée à la couche muqueuse 6,7. En revanche, la MC se caractérise par une inflammation discontinue et transmurale qui peut affecter n’importe quelle partie du tractus gastro-intestinal, le plus souvent dans l’iléon terminal 6,7. Une complication caractéristique de la MC est la fibrose intestinale, qui contribue à la formation de sténoses et à l’occlusion intestinale8. La fibrose est définie par un dépôt excessif de composants de la matrice extracellulaire, tels que le collagène, et un épaississement des couches musculaires intestinales 9,10. Environ 30 % des personnes atteintes de la maladie coeliaque développent une maladie sévère dans les 10 ans suivant le diagnostic11. À l’heure actuelle, aucun traitement ne cible directement la fibrose, un besoin clinique non satisfait qui pourrait être traité à l’aide de modèles précliniques appropriés pour étudier cette complication 9,12.

Pour mieux comprendre la pathogenèse des MICI et faciliter le développement de nouvelles thérapies, de nombreux modèles murins ont été établis12. Bien qu’il existe un grand nombre de modèles de colite, seuls quelques-uns récapitulent l’inflammation iléale et la fibrose associée à la MC12. Parmi celles-ci, citons l’homologie 2 de l’homologie Src contenant une 5'-inositol phosphatase déficiente (SHIP-/-) décrite ici, ainsi que les souris SAMP1/YitFc et les souris TnfΔARE. Ces modèles reflètent collectivement la complexité de la MC humaine, car chacun est régi par des mécanismes cellulaires et moléculaires distincts. La maladie chez les souris SAMP1/YitFc résulte d’une prédisposition polygénique affectant la fonction de la barrière épithéliale et la régulation immunitaire13,14, tandis que les souris TnfΔARE portent une délétion d’éléments riches en AU dans l’ARNm du TNF, conduisant à une stabilité accrue de l’ARNm et à une surproduction de TNF15,16. Bien que précieux, ces modèles ont des limites. Le modèle SAMP1/YitFc souffre d’une faible efficacité de reproduction, ce qui pose des défis pour générer des cohortes de tailles suffisantes pour les études17. De plus, le modèle TnfΔARE nécessite jusqu’à 24 semaines pour développer une pathologie fibrotique notable, ce qui rend coûteuse et difficile la réalisation d’études d’intervention16.

SHIP est un régulateur négatif de la voie de signalisation de la phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et est principalement exprimé dans les cellules hématopoïétiques. Il fonctionne en éliminant le groupe phosphate 5' du phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, atténuant ainsi la signalisation PI3K en aval18. Les souris SHIP-/- offrent plusieurs avantages pour les études précliniques. Ces souris sont relativement faciles à élever et présentent des signes de fibrose dès l’âge de 8 semaines de19 ans. Le remodelage fibrotique accéléré dans ce modèle est probablement dû à des réponses inflammatoires accrues dues à une voie PI3K dérégulée, ce qui conduit à une hyperactivation des cellules immunitaires et à un remodelage tissulaire rapide ultérieur. Plus important encore, nous et le groupe de Kerr avons montré indépendamment que les souris SHIP-/- développent une iléite avec des caractéristiques qui ressemblent étroitement à celles de la CD19,20 humaine. À l’appui de la pertinence de ce modèle, un sous-ensemble de personnes atteintes de la MC a réduit l’activité de SHIP dans les biopsies iléales et les PBMC21. De plus, les personnes ayant une faible activité SHIP ont tendance à connaître une évolution plus grave de la maladie, nécessitant souvent plusieurs interventions chirurgicales22.

Les souris commencent à développer une inflammation intestinale spontanée et discontinue localisée à l’iléon distal dès l’âge de 4 semaines, avec une inflammation présente chez toutes les souris à l’âge de 6 semaines à l’âge de20 semaines. À l’âge de 8 semaines, les souris ont établi une pathologie fibrotique, caractérisée par un épaississement de la musculeuse externe et une accumulation importante de collagène dans la sous-muqueuse et entre les couches musculaires19. Dans ce modèle, l’inflammation est provoquée par l’interleukine-1β (IL-1β) dérivée des macrophages21. La déplétion des macrophages à l’aide de liposomes contenant du clodronate et le blocage pharmacologique de la signalisation de l’IL-1 avec un antagoniste des récepteurs de l’IL-1 (anakinra) ont amélioré l’inflammation intestinale chez les souris SHIP-/-21. En plus de l’iléite, les souris SHIP-/- présentent une inflammation pulmonaire, que nous avons utilisée pour évaluer les effets hors cible des thérapies conçues pour l’administration intestinale localisée23. D’autres ont rapporté que l’inhibition de la caspase-8 avec Z-IETD-FMK réduit significativement l’inflammation iléale et pulmonaire chez les souris SHIP-/-24, soutenant davantage la pathologie pulmonaire en tant que caractéristique supplémentaire pour évaluer le contrôle inflammatoire systémique.

Cet article méthodologique revient sur nos travaux récemment publiés sur le traitement efficace par la dexaméthasone23 et fournit une description détaillée des principales procédures techniques, avec des considérations supplémentaires pour l’utilisation de modèles murins dans les tests pharmacologiques. Plus précisément, nous mettons en évidence les paramètres standard pour l’évaluation de l’efficacité des médicaments dans les modèles de MICI, y compris l’évaluation de la perméabilité intestinale, de la pathologie macroscopique, de l’histopathologie et des médiateurs et effecteurs pro-inflammatoires, et discutons de la manière d’intégrer ces données pour tirer des conclusions sur l’efficacité thérapeutique globale.

Protocole

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Les études impliquant des animaux doivent être réalisées conformément aux protocoles éthiques approuvés par le Comité institutionnel sur le soin et l’utilisation des animaux et conformément aux Lignes directrices sur le bien-être des animaux du Conseil national de recherches. Toutes les procédures sur les animaux de ce protocole ont suivi les lignes directrices éthiques du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique (protocole A21-0212).

REMARQUE : Pour évaluer l’impact thérapeutique du médicament sur la pathologie intestinale des souris SHIP-/-, incluez SHIP+/+ comme témoins sains à des fins de comparaison. Pour l’intervention thérapeutique, commencer le traitement à l’âge de 6 semaines, lorsque la maladie est complètement établie dans le modèle. Ici, les souris SHIP+/+ et SHIP-/- ont reçu un gavage oral quotidien de dexaméthasone à 3 mg/kg dans de la β-cyclodextrine à 0,5 % (véhicule) ou le véhicule seul pendant 2 semaines, dans un volume de 10 μL/g.

1. Dosage FITC-dextran pour mesurer la perméabilité de la barrière épithéliale

  1. Souris rapides pendant 4 h avant le test.
  2. Dissoudre 4 kDa de FITC-dextran dans du PBS stérile 1x jusqu’à une concentration finale de 80 mg/mL.
  3. Préparez-vous suffisamment pour 150 μL par souris, plus 50 μL supplémentaires pour la courbe standard.
    REMARQUE : Minimisez l’exposition à la lumière de la solution FITC-dextran et des échantillons de plasma tout au long de la procédure.
  4. Retenir doucement (ébouriffer) chaque souris et administrer 150 μL de la solution FITC-dextran par gavage oral.
    REMARQUE : Démarrez une minuterie immédiatement après l’administration du premier gavage. Attendre 10 à 15 minutes entre chaque souris subséquente pour laisser suffisamment de temps pour que l’euthanasie et les procédures en aval soient effectuées de manière échelonnée, en minimisant la variabilité due aux différences de temps.
  5. Maintenir les souris sans nourriture pendant 4 h.
  6. Euthanasier les souris à l’aide d’isoflurane à 5 % (anesthésique inhalé administré avec 1,5 L d’oxygène/min) suivi de dioxyde de carbone conformément à la procédure institutionnelle standard. Prélever du sang par ponction cardiaque à l’aide d’aiguilles de 25 g et de seringues de 1 ml.
  7. Ajouter immédiatement 10 μL de solution d’acide-citrate-dextrose à chaque 100 μL de sang prélevé comme anticoagulant. Bien mélanger par inversion.
  8. Centrifuger à 1500 x g pendant 10 min à 4 °C et transférer soigneusement le plasma (surnageant) dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 mL marqués. Conservez les échantillons sur de la glace et à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse.
  9. Diluez chaque échantillon de plasma 1:2 et 1:10 avec 1x PBS.
  10. Ajouter 100 μL de chaque dilution dans une plaque opaque à 96 puits en doublets.
  11. Effectuer des dilutions en série de 1:2 de la pâte originale de 80 mg/mL de FITC-dextran à l’aide de 1x PBS pour atteindre les concentrations suivantes : 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 et 0 ng/mL. Ajouter 100 μL de chaque concentration à la plaque de 96 puits en double.
  12. Mesurez la fluorescence à une excitation de 485 nm et une émission de 535 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

2. Évaluation de la pathologie macroscopique

  1. Après le prélèvement sanguin pour le dosage FITC-dextran, excisez soigneusement tout l’intestin grêle.
  2. Retirez délicatement toute graisse et tissu conjonctif attachés.
    REMARQUE : Soyez prudent lors de la manipulation des tissus, car les régions malades peuvent être fragiles et sujettes aux déchirures.
  3. Posez l’intestin à plat sur une feuille de papier blanc vierge pour un contraste optimal. Inspectez visuellement le tissu à la recherche de signes macroscopiques de maladie. L’inflammation est généralement localisée à 10 cm distaux de l’intestin grêle chez la souris SHIP-/-.
    REMARQUE : Les principales caractéristiques macroscopiques à évaluer comprennent des changements de couleur, avec des régions montrant une rougeur ou une hyperémie visible par rapport aux tissus adjacents d’apparence normale. De plus, examinez l’épaississement des tissus, car les zones touchées peuvent apparaître enflées, œdémateuses ou rigides lors d’une palpation douce. Recherchez la présence de sang, qui peut apparaître sous la forme de taches hémorragiques visibles, d’une décoloration rouge foncé ou d’un sang adhérent.
  4. Alignez l’intestin à côté d’une règle pour le tartre et prenez une photo pour documenter les signes pathologiques macroscopiques.

3. Évaluation histologique

  1. Éliminez le contenu intestinal en rinçant doucement la lumière avec 1x PBS à l’aide d’une seringue. N’appliquez pas trop de force sur le tissu, car cela pourrait déformer l’architecture des villosités et des cryptes.
  2. Identifiez et prélevez environ 1 cm de l’iléon distal le plus représentatif de la pathologie macroscopique. Inclure les régions touchées visibles, le cas échéant. Pour les comparaisons (SHIP+/+ vs SHIP-/-), assurez-vous que les tissus sont prélevés à partir d’emplacements anatomiques appariés.
    REMARQUE : Pour une évaluation initiale de l’efficacité du traitement, il est recommandé de préparer l’iléon sous forme de rouleau suisse. Cette méthode permet d’obtenir une visualisation globale de la maladie et de réduire le biais d’échantillonnage.
  3. Posez le tissu à plat dans une cassette d’histologie, en le plaçant entre des éponges pour éviter qu’il ne se plie.
  4. Pour l’hématoxyline et l’éosine (H&E) et la coloration trichrome de Masson, fixez le tissu dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant la nuit à 4 °C, en utilisant au moins 10 à 20 fois le volume du tissu (environ 5 ml par cassette) et en vous assurant que toutes les cassettes sont complètement immergées. Transférez les cassettes à 70 % d’éthanol pour le stockage, en les gardant complètement immergées jusqu’au traitement.
    REMARQUE : Le formol à 10 %, un fixateur contenant 3,7 % de formaldéhyde, est un puissant irritant respiratoire, un sensibilisant cutané et est classé comme cancérogène pour l’homme. L’inhalation, l’ingestion ou le contact avec la peau peuvent entraîner une toxicité aiguë, tandis que l’exposition chronique peut augmenter le risque de cancer. Toutes les procédures impliquant du formol doivent être effectuées dans une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants résistant aux produits chimiques et des lunettes de protection. Recueillir les déchets dans des contenants clairement étiquetés « Déchets de formol » pour une élimination appropriée conformément aux protocoles institutionnels de gestion des déchets dangereux. Tous les matériaux contaminés par le formol (p. ex., pointes de pipette, mouchoirs, gants) doivent être traités comme des déchets chimiquement dangereux et jetés conformément aux procédures locales en matière d’environnement, de santé et de sécurité (SSE).
  5. Pour la coloration au bleu d’Alcian/PAS, fixez le tissu dans la solution de Carnoy (60 % d’éthanol, 30 % de chloroforme et 10 % d’acide acétique glacial) à 4 °C pendant la nuit, en utilisant environ 5 ml par cassette ou 10 à 20 fois le volume du tissu. Transférer les cassettes à 100 % d’éthanol pour le stockage jusqu’au traitement.
    REMARQUE : La solution de Carnoy est composée de 60 % d’éthanol, 30 % de chloroforme et 10 % d’acide acétique glacial. Ce mélange est très volatil, inflammable et toxique. Manipulez la solution Carnoy exclusivement dans une hotte et conservez-la dans des récipients hermétiquement fermés, à l’abri de la chaleur ou des sources d’inflammation. Les déchets de Carnoy doivent être collectés dans des conteneurs désignés pour les solvants organiques mélangés et éliminés conformément aux directives institutionnelles en matière de déchets dangereux. Tous les matériaux contaminés par la solution de Carnoy doivent être traités comme des déchets chimiquement dangereux.
  6. Incorporez les tissus dans de la paraffine et coupez des sections de 5 μm pour la coloration.
  7. Noter les sections iléales colorées en H&E sur une échelle de 16 points selon les critères du tableau 1. Le score final des dommages histologiques est déterminé en faisant la moyenne des scores de 2 examinateurs, qui sont aveugles à la condition expérimentale.
  8. Évaluer les sections transversales trichromes de Masson à l’aide d’une échelle de 6 points basée sur les critères du tableau 2. Le score final de fibrose est calculé comme la médiane des scores attribués par deux examinateurs indépendants aveugles aux conditions expérimentales.

4. Évaluation des cytokines

  1. Après la dissection et le retrait de l’échantillon histologique, prélever la partie restante de la partie distale de 10 cm de l’iléon.
  2. Séchez le tissu et notez le poids. Congeler dans de l’azote liquide et stocker à -80 °C pour un traitement ultérieur.
  3. Lorsqu’il est prêt à être traité, récupérez le tissu et gardez-le sur la glace en tout temps.
  4. Pesez les échantillons de tissus. Préparez suffisamment de tampon d’homogénéisation pour tous les échantillons en ajoutant des inhibiteurs de protéase à 1 fois PBS (aprotinine et leupeptine, chacun à 10 μg/mL). Utiliser 10 μL de tampon par mg de tissu (p. ex. 100 mg de tissu nécessitent 1 mL de tampon).
    REMARQUE : Le tampon d’homogénéisation doit être préparé frais le jour de l’homogénéisation pour s’assurer que les inhibiteurs de protéase sont efficaces.
  5. Homogénéisez le tissu iléal de pleine épaisseur dans un tampon d’homogénéisation glacé à l’aide d’un homogénéisateur de paillasse. Assurez-vous que l’homogénat est uniforme et exempt de fragments de tissu visibles. Rincez abondamment l’embout de l’homogénéisateur avec du PBS entre les échantillons pour éviter la contamination croisée.
  6. Centrifuger l’homogénation des tissus à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  7. Aliquote les surnageants clarifiés pour éviter les cycles de gel-dégel et stockez-les à -80 °C pour une analyse future.
  8. Effectuer des tests immuno-enzymatiques (ELISA) sur des surnageants clarifiés afin de quantifier les cytokines d’intérêt, conformément aux instructions du fabricant.
    REMARQUE : La densité optique à 450 nm a été mesurée à l’aide du lecteur de microplaques Varioskan LUX avec le logiciel Skanlt RE 7.0.2, avec une longueur d’onde de référence de 570 nm pour la correction. Microsoft Excel a été utilisé pour l’analyse des données, et les valeurs d’absorbance dans la plage linéaire de la courbe standard ont été interpolées pour déterminer les concentrations de cytokines.

Résultats

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Des souris SHIP+/+ et SHIP-/- âgées de 6 semaines ont été gavées par voie orale avec 0,5 % de β-cyclodextrine (témoin du véhicule ; n = 6/génotype) ou 3 mg/kg de dexaméthasone (n = 6/génotype) par jour pendant 2 semaines. Le moment et la durée du traitement dépendent du modèle et doivent tenir compte du début et du taux de progression de la maladie, ainsi que du fait que l’intervention soit destinée à être prophylactique ou thérapeutique. Un nombre égal de souris mâles et femelles doit être utilisé dans les expériences. Bien que nous n’ayons pas identifié de différences fondées sur le sexe dans l’histoire naturelle de la maladie chez les souris SHIP-/-, différents protocoles de traitement peuvent montrer des réponses spécifiques au sexe. Dans ce modèle, un traitement prophylactique à partir de 4 à 6 semaines peut être utilisé pour prévenir l’apparition de l’inflammation et de la fibrose, tandis que les schémas thérapeutiques effectués à partir de 6 à 8 semaines, 8 à 10 ou 6 à 10 semaines peuvent être utilisés pour évaluer l’efficacité du traitement pour une maladie établie. Le dosage et le moment optimaux doivent être guidés par la littérature et les études de titrage. Nous avons précédemment montré que ce schéma posologique de dexaméthasone est efficace lorsqu’il est administré après le développement d’une inflammation iléale.

La figure 1A présente un calendrier recommandé pour le jour de la récolte. La dexaméthasone n’a induit aucune pathologie intestinale chez les souris SHIP+/+ sur la base de l’examen macroscopique. Les souris SHIP-/- présentaient des zones visibles de rougeur et d’épaississement, indiquant une inflammation. Ces caractéristiques pathologiques macroscopiques étaient absentes chez les souris SHIP-/- traitées par la dexaméthasone (Figure 1B). Pour évaluer la fonction de la barrière intestinale, les concentrations plasmatiques de FITC-dextran ont été mesurées après un gavage oral. Bien que non statistiquement significatives, les souris SHIP-/- présentaient des concentrations plasmatiques élevées de FITC-dextran par rapport aux témoins SHIP+/+, suggérant une perméabilité intestinale accrue. Le traitement à la dexaméthasone a réduit les concentrations de FITC-dextran chez les souris SHIP-/- à des concentrations similaires à celles observées chez les souris SHIP+/+ (Figure 1C).

L’examen histologique de coupes efficaces intestinales de souris SHIP-/- a révélé des caractéristiques pathologiques caractéristiques, notamment une infiltration de cellules immunitaires, une perturbation de l’architecture de la crypte des villosités, une hyperplasie/hypertrophie des cellules caliciformes et un épaississement de la couche musculaire (Figure 2A). Ces caractéristiques se sont traduites par des scores de dommages histologiques significativement plus élevés que ceux des souris SHIP+/+ (p = 0,0005, figure 2B). Aucun dommage histologique n’a été observé chez les souris SHIP+/+ traitées par la dexaméthasone. Conformément aux améliorations observées dans la pathologie macroscopique et la fonction barrière, la dexaméthasone a réduit l’histopathologie chez les souris SHIP-/-, bien que l’effet n’ait pas été statistiquement significatif (p = 0,0981, figures 2A et 2B). La coloration trichrome de Masson a révélé un dépôt substantiel de collagène dans les tissus intestinaux SHIP-/-, accompagné de scores de fibrose significativement plus élevés par rapport aux témoins SHIP+/+ (Figure 2C). La dexaméthasone a efficacement atténué les caractéristiques fibrotiques chez les souris SHIP-/-, abaissant les scores de fibrose à des valeurs comparables à celles des témoins SHIP+/+ (Figure 2C). De plus, la coloration au bleu d’Alcian/PAS a confirmé l’hyperplasie/hypertrophie des cellules caliciformes chez les souris SHIP-/-, qui a été réduite lors du traitement à la dexaméthasone (Figure 2D).

Pour évaluer les concentrations de cytokines inflammatoires, des tests ELISA ont été réalisés sur des homogénats de tissu iléal de pleine épaisseur (Figure 3A). Les concentrations d’IL-1β étaient significativement plus élevées chez les souris SHIP-/- par rapport aux témoins SHIP+/+ (p = 0,0468), ce qui correspond aux résultats précédents corrélant l’expression de l’IL-1β à la gravité de la maladie dans ce modèle. Le traitement à la dexaméthasone a significativement réduit les concentrations d’IL-1β chez les souris SHIP-/- (p = 0,0023). Conformément aux rapports précédents, les concentrations d’IL-6 ou de TNF ne différaient pas entre les quatre groupes expérimentaux. Nous avons également mesuré les concentrations des protéines associées aux neutrophiles, la myéloperoxydase (MPO) et la lipocaline-2 (LCN-2), dans des homogénats iléaux de pleine épaisseur en tant que marqueurs biochimiques supplémentaires de l’inflammation (Figure 3B). Les concentrations de MPO et de LCN-2 étaient significativement plus élevées (p = 0,0031 et p = 0,0002 respectivement) chez les souris SHIP-/- par rapport aux témoins SHIP+/+, bien que l’augmentation de LCN-2 ait été largement due à des concentrations élevées mesurées chez 2 souris sur 6. Le traitement par la dexaméthasone a réduit la MPO et légèrement réduit la LCN-2, les différences n’étaient pas significatives. Ces données suggèrent que le MPO est un marqueur utile de l’inflammation chez les souris SHIP-/-, alors que les concentrations de LCN-2 ne sont pas aussi constantes ou fiables.

Pour étudier la relation entre les caractéristiques inflammatoires et fibrotiques dans le modèle murin SHIP-/-, nous avons effectué des analyses de corrélation de Spearman en utilisant des scores de dommages histologiques, des scores de fibrose et des concentrations d’IL-1β dans des tissus iléaux de pleine épaisseur (Figure 4). Les concentrations d’IL-1β étaient positivement corrélées avec les scores de dommages histologiques (r = 0,6813), indiquant qu’une inflammation accrue était associée à une augmentation des lésions tissulaires (figure 4A). Une corrélation modérée a également été observée entre les concentrations d’IL-1β et les scores de fibrose (r = 0,4117), suggérant un lien entre la production de cytokines inflammatoires et le remodelage fibrotique (Figure 4B). De plus, les scores de dommages histologiques étaient significativement corrélés avec les scores de fibrose (r = 0,6241), ce qui suggère que les dommages structurels et la fibrose progressent en parallèle chez les souris SHIP-/- (Figure 4C).

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Figure 1 : La dexaméthasone réduit la pathologie intestinale macroscopique et la perméabilité chez les souris SHIP-/-. De 6 à 8 semaines, des souris SHIP+/+ et SHIP-/- ont été gavées quotidiennement par gavation orale avec de la β-cyclodextrine à 0,5 % comme témoin du véhicule (VC) ou de la dexaméthasone (Dex ; 3 mg/kg). (A) Calendrier expérimental recommandé. (B) La morphologie macroscopique du cæcum et de l’iléon distal a été évaluée, et des images représentatives sont présentées (n = 4 à 6 souris par groupe). Les astérisques désignent des zones de rougeur et d’épaississement inégales observées à l’examen macroscopique. Les images sont destinées à servir d’exemples représentatifs de la pathologie globale et ne sont pas destinées à une analyse quantitative. (C) Pour évaluer la perméabilité intestinale, des souris ont été à jeun pendant 4 h et gavées avec 80 mg/mL de FITC-dextran. Après 4 heures supplémentaires de jeûne, le sang a été prélevé par ponction cardiaque et les concentrations plasmatiques de FITC-dextran ont été mesurées. Les données sont présentées sous forme de moyenne±écarttype. La barre grise représente la plage des concentrations plasmatiques de FITC-dextran généralement observées chez les souris C57BL/6 en bonne santé quatre heures après le gavage25. La signification statistique a été déterminée à l’aide du test de Kruskal-Wallis suivi du test de comparaisons multiples de Dunn. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : La dexaméthasone réduit les scores de dommages histologiques, le collagène, l’épaisseur musculaire et l’hyperplasie et l’hypertrophie des cellules caliciformes dans l’iléon distal des souris SHIP-/-. De 6 à 8 semaines, des souris SHIP+/+ et SHIP-/- ont été gavées quotidiennement par gavation orale avec de la β-cyclodextrine à 0,5 % comme témoin du véhicule (VC) ou de la dexaméthasone (Dex ; 3 mg/kg). (A) Des coupes transversales iléales de souris colorées à H&E ont été photographiées à un grossissement de 10x ; barres d’échelle = 200 μm. (B) Scores de dommages histologiques pour les souris SHIP+/+ et SHIP-/- exprimés en ± IQR médian. (C) Des coupes transversales iléales fixes ont été colorées avec du trichrome de Masson pour la fibrose ; Le collagène est coloré en bleu. Les images ont été prises à un grossissement de 10x ; barres d’échelle = 200 μm. Les scores de fibrose pour les souris SHIP+/+ et SHIP-/- exprimés en ± IQR médian. (D) Des coupes transversales iléales fixes ont été colorées au bleu Alcian/PAS. Les images ont été photographiées à un grossissement de 10× ; barres d’échelle = 200 μm. Toutes les sections sont représentatives de n = 6 souris par groupe (sauf SHIP+/+ Dex et SHIP-/- Dex, n = 5). La signification statistique du score de dommages histologiques a été déterminée à l’aide du test de Kruskal-Wallis suivi du test de comparaisons multiples de Dunn. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : La dexaméthasone réduit les concentrations d’IL-1β dans les homogénats iléaux de pleine épaisseur de souris SHIP-/-. De 6 à 8 semaines, des souris SHIP+/+ et SHIP-/- ont été gavées quotidiennement par gavation orale avec de la β-cyclodextrine à 0,5 % comme témoin du véhicule (VC) ou de la dexaméthasone (Dex ; 3 mg/kg). (A) Les concentrations d’IL-1β, de TNF et d’IL-6 ont été mesurées dans des homogénats iléaux de pleine épaisseur. (B) Les concentrations de myéloperoxydase (MPO) et de lipocaline-2 (LCN-2) ont été mesurées dans des homogénats de tissu iléal de pleine épaisseur. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du test de Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaisons multiples de Dunn. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Les concentrations d’IL-1β sont positivement corrélées avec les lésions histologiques et la fibrose, et la fibrose est corrélée avec le score des dommages histologiques chez les souris SHIP-/-. Une analyse de corrélation de Spearman a été effectuée pour évaluer les relations entre le score de dommages histologiques, le score de fibrose et les concentrations d’IL-1β dans le tissu iléal de pleine épaisseur de souris SHIP-/-. Des corrélations positives significatives ont été observées entre (A) le score de dommages histologiques et les concentrations d’IL-1β (r = 0,6813), (B) le score de fibrose et les concentrations d’IL-1β (r = 0,4117), et (C) le score de dommages histologiques et le score de fibrose (r = 0,6241). Chaque point de données représente une souris individuelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composante de dégâtsScore
Perte de l’architecture de la crypte0 = aucun
1 = <25 % de perte
2 = 25-50 % de perte
3 = 50-75 % de perte
4 = >75 % de perte
Infiltration de cellules immunitaires0 = aucun
1 = cellule immunitaire occasionnelle dans la lamina propria
2 = augmentation des cellules immunitaires dans la lamina propria
3 = cellules immunitaires confluentes dans la lamina propria et la muqueuse brèche
4 = infiltration de cellules immunitaires dans toute la section
Hyperplasie et hypertrophie des cellules caliciformes0 = aucun
1 = Augmentation de <50 % du nombre et de la taille des cellules du gobelet
2 = augmentation de >50 % du nombre et de la taille des cellules du gobelet
Ulcération0 = aucun
1 = ulcération intermédiaire
2 = ulcération importante
Œdème0 = aucun
1 = <50 % de la section
2 = >50 % de la section
Épaississement musculaire0 = aucun
1 = épaississement intermédiaire
2 = épaississement substantiel

Tableau 1 : Scores de lésions histologiques. Les dommages histologiques des coupes transversales iléales des souris SHIP+/+ et SHIP-/- colorées avec H&E sont notés en fonction des principales caractéristiques de l’iléite qui caractérisent le modèle murin SHIP-/-, notamment la perte d’architecture (0-4), l’infiltration des cellules immunitaires (0-4), l’hyperplasie et l’hypertrophie des cellules caliciformes (0-2), l’ulcération (0-2), l’œdème (0-2) et l’épaississement musculaire (0-2).

Composante fibroseScore
Excès de collagène0 = Architecture normale ; Pas d’excès de collagène
1 = Légère augmentation du collagène ; limité à la sous-muqueuse ou à la sous-séreuse
2 = Expansion modérée du collagène dans la sous-muqueuse et la musculeuse propria partielle, avec des faisceaux désorganisés
3 = Collagène étendu et dense remplaçant la structure normale, impliquant la sous-muqueuse et la musculeuse (transmurale)
Hyperplasie fibromusculaire/musculation/oblitération musculaire de la sous-muqueuse0 = Aucun, teneur normale en sous-muqueuse musculaire
1 = Légère augmentation de la teneur musculaire
2 = Grande quantité de muscle dans la sous-muqueuse, affecte la morphologie mais la structure normale
3= Le muscle a oblitéré tout l’espace sous-muqueux

Tableau 2 : Score de fibrose. La fibrose dans les coupes transversales iléales des souris SHIP+/+ et SHIP-/- colorées au trichrome de Masson a été notée sur la base des principales caractéristiques de la fibrose intestinale observées dans le modèle SHIP-/-, y compris le dépôt excessif de collagène (0-3) et l’hyperplasie fibromusculaire ou l’oblitération musculaire de la sous-muqueuse (0-3). L’étendue et la perturbation architecturale du collagène sont évaluées, tandis que les modifications musculaires sont évaluées en fonction du degré d’infiltration musculaire et de distorsion de la structure sous-muqueuse.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit les procédures d’évaluation de l’iléite et de la fibrose intestinale chez les souris SHIP-/-, un modèle murin d’inflammation intestinale de type CD avec une pathologie fibrotique associée. Le modèle murin SHIP-/- récapitule les caractéristiques de la MC qui ne sont pas couramment observées dans d’autres modèles murins d’inflammation intestinale, en particulier la localisation iléale, l’inflammation inégale et transmurale et la pathologie fibrotique19,26. Combiné à la facilité de reproduction et à la brièveté du délai de manifestation de la maladie, le modèle SHIP-/- est bien positionné comme un outil puissant pour la recherche translationnelle dans le CD19.

Dans cette étude, la signification statistique du dosage FITC-dextran et du score histologique a été évaluée à l’aide du test de Kruskal-Wallis, car ces ensembles de données ne répondaient pas aux hypothèses de normalité requises pour une ANOVA à un facteur, et les scores histologiques représentent des variables discontinues et non paramétriques. Bien que nos analyses n’aient pas révélé de différences statistiquement significatives entre les groupes traités par la dexaméthasone et les groupes traités par véhicule, nous avons observé des tendances claires. La dexaméthasone a réduit la perméabilité intestinale et l’histopathologie des souris SHIP-/-, et ces effets ont peut-être atteint une signification avec des échantillons de plus grande taille.

Plusieurs défis techniques peuvent survenir lors de l’exécution de ce protocole. En ce qui concerne la manipulation des tissus, les SHIP-/- ilea nécessitent une manipulation douce pendant la dissection car ils sont sujets à la déchirure. Ceci est particulièrement important lors de la préparation des tissus pour l’imagerie macroscopique. La fixation tissulaire est un autre facteur critique pour l’analyse histologique. Le tissu fixé au formol convient à la fois à la coloration H&E et à la coloration trichrome de Masson, mais il est incompatible avec la coloration au bleu Alcian/PAS. En revanche, le tissu fixé par Carnoy convient pour la coloration H&E et Alcian Blue/PAS, mais pas pour le trichrome de Masson. La fixation de Carnoy entraîne une coloration bleu foncé intense et diffuse, qui obscurcit la visualisation du collagène et de la couche musculaire. Pour l’analyse des cytokines, il est essentiel de traiter les échantillons sur de la glace car les cytokines sont très sensibles à la dégradation. Il est essentiel d’aliquote les homogénats de tissus clarifiés immédiatement après le traitement. Les cycles répétés de congélation-décongélation peuvent compromettre considérablement l’intégrité des cytokines et miner toute différence potentielle entre les génotypes et/ou les groupes de traitement. Enfin, pour assurer une quantification précise, nous recommandons d’effectuer plusieurs dilutions de chaque échantillon pour confirmer que les lectures se situent dans la plage linéaire de la courbe standard du test et pour minimiser les interférences potentielles de la matrice tissulaire complexe. Il est essentiel de tenir compte de ces considérations techniques pour générer des résultats reproductibles et interprétables, mais la variabilité biologique inhérente aux souris SHIP-/- doit également être gérée avec soin.

Il y a plusieurs aspects critiques des souris SHIP-/- qui doivent également être pris en considération et soigneusement contrôlés pour assurer la reproductibilité et minimiser les variables confondantes. Le microbiome intestinal a un impact profond sur le développement de la maladie et les réponses thérapeutiques dans les modèles murins de MII27,28. Nos travaux antérieurs ont montré que l’inflammation intestinale chez les souris SHIP-/- dépend du microbiote et peut être améliorée avec des antibiotiques29. Par conséquent, des témoins de la portée doivent être utilisés pour réduire la variabilité induite par le microbiome, et les groupes de traitement doivent être équilibrés pour l’origine de la cage30. De plus, une correspondance minutieuse entre les sexes est essentielle. Bien qu’aucune différence fondée sur le sexe en matière de pénétrance ou de gravité de la maladie n’ait été observée chez les souris SHIP-/-, d’autres modèles d’iléite tels que SAMP1/YitFc présentent une apparition plus précoce et une gravité accrue de la maladie chez les femelles14,31. Comme les hormones sexuelles peuvent également moduler la composition microbienne32, l’appariement pour le sexe est essentiel pour minimiser les facteurs de confusion potentiels dans les études de traitement. De plus, les traitements individuels évalués peuvent avoir une efficacité différentielle chez les souris mâles et femelles. Bien que nos résultats actuels ne révèlent pas de différences liées au sexe dans la maladie ou la réponse thérapeutique à la dexaméthasone, l’appariement du sexe doit être effectué dans toutes les études de traitement.

En plus des considérations relatives au microbiome et au sexe décrites ci-dessus, il est important d’inclure les souris SHIP+/+ dans les études de traitement afin d’évaluer les effets du véhicule et des agents thérapeutiques en l’absence d’inflammation intestinale. Cela garantit que ni le médicament ni son mode d’administration ne causent ou ne contribuent à une pathologie dans l’intestin sain, améliorant ainsi l’interprétation de l’efficacité thérapeutique et de la sécurité.

Le moment de l’intervention thérapeutique est également essentiel et doit être modifié en fonction des objectifs expérimentaux, car il existe des différences significatives dans l’inflammation et la fibrose chez les souris à 4, 8 et 12 semaines del’âge de 19 et 26 ans. Les souris SHIP-/- développent une inflammation intestinale dès l’âge de 4 semaines, toutes les souris présentant une inflammation à l’âge de 6 semaines, et les marqueurs de la pathologie fibrotique peuvent être mesurés dès l’âge de 6 semaines et sont bien établis à l’âge de 8 semaines de19,26. Ainsi, les traitements ciblant l’inflammation iléale doivent commencer à l’âge de 6 semaines. Les interventions antifibrotiques peuvent être initiées à titre prophylactique à 6 semaines ou thérapeutiques entre 8 et 10 semaines. Cependant, l’apparition et la gravité de la maladie peuvent varier en fonction de l’environnement microbien, qui diffère d’un établissement à l’autre. Les chercheurs doivent d’abord déterminer la cinétique de la maladie dans leur colonie avant de mettre en œuvre des protocoles de traitement. De plus, les souris SHIP-/- peuvent présenter une réduction de poids allant jusqu’à 17 % en 4 à 5 semaines, avec 5 % supplémentaires en 8 à 10 semaines33. Les animaux présentant une perte de poids importante doivent être exclus des études, car cela reflète une manifestation grave de la maladie et peut compromettre les résultats du traitement lié à la pathologie intestinale.

Une considération importante lors de l’analyse de la progression de la maladie dans le modèle SHIP-/- est la sélection de marqueurs inflammatoires appropriés. Sur la base de notre vaste expérience avec la souris SHIP-/-, le profilage des cytokines est généralement axé sur des médiateurs spécifiques, tels que l’IL-1β, qui sont connus pour être régulés à la hausse au cours de la progression de la maladie. Cependant, pour la caractérisation initiale des réponses inflammatoires ou lors de l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques, une analyse multiplexe des cytokines est conseillée. Cette approche impartiale permet un profilage plus large du milieu inflammatoire et peut révéler des cibles inattendues pertinentes pour la pathogenèse de la maladie ou la réponse au traitement.

Le modèle de souris SHIP-/- offre des avantages pratiques qui permettent la reproductibilité et l’efficacité. Les souris SHIP-/- développent une inflammation iléale et une fibrose spontanées et constantes sans avoir besoin de déclencheurs exogènes. Cela élimine la variabilité associée à la préparation des réactifs et aux protocoles de dosage non standardisés lors de l’induction d’une inflammation intestinale. L’apparition de la maladie est rapide, avec une inflammation évidente à l’âge de 4 à 6 semaines et une fibrose à l’âge de 8 semaines, ce qui rend le modèle à la fois rapide et rentable. De plus, les souris SHIP-/- sont faciles à élever et à entretenir, le génotypage est simple et aucune stratégie de reproduction spécialisée n’est requise. Cela simplifie la gestion des colonies, réduit la charge de travail technique et réduit le risque d’introduire une variabilité génétique involontaire 19,21,26. La maladie peut être évaluée de manière fiable à l’aide de techniques largement disponibles dans la plupart des contextes de recherche, y compris le test FITC-dextran, H&E et la coloration trichrome de Masson, et ELISA. Ces caractéristiques combinées permettent une conception efficace des études, réduisent les obstacles financiers et techniques et favorisent une génération de données cohérente entre les laboratoires.

Bien que le modèle SHIP-/- présente des avantages uniques, il présente également des limites. Comme tous les modèles précliniques, il ne peut pas reproduire entièrement la nature complexe et multifactorielle de la MII humaine, qui est influencée par des facteurs génétiques, immunitaires et environnementaux34. Les modèles DSS et TNBS restent très populaires en raison de leur simplicité et de leur rentabilité. Lorsqu’ils sont combinés à des modifications génétiques, ces modèles chimiques peuvent servir d’outils efficaces pour comprendre les contributions spécifiques des gènes à la fonction barrière35. Cependant, leur principale utilité réside dans la modélisation des lésions épithéliales aiguës ; ils ne parviennent pas à saisir la pathologie immunitaire chronique qui caractérise la MC et leur mécanisme de lésions épithéliales induites par des agents chimiques qui n’ont pas de pertinence clinique directe36. Le fait de se fier exclusivement à un seul modèle peut entraîner une évaluation incomplète et/ou trompeuse du potentiel thérapeutique, et il est recommandé d’utiliser plusieurs modèles pour s’assurer de l’efficacité du traitement.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux sont financés par l’installation de soins aux animaux de l’Institut de recherche de l’Hôpital pour enfants de la Colombie-Britannique et par le financement du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada par l’intermédiaire du Réseau canadien de glycomique (GlycoNet, un réseau de centres d’excellence) et des Instituts de recherche en santé du Canada (MOP-133607 à LS). K.S. et W.M. sont récipiendaires des bourses de doctorat TRIANGLE (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microtube à capuchon snap de 1,7 mL & nbsp ;DiamedSPE155-N
1x DPBS (sans chlorure de calcium, sans chlorure de magnésium)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” aiguilles  ;BDREF 305122Pour la ponction cardiaque
26G x figure-materials-2” aiguillesBDREF 305110Flushing intestinal
Acide acétiqueSigma-AldrichA6283Histologie
Solution de dextrose de citrate acide (acide citrique 38 mM, 107 mM de citrate de sodium, 136 mM de dextrose)Millipore SigmaC3821
Aiguille d’alimentation animale, non stérile, réutilisable, type 304SSMillipore Sigma & nbsp ;CAD7900  ;Pour gavage
Straight
Taille : 24G,
Lxdiam. 1 pouce. x 1,25 mm,
balle
AprotinineCayman Chemical9087-70-1Tampon d’homogénéisation
Syringue BD Luer-Lok stérile, à usage unique, 5 mLBDREF 309646Flushing intestinal
BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA SetBD Biosciences555240
BD OptEIA Souris TNF ELISA Set IIBD Biosciences558534
BD® ; Seringue Luer Slip Tip stérile, à usage unique, 1 mLBDREF 309659
Mousse de biopsie en mousse carrée, 30,2 x 25,4 x 2 mm H.Simport ScientificREF M476-1Histologie
Formalde tamponné - frais (faible odeur 10 % de formol)Fisher ChemicalSF93-4Histologie
Plaques immuno-non stériles à fond plat clair à 96 puitsThermo Scientific439454
Centrifugeuse réfrigérée Eppendorf 5415R   ;Marshall ScientificEP-5415R
Alcool éthylique anhydreGreenfield GlobalP016EAANHistologie
Cassette tissu Fisherbrand TRU-FLOWFisher Scientific15-200-403Histologie
FITC-dextran, 3-5kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
Numéro CAS : 60842-46-8
LeupeptinMillipore Sigma103476-89-7Tampon d’homogénéisation
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA  ;R& Systèmes DDY401
Plaque multiécran à 96 puits, fond solideMillipore SigmaMSSWNFX40Blanc, non stérile, non traité
OmniPur ChloroformeMillipore Sigma3150Histologie
Homogénéiseur polytron PT-MR2100Cinématique AG632081
Lecteur de microplaques multimodes Varioskan LuxThermo ScientificVL0L00D0

Références

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Souris d ficientes en SHIPMod le de la maladie de CrohnInflammation il aleFibrose intestinaleEssai au FITC dextranTraitement la dexam thasoneAnalyse histologiqueColoration au trichrome de MassonHyperplasie des cellules caliciformesQuantification des cytokines

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