Article de méthode

Modèle murin d’embolie microvasculaire pour microscopie à deux photons in vivo utilisant des microspheres en polystyrène fluorescent

DOI :

10.3791/68939

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21 novembre 2025

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1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole contient une description détaillée d’une approche étape par étape pour un modèle murin à fenêtre crânienne chronique et embolie microvasculaire, optimisé pour l’imagerie in vivo à deux photons utilisant des microsphères fluorescentes en polystyrène.

Résumé

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Les occlusions microvasculaires dans le cerveau sont relativement courantes mais restent largement peu étudiées. Le taux d’événements, les conséquences à long terme et les mécanismes de compensation potentiels sont largement inconnus. Les modèles actuels utilisés pour étudier ces événements, tels que la photothrombose et l’injection de micro-emboles, présentent chacun leurs propres avantages et limites. Cette étude a développé un protocole détaillé qui combine la préparation d’une fenêtre crânienne chronique avec l’induction d’embolies microvasculaires cérébrales par injection intra-artérielle de microsphères chez la souris. Cette configuration permet l’imagerie in vivo à long terme de la microvascularisation et des micro-occlusions à l’aide de la microscopie à deux photons. Les microsphères sont administrées via un cathéter placé dans l’artère carotide externe (ECA), qui est définitivement ligatue. Il est important de noter que l’artère carotide commune (ACC) et l’artère carotide interne (ACI) restent intactes pendant et après l’intervention, minimisant ainsi les perturbations du flux sanguin cérébral. Pour faciliter l’imagerie in vivo immédiate et prévenir le regroupement ou l’adhésion des microspheres aux pointes de la pipette et au cathéter, les microsphères sont suspendues dans un mélange de FITC-Dextran et 0,1 % de Tween 20. La technique d’injection a été validée par imagerie 3D post mortem in situ afin de déterminer la répartition des microsphères. Cette étude démontre également son utilité avec un exemple in vivo de microscopie à deux photons. Cette approche offre une méthode cohérente et robuste pour induire et étudier les embolies microvasculaires, permettant d’étudier leur impact et leur dynamique de clairvoyance grâce à l’imagerie in vivo à haute résolution.

Introduction

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Un AVC ischémique dû à une embolie d’une grande artère cérébrale est un événement aigu et souventdévastateur 1. Les emboles peuvent également apparaître dans des vaisseaux plus distals. En conséquence, des infarctus cérébraux silencieux (SBI) peuvent se développer ; Comme son nom l’indique, ils restent asymptomatiques et sont généralement découverts de façon incidente lors de l’imagerie pour des raisons sans rapport 2,3. Les SBI sont courantes et figurent parmi les affections cérébrovasculaires les plus fréquemment observées dans les autopsies de personnes âgées 4,5. Des études épidémiologiques ont montré une prévalence de 20 % chez les personnes sans antécédents d’AVC. Les SBI contribuent aux dysfonctionnements cognitifs et à la démence, augmentent la mortalité globale et constituent un facteur de risque pour un futurAVC 6,7,8. Les infarctus ont généralement seulement quelques millimètres de diamètre et sont associés à une occlusion d’artères pénétrantes d’environ 100 μm de diamètre. Ces pénétrateurs donnent lieu à un vaste lit artérieux et capillaire. Un petit microthrombus traversant les artères pénétrantes et logé dans la microcirculation aval restera probablement indétectable lors del’angiographie 9. Cependant, de nombreux microthrobes peuvent être libérés dans la fibrillation auriculaire, les plaques athérosclérotiques, et d’autres sources 10,11,12,13,14. Outre les microthrombes, d’autres microparticules (MP), y compris les particules graisseuses, les agrégats cellulaires et même les microplastiques, peuvent provoquer des embolies microvasculaires. Plusieurs études montrent la présence de MP plastique dans le sang et le cerveau, qui est plus grand que le diamètre capillaire de 5μm 15,16.

Les occlusions microvasculaires restent relativement peu étudiées comparées à l’AVC aigu et aux SBI. On sait peu de choses sur le taux d’événement, les conséquences à long terme et les mécanismes de compensation possibles. Cependant, l’intérêt augmente rapidement après l’introduction clinique réussie de la thrombectomie mécanique dans les AVC, où les embolies microvasculaires peuvent provoquer une altération de la reperfusion microvasculaire après une recanalisation apparemment réussie de la grande artèrecoupable 17. De plus, on observe une augmentation de la recherche sur les microplastiques, ce qui pourrait en partie avoir un effet par emboliemicrovasculaire 18,19,20.

Les occlusions microvasculaires dans le cortex murin peuvent être étudiées, entre autres, par microscopie multi-photon, à l’aide d’une fenêtre crânienne. Les modèles les plus couramment utilisés pour étudier les occlusions microvasculaires cérébrales sont le modèle photothrombotique et le modèle microsphere. Le modèle photothrombotique utilise des colorants photosensibles pour induire des embolies dans certains vaisseaux (généralement des vaisseaux non capillaires) par photoactivation. Cependant, ce modèle ne permet pas d’étudier les embolies sur une période plus longue en raison de l’activation du système fibrinolytique, qui dissoutl’embolie 21,22. De plus, l’activation du colorant photosensible produit des espèces d’oxygène singulette, causant des lésions endothéliales et de la barrière hémato-encéphalique (BBB) 23. Pour les études sur la fonction endothéliale et BBB lors des embolies cérébrales, ainsi que sur les effets à long terme sur la circulation cérébrale et la fonction cérébrale, le modèle de microsphère est donc préféré. Le modèle d’injection de microsphères utilise des microspheres injectées dans la circulation cérébrale pour occulter la microvascularisationcérébrale 9,24,25,26,27,28,29,30. L’inconvénient possible de ce modèle réside dans le fait qu’il n’est pas possible de prédéterminer la localisation des embolies, contrairement à la méthode photothrombotique31,32. L’avantage est que des microspheres de diamètres bien définis peuvent être injectées, ciblant ainsi des (micro-)vaisseaux de diamètresspécifiques 33,34,35.

Au fil des années, plusieurs approches ont été développées pour injecter des microsphères dans la circulation cérébrale des rongeurs. Ces protocoles trouvent un consensus pour accéder au triangle carotidien, composé de l’artère carotide commune (CCA), de l’artère carotide interne (ICA) et de l’artère carotide externe (ECA) pour l’injection intra-artérielle de la microsphère. La méthode d’injection intra-artérielle de microsphère varie selon les protocoles de plusieurs façons. Premièrement, les études ont utilisé soit une seringue 9,26,27,29,33,34, soit un cathéter 25,28,30,36. Deuxièmement, il existe une variation considérable dans le nombre et la taille des microsphères injectées. Les diamètres des microsphères varient généralement entre 10 et 50 μm, le choix dépendant de la taille du récipient cible. En règle générale, plus les microsphères sont grandes, plus le nombre que l’on doit injecter est bas, car il y a moins d’artérioles que decapillaires 25, 26, 30.

Atteindre une injection intra-artérielle constante de microsphère reste un défi. En pratique, un grand nombre de microsphères sont injectées, mais seule une fraction atteint la circulation cérébrale. Cela pose particulièrement problème pour étudier les effets des microspheres logées par imagerie à deux photons in vivo , car le succès de cette technique dépend de la présence de microspheres dans les couches externes du cortex de la souris, dans la vue à travers la fenêtre crânienne préparée. Le choix de colorants fluorescents appropriés pour les microsphères est crucial, car les combiner avec des modèles murins transgéniques et une coloration intravasculaire peut être difficile en raison de la fluorescence intense des microspheres et des spectres d’émission qui se chevauchent.

Les occlusions microvasculaires sont étudiées dans des modèles de rongeurs, et des effets synergiques de multiples microspheres ont déjà été démontrés dans des cerveaux de rongeurs ex vivo 9, ainsi qu’une extravasation apparente de ces particules, un processus appelé angiophagie 33,35,37,38. Pour permettre leur investigation in vivo, des méthodes ont été développées pour la microscopie multiphotonique chez des souris présentant des fenêtres crâniennes. L’objectif de la présente étude est de développer et de rapporter un protocole détaillé pour l’injection intra-artérielle de microsphères chez la souris, qui optimise l’étude de leurs effets sur le tissu cérébral et leur destin. Le principal avantage de ce protocole est son efficacité accrue en matière de délivrance, la minimisation de la perte de microsphère et l’augmentation de la probabilité de leur présence dans le territoire de l’artère cérébrale moyenne (MCA) dans la zone d’imagerie par fenêtre crânienne. Le protocole d’injection de microsphère optimisé est évalué à l’aide d’une microscopie à deux photons in vivo et d’imagerie 3D post mortem in situ avec un cryo-microtomed’imagerie dédié 39.

Protocole

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Toutes les procédures impliquant des animaux suivaient le Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité central des expériences animales des Pays-Bas a accordé une approbation complète (AVD11400202316817).

REMARQUE : Des souris mâles et femelles âgées de 2 mois à 1 an ont été utilisées. À leur arrivée, les animaux étaient acclimatés pendant 7 jours avant toute procédure expérimentale. Les animaux étaient hébergés avec un maximum de 4 personnes par cage, fournis de nourriture et d’eau à volonté à volonté et maintenus sur un cycle de 12 heures clair-obscurité. Des souris NG2-DsRed et TIE2-GFP ont été obtenues (voir Tableau des matériaux pour plus de détails) et sélectionnées en interne.

1. Implant crânien de fenêtre

  1. Anesthésie et soins pré-chirurgicaux
    1. Ajoutez 0,06 mg/mL de Carprofène à l’eau potable un jour avant le début de l’opération de la fenêtre crânienne.
    2. Peser la souris et administrer 5 mg/kg de Carprofène et 2 mg/kg de dexaméthasone par voie sous-cutanée 30 minutes avant l’opération.
    3. Préparez la zone chirurgicale en positionnant une bouillotte avec un système de rétroaction sur le cadre stéréotaxique et en la recouvrant d’un tissu stérile.
    4. Étalez tous les instruments chirurgicaux stériles sur un second tissu stérile.
    5. Anesthésiez la souris dans une chambre d’induction avec un mélange d’air de 1 L/min (30 % d’oxygène et 70 % d’air médical) et 3-4 % d’isoflurane, puis maintenez l’anesthésie avec 1,5-2 % d’isoflurane à l’aide d’un masque facial.
    6. Fixez la souris dans un cadre stéréotaxique et insérez la sonde thermométrique du coussin chauffant de façon rectale à l’aide de lubrifiant. Appliquez une pommade pour les yeux pour éviter le séchage et réglez la bouillotte à 37 °C.
    7. Administrez par voie sous-cutanée 1,5 mg/kg de ropivacaïne à la ligne d’incision chirurgicale 5 minutes avant l’opération.
    8. Nettoyez la peau du crâne, du cou jusqu’à juste au-delà des yeux, avec de la bétadine à l’aide d’une pointe en coton.
  2. Préparation chirurgicale pour la fixation de la barre de tête et de la fenêtre
    1. À l’aide de pinces stériles et de ciseaux chirurgicaux, réalisez une incision initiale sur la peau au-dessus de l’arrière du crâne. Étendez l’incision depuis la suture lambda vers l’avant le long de la ligne médiane jusqu’aux points frontals juste devant la bregma (Figure 1A). Rétractez soigneusement et retirez la peau pour exposer complètement les muscles temporales des deux côtés.
    2. Appliquez environ 0,1 mL de lidocaïne à 1 % sur le crâne pour minimiser les saignements.
    3. Retirez le périoste et grattez toutes les zones du crâne où la barre de tête sera fixée à l’aide d’une lame chirurgicale. Faites les égratignures perpendiculaires à travers le crâne pour assurer une adhérence ferme de la barre de tête.
    4. Nettoyez le sang restant avec une pointe de coton et séchez le crâne à l’air comprimé.
  3. Fixation de la barre de tête
    1. Préparez un mélange de colle dentaire dans un récipient céramique froid (4 °C) en ajoutant 100 μL de monomère à 0,1 g de polymère et en mélangeant. Ajoutez 1 goutte de catalyseur au mélange pour initier une solidification rapide de la colle.
    2. Appliquez la colle sous la barre de tête. Inclinez légèrement la barre de tête vers le côté latéral gauche à partir du sinus sagittal et appuyez sur le crâne. Appliquez de la colle supplémentaire sur les bords de la barre de tête pour sceller toutes les ouvertures. Cela assure une adhérence ferme.
    3. Préparez un mélange de ciment dentaire en mélangeant 100 μL de liquide de ciment dentaire avec 0,1 g de poudre. Appliquez le ciment sur tous les côtés de la barre de tête tout en empêchant le ciment de s’écouler sur le crâne à la zone de forage. Ajoutez une couche supplémentaire de ciment dentaire sur la barre de tête pour former un puits, permettant l’application de fluides sur la fenêtre crânienne (Figure 1B).
    4. Laissez sécher la colle dentaire et le ciment pendant au moins 10 minutes.
    5. Confirmez l’adhérence ferme de la barre de tête en appliquant une pression douce sur le crâne où la craniotomie sera pratiquée. La barre de tête est correctement collée lorsque le crâne ne bouge pas et qu’aucun liquide n’apparaît entre le ciment dentaire et le crâne.
  4. Craniotomie
    1. Fixez la souris au support d’imagerie à l’aide de la barre de tête ou maintenez-la dans le cadre stéréotaxique pour fixer fermement la tête de l’animal pendant la craniotomie.
    2. Marquez la cible de forage de la craniotomie (diamètre de 4 mm) sur le crâne à l’aide d’un marqueur à pointe fine. Localiser le MCA visible à travers le crâne pour garantir que la fenêtre crânienne est positionnée de manière optimale, couvrant autant que possible le MCA. Pour confirmer la taille et le placement corrects de la cible de forage, tenez le verre de couverture au-dessus de la zone marquée et ajustez la taille de la cible de forage selon les besoins.
    3. Commencez à percer en cercles aux marques sans exercer de pression sur le crâne, afin d’éviter la génération de chaleur (Figure 1C). Refroidissez le crâne en appliquant du sérum physiologique tous les 30 s. Pendant le refroidissement, nettoyez et refroidissez la tête de perceuse en la plongeant dans l’eau, puis en la séchant avec un essuie-tout. Retirez régulièrement toute poussière osseuse à l’aide d’air comprimé. Confirmez la taille de la craniotomie en plaçant le verre de couverture sur le crâne et en ajustant le forage si nécessaire.
    4. Continuez à forer en cercles jusqu’à ce que l’os soit suffisamment aminci. Des fissures apparaissent dans la zone de forage une fois que le crâne est presque percé. Assurez-vous que l’os est suffisamment aminci en ajoutant du sérum physiologique pour ramollir le crâne et en appuyant doucement le milieu de l’os crânien dans la zone de forage. La zone de forage est suffisamment fine lorsque le crâne descend uniformément de tous côtés sous une pression douce. Continuez à forer jusqu’à ce stade. Ne percez pas le crâne ; Cela risque d’endommager la dure-mère et le tissu cérébral. Laissez la zone de forage trempée dans de l’aCSF si la dure-mère est endommagée ou si des saignements surviennent.
      REMARQUE : Avant de retirer le crâne, assurez-vous que toute la poussière osseuse est enlevée de la zone de forage. Les particules osseuses résiduelles sur la dure-mère peuvent potentiellement initier la repousse osseuse sous la fenêtre.
    5. Éliminez soigneusement toute poussière osseuse en utilisant de l’aCSF et de l’air comprimé. Appliquez de l’aCSF sur la zone forée jusqu’à ce que le crâne soit complètement immergé. À l’aide d’une aiguille de calibre 27 (0,4 mm x 16 mm) ou de calibre 30 (0,3 mm x 13 mm), perforez soigneusement le crâne aminci horizontalement (~180°), évitant ainsi de dommages à la dure-mère et au cerveau. Poussez doucement l’os vers le haut jusqu’à ce qu’il se détache, en appliquant une force minimale. Si l’os ne se détache pas facilement, continuez à percer. Retirer le crâne détaché avec une pince, en maintenant le cerveau immergé dans l’aCSF (Figure 1D).
    6. Rincer le cerveau avec un LCR, puis placer une éponge hémostatique stérile et absorbante de gélatine porcine imbibée d’un LCR sur le cerveau pour contrôler les saignements locaux pendant 2 minutes. Retirez soigneusement l’éponge, en gardant le cerveau immergé dans l’aCSF. Continuez à rincer avec du LCR pour éviter qu’il ne reste de poussière osseuse ni de sang sur le cerveau. Si le saignement persiste, placez une éponge hémostatique stérile et absorbante fraîche imbibée d’un LCR sur le cerveau.
      REMARQUE : Des saignements mineurs sont fréquents lors de l’ablation osseuse. Assurez-vous que le saignement a cessé avant de placer le verre, car un saignement résiduel peut réduire la clarté de la vitre.
  5. Placement du verre de couverture
    1. Absorbez l’LCR qui recouvre le cerveau avec une pointe de coton, ne laissant qu’une fine couche. Placez le verre de couverture sur le cerveau et pressez-le doucement contre l’ouverture du crâne à l’aide de micro-pinces pliées. Assurez-vous que le verre de couverture soit légèrement en dessous du niveau du crâne et soit positionné parallèlement à la barre de tête.
      REMARQUE : Le verre doit être fermement pressé contre le cerveau pour éviter la formation de cavités et préserver la qualité des fenêtres. Maintenir le verre de couverture parallèle à la barre de tête garantit qu’il est perpendiculaire à l’objectif du microscope, améliorant ainsi la qualité de l’image.
    2. Fixez le verre de couverture sur le crâne et la barre de tête avec de la colle époxy, en l’appliquant sur les côtés tout en maintenant fermement le verre en place et parallèle à la barre de tête.
    3. Scellez tous les bords du verre de couverture avec de la colle pour éviter toute exposition au cerveau. Gardez une goutte d’aCSF sur le cerveau pendant l’application pour empêcher la colle de s’infiltrer sous la fenêtre ou de toucher la dure-mère (Figure 1E).
    4. Laissez la colle solidifier pendant 5 minutes.

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Figure 1 : Aperçu du protocole de craniotomie. Exemples détaillés de photos et schémas des étapes cruciales lors de la craniotomie et de la chirurgie de pose de la barre de tête. (A) Retrait de la peau (étape 2.2). (B) Fixation de la barre de tête (étape 2.3). (C) Perçage de la craniotomie de 4 mm (étape 2.4.3). (D) Extraction du crâne (étape 1.4.5). (E) Placement du verre de couverture (étape 1.4.7). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Soins post-chirurgicaux
    1. Administrez 5 mg/kg de Carprofène par voie sous-cutanée.
    2. Transférez l’animal dans une cage de récupération à 37 °C pendant 30 minutes. Puis remettez le bébé dans sa cage d’origine avec 0,06 mg/mL de Carprofène dans l’eau potable pendant jusqu’à 2 jours après l’opération.
    3. Fournir de la nourriture trempée dans 0,06 mg/mL de Carprofène jusqu’à ce que l’animal retrouve son poids d’avant la chirurgie.
    4. Laissez l’animal récupérer pendant au moins 7 jours avant d’effectuer la chirurgie modèle d’embolie microvasculaire.

2. Modèle murin d’embolie microvasculaire

  1. Assemblage du cathéter
    1. Insérez la pointe d’un micro-cathéter de 20 cm de long (DI 0,23114 OD 0,27432 mm) dans un cathéter transparent (DI 0,31 OD 0,64 mm) et scellez la connexion avec de la colle époxy et du ruban adhésif. Confirmez que la longueur totale du cathéter est suffisante pour contenir au moins 160 μL.
    2. Insérez une aiguille luer-lock calibre 27 (0,1 mm x 16 mm) à l’extrémité opposée du cathéter transparent. Scellez l’extrémité avec de la colle époxy et du ruban adhésif.
    3. Remplissez une seringue de 1 mL de solution saline et connectez-la au verrou luer de l’aiguille du cathéter. Rinçez avec 0,7 mL de sérum physiologique, en veillant à ne pas laisser de fuites ni de bulles d’air.
    4. Remplissez le cathéter avec 80 μL de solution saline et notez le niveau atteint dans le cathéter.
  2. Anesthésie et soins pré-chirurgicaux
    1. Fournir à la souris de l’eau potable contenant 0,06 mg/mL de Carprofène un jour avant l’opération d’embolie microvasculaire.
    2. Placez une bouillotte avec un système de rétroaction sous un chiffon stérile et réglez-la à 37 °C.
    3. Placez tous les instruments chirurgicaux stériles sur un second tissu stérile.
    4. Peser la souris et administrer 5 mg/kg de Carprofène par voie sous-cutanée 30 minutes avant l’opération.
    5. Anesthésiez la souris à l’aide d’isoflurane à 3-4 % dans une chambre d’induction avec un débit gazeux de 1 L/min composé de 30 % d’oxygène et 70 % d’air chirurgical.
    6. Transférez la souris sur la table chirurgicale et maintenez l’anesthésie via un masque facial administrant 1,5-2 % d’isoflurane à 1 L/min avec 30 % d’oxygène et 70 % d’air.
    7. Insérez une sonde de température rectale lubrifiée et appliquez une pommade pour les yeux afin d’éviter le dessèchement.
    8. Placez une seringue de 2 mL sous le cou de la souris allongée pour faciliter l’accès à la zone chirurgicale.
    9. Fixez doucement les pattes avant sur la table d’opération avec du ruban adhésif.
    10. Raser la zone chirurgicale et appliquer de la bétadine suivie de la lidocaïne.
  3. Incision
    1. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’une pincée d’orteil.
    2. Effectuer une incision médiane d’environ 0,5 cm au-dessus de la trachée sous la mandibule à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces de disséque.
    3. Disséquez le tissu conjonctif à la surface du fascia cervical à l’aide de pinces de micro-suture pour exposer les muscles sternohyoïdiens sous-jacents.
    4. Séparez les muscles sternohyoïdien gauche et droit en déchirant doucement le tissu conjonctif entre eux. Rétractez le muscle omohyoïdien droit caudal-latéralement avec un crochet de tissu. Assurez-vous que le triangle carotidien droit, y compris le CCA, l’ICA et l’ECA, soit clairement visible.
  4. Préparation chirurgicale de l’ACC, de l’ICA, de l’ECA et de l’artère pariétale postérieure (APP)
    REMARQUE : Évitez de saisir ou de pincer le nerf vague ; Ne le déplacez que doucement pour éviter des effets néfastes sur la santé de l’animal. Ne touchez pas à la trachée, car cela peut causer des problèmes respiratoires. Identifiez l’artère occipitale (OA), qui se ramifie de l’ICA à mi-chemin entre la bifurcation en forme de Y de l’ICA et l’origine de l’ECA, ainsi que l’artère thyroïdienne supérieure (TA), qui se ramifie du côté médial de l’ECA. Ces artères sont fragiles et doivent être manipulées avec un soin extrême.
    1. Retirez tout fascia et tissu adipeux restants autour de la CCA.
    2. Séparez soigneusement le CCA du nerf vague.
    3. Placez deux filets 4/0 1,5 autour du CCA et attachez-les lâchement. Assurez-vous que les nœuds n’entravent pas la circulation sanguine du CCA.
    4. Retirez le fascia et le tissu adipeux de l’ACI et de la PPA. Liguez temporairement le PPA et toutes les branches latérales de l’ICA, y compris l’OA, en nouant un nœud avec un fil 4/0 1,5.
    5. Retirez le fascia et le tissu adipeux de l’ECA et de l’AT. Placez deux nœuds lâches autour de l’ECA et du TA en utilisant un filetage 4/0 1,5. Positionnez le fil le plus distal aussi loin que possible de la bifurcation en Y et utilisez-le pour ligater définitivement l’ECA et le TA. Laissez le nœud proximal défait.
  5. Préparation de la solution microsphere et chargement du cathéter
    REMARQUE : Préparez la solution FITC-Dextran/microsphère peu avant l’injection afin de minimiser l’adhésion de la microsphère au cathéter.
    1. Homogénéisez et soniez les microsphères de 10 μm (7,2 x 106 microsphères/mL) afin d’obtenir une suspension uniforme des particules individuelles.
    2. Préparez 140 μL de 25 mg/mL de FITC-Dextran 70 kDa contenant 0,1 % de Tween20, puis ajoutez 20 μL de microsphères homogénéisées pour obtenir 160 μL de mélange FITC-Dextran/Tween20/microsphère contenant 1,44 × 105 microsphères.
    3. Rétractez brièvement la seringue reliée au cathéter pour créer un sas.
    4. Immergez la pointe du cathéter dans le mélange préparé FITC-Dextran/Tween20/microsphère et retirez lentement la seringue jusqu’à ce que le mélange soit dans le cathéter.
    5. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le cathéter. Si présent, videz le mélange dans un récipient de 0,5 mL et répétez les étapes 2.5.3 et 2.5.4.
    6. Placez la seringue avec le cathéter chargé dans la pompe à seringue. Réglez la pompe à 10 μL/min et faites fonctionner jusqu’à ce qu’une petite goutte de mélange microsphérique apparaisse à l’extrémité du cathéter.
  6. Insertion de cathéter et injection de microsphère
    REMARQUE : Évitez d’injecter des bulles d’air dans le système vasculaire, car cela peut entraîner de graves effets indésirables voire la mort. Des bulles d’air peuvent résulter d’une mauvaise charge du cathéter ou de fuites dans le tuyau.
    1. Placez un clip de récipient sur l’ACI et resserrez l’un des nœuds proximaux préalablement préparés autour du CCA (voir étape 2.4.3).
    2. À l’aide de micro-ciseaux, réalisez une petite incision diagonale dans l’ECA à environ 0,5 mm distal du fil de ligatura. Assurez-vous que la taille de l’incision est légèrement inférieure au diamètre du cathéter.
    3. Absorbez tout sang avec un chiffon ou un tissu stérile, afin de veiller à ce qu’aucun sang ne continue de fuir au-delà des ligatures et du clip vaisseau.
      REMARQUE : Le triangle vasculaire doit rester exempt de sang après l’incision ECA. Le sang résiduel peut entraîner la formation de caillots, qui peuvent provoquer de grands événements ischémiques cérébraux lors du rétablissement du flux carotidien ou bloquer l’ECA, empêchant ainsi l’injection de microsphère.
    4. Allumez brièvement la pompe à seringue pour former une goutte de mélange de microsphère à l’extrémité du cathéter, afin de confirmer qu’il ne reste plus d’air dans la pointe du cathéter.
    5. Ouvrez l’incision ECA et insérez le cathéter à l’aide de micro-pinces fines. Évitez de toucher d’autres surfaces lors de l’insertion pour éviter la perte du mélange de microsphère ou l’entrée d’air dans le cathéter. Si l’insertion échoue ou si la pointe du cathéter touche une surface, répétez l’étape 2.6.4 avant de réessayer.
    6. Fixez le cathéter dans l’ECA en resserrant la suture proximale (voir étape 2.4.5) autour de l’ECA.
    7. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite ni de bulles d’air à l’intérieur du système vasculaire en démarrant la pompe à seringue à 10 μL/min. Si l’un des deux est présent, détachez le cathéter et revenez à l’étape 2.6.4.
    8. Si aucune fuite ou bulles d’air n’est détectée, continuez à pomper à 10 μL/min pour augmenter progressivement la pression dans le cathéter et les vasculaires jusqu’à ce qu’une augmentation visible de l’artère soit observée. Pour correspondre à la pression artérielle de l’animal, établir une pression adéquate dans le cathéter et la vascularisation avant de rouvrir l’ACI et le CCA. Lorsque le flux sanguin est rétabli dans le CCA et l’ICA, un peu de sang peut entrer dans le cathéter, mais il sera ensuite réinjecté dans l’ICA. Confirmez visuellement l’injection du mélange de microsphere dans l’ECA et que l’accumulation de pression est efficace en observant le colorant vert FITC remplir les artères. Si cela n’est pas observé, arrêtez la pompe à seringue, retirez le cathéter, puis répétez les étapes 2.6.4 à 2.6.8.
    9. Retirez le clip du récipient de l’ICA, puis augmentez le débit de la pompe à seringue à 20 μL/min. Confirmez la réussite de l’injection de microsphère en vérifiant que l’ICA distale à la bifurcation PPA est remplie de colorant FITC. Si confirmé, passer à l’étape 2.6.11 ; Sinon, passez à l’étape 2.6.10.
    10. Arrêtez la pompe à seringue et desserrez la ligature PPA. Repositionner la ligature PPA plus loin de la bifurcation ICA-PPA, puis resserrer la ligatura. Revenez à l’étape 2.6.9.
    11. Retirez le fil qui ligait le CCA pour permettre au mélange de microsphères de s’écouler dans l’ICA.
    12. Dépannage en cas de flux rétrograde lors de l’injection du mélange de microsphère :
      1. Si un flux rétrograde du mélange de microsphère dans le CCA se produit, il faut diminuer le débit de la pompe à seringue à 10 μL/min.
      2. Si le flux rétrograde continue, pressez doucement l’ECA, l’ICA et le CCA à l’aide de micro-pinces pour s’assurer qu’aucune obstruction du flux n’est présente à cause d’un thrombus.
      3. Confirmez visuellement qu’il n’y a pas d’embolie atmosphérique à l’intérieur du vasculaire. Un embole d’air peut être reconnu comme une section transparente à l’intérieur du vasculaire.
      4. En cas d’embolie atmosphaique, arrêtez la pompe à seringue et transférez l’embolie airienne vers l’ECA en comprimant doucement l’artère à l’aide de micro-pinces. Liguez le CCA et placez un clip de réception sur l’ECA. Retirez le cathéter et l’embolie d’air puis revenez à l’étape 2.6.4.
      5. Si aucun obstacle n’est présent, mais que le flux rétrograde continue, fermez la CCA en utilisant une pince de récipient et revenez à l’étape 2.6.10.
        REMARQUE : Un flux rétrograde du mélange microsphere dans le CCA ne doit pas se produire, car cela pourrait indiquer une réouverture insuffisante de l’ICA, une embolie atmosphérique ou une formation de thrombus avec des effets potentiellement néfastes sur le résultat de l’expérience.
    13. Arrêtez l’injection de microsphère en coupant la pompe à seringue dès que le mélange dans le cathéter atteint la barre des 80 μL (voir étape 3.1.4). Un total de 80 μL de FITC-Dextran/Tween20 avec 7,2 x 104 microspheres est injecté.
  7. Complétion de la procédure
    1. Liguez le CCA avec le nœud préparé restant (voir étape 2.4.3) et fermez l’ICA avec le clip du navire.
    2. Retirez le cathéter de l’ECA tout en maintenant le filetage fixant le cathéter dans l’ECA dans la même position.
    3. Ligate définitivement l’ECA en resserrant le filetage qui maintenait le cathéter.
    4. Retirez la pince du vaissèl et les filets autour du CCA, ICA et PPA pour rétablir la circulation sanguine. Humidifier la zone chirurgicale avec quelques gouttes de sérum physiologique.
    5. Suture la peau avec une aiguille courbe 3/8 à découpe inversée de 12 mm et une suture en soie 3-0 (USP) non absorbable.
  8. Soins post-chirurgicaux
    1. Administrez par voie sous-cutanée 5 mg/kg de Carprofène.
    2. Transférez l’animal dans la cage de récupération (~33 °C) pendant 30 à 60 minutes. Remet l’animal dans sa cage une fois complètement rétabli.
    3. Pendant les deux premiers jours, faites tremper la nourriture pendant 10 minutes dans 0,06 mg/mL de Carprofène et fournissez à l’animal, puis complétez l’eau potable avec 0,06 mg/mL de Carprofène. Après cette période, continuez à administrer de la nourriture trempée sans Carprofène jusqu’à ce que l’animal retrouve son poids d’avant la chirurgie.
    4. Surveillez l’animal plusieurs fois par jour pendant les deux premiers jours, puis 3 fois par semaine. Euthanasiez l’animal si un objectif humain est atteint.
      REMARQUE : Les objectifs humains sont définis conformément à la directive 2010/63/UE du Parlement européen. De plus, euthanasiez tout animal s’il présente des signes d’ischémie, tels que des comportements de cercle ou une paralysie, car le modèle d’embolie microvasculaire ne devrait pas provoquer un événement ischémique majeur.

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Figure 2 : Chirurgie de l’embolie microvasculaire. Exemples détaillés d’images et schémas des étapes cruciales lors de la chirurgie de l’embolie microvasculaire. (A) Préparation des ligatures CCA (2x), ECA (2x), TA, OA et PPA (étape 2.4). (B) Ligature (temporale) de la CCA (1st) et de l’ECA, suivie de la fermeture de l’OA et de la PPA et de la fermeture temporaire de l’ICA avec une pince de vaisseau, permettant une incision dans l’ECA sans saignement (étape 2.6.2). (C) Placement du cathéter dans l’ECA disséquée, qui sont attachés ensemble avec la seconde suture (étape 2.6.7). (D) Ouverture de la suture proximale autour de la CCA et retrait de la pince vaisseau de l’ACI pour rétablir le flux sanguin, suivi de l’injection du mélange microsphere dans l’ACI (étape 2.6.10). CCA = Artère carotide commune ; ECA = Artère carotide externe ; TA = Artère thyroïdienne ; OA = Artère occipitale ; PPA = Artère ptérygopalatine ; ICA = Artère carotide interne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Imagerie in vivo

  1. Microscopie à deux photons
    1. Placez l’animal dans le support d’imagerie à deux photons du microscope pour une imagerie in vivo post-opératoire. Maintenez une anesthésie légère avec 1,2 % d’isoflurane dans un mélange de 1 L/min composé de 30 % d’oxygène et 70 % d’air, et surveillez la fréquence et la profondeur de la respiration. Voir le Tableau Supplémentaire 1 pour les détails de l’installation du microscope.
    2. Localiser les microsphères logées à travers la fenêtre crânienne à l’aide d’un objectif 10x (10x/0,30 DRY) et d’une lampe au mercure. Ensuite, passez à l’imagerie à deux photons avec un objectif d’immersion 25x dans l’eau (25x/0,95 EAU). Voir le Tableau Supplémentaire 2 pour les réglages d’imagerie.
    3. Enregistrez les piles Z autour de la microsphère d’intérêt.

4. Analyse post-mortem

  1. Endpoint expérimental pour l’imagerie in situ
    1. Lorsque le point final de l’expérience est atteint, euthanasiez l’animal par luxation cervicale sous > 4 % d’isoflurane dans un mélange de 1 L/min composé de 30 % d’oxygène et 70 % d’air médical.
  2. Imagerie cérébrale in situ
    1. Extraire le cerveau, l’intégrer dans un solvant sodique à 3,0 % de carboxyméthylcellulose (Sigma) mélangé à 0,1 % d’encre noire (VWR), puis congeler à −20 °C pendant au moins 24 heures.
    2. Imagez le cerveau à l’aide d’un petit système de cryomicrotome d’imagerie fluorescente 3D (small-3D-FICS) précédemment décrit par Juch R.N.S. et al.40. Réglez le système pour couper le cerveau verticalement en sections de 16 μm et imager à une résolution de 13,66 × 13,66 μm. Voir le Tableau Supplémentaire 3 et le Tableau Supplémentaire 4 pour les paramètres d’imagerie et les spécifications du système. Analysez les images à l’aide du logicielArticulus 41.
  3. Imagerie in situ de la souris entière
    1. Retirez la peau, les dents et la queue de l’animal.
      REMARQUE : Le retrait de la queue est optionnel mais augmente la vitesse d’imagerie.
    2. Imprégner l’animal dans un solvant sodique à 3,0 % de carboxyméthylcellulose (Sigma) mélangé à 0,1 % d’encre noire (VWR), puis congeler à −20 °C pendant au moins 24 heures.
    3. Imagez l’animal à l’aide d’un grand système de cryomicrotome d’imagerie fluorescente 3D (large-3D-FICS) comme décrit précédemment 42. Réglez le système pour couper des sections de 25,9 μm à une résolution en plan de 26,09 μm. Voir le Tableau Supplémentaire 5 et le Tableau Supplémentaire 6 pour les paramètres d’imagerie et les spécifications du système. Analysez les images à l’aide du logicielArticulus 41.

Résultats

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Imagerie post mortem in situ

Le succès de la chirurgie de l’embolie microvasculaire a été confirmé par une imagerie in situ post-mortem de tout le corps et du cerveau complet, 4 jours après l’embolie microvasculaire (Figure 3A). La tranche sagittale d’une souris montre un logement de micro-spheres dans le cerveau. La figure 3B, C montre un exemple d’extraction d’un cerveau de souris, un jour après une chirurgie d’embolie microvasculaire. Les microsphères étaient principalement logées dans l’hémisphère ipsilatéral, dans le territoire de flux des artères cérébrales moyenne et antérieure. Le nombre de microspheres dans les tranches de cerveau a été significativement augmenté lorsque Tween20 a été ajouté au mélange (Figure 3E). Le suivi du poids pendant la récupération après la chirurgie de micro-embolie montre que les souris ont perdu moins de poids et récupéré plus rapidement après l’opération lorsqu’elles ont été injectées avec un mélange de microsphère contenant Tween20 (Figure 3F).

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Figure 3 : Répartition des microspheres chez la souris après une chirurgie d’embolie microvasculaire. Localisation in situ de microspheres à 10 μm dans la souris visualisée à l’aide du logicielArticulus 41. (A) Exemple du plan sagittal d’une souris entière imagée avec le grand 3D-FICS après une chirurgie d’embolie microvasculaire. (B-D) Images représentatives axiales, coronales et sagittales d’un cerveau de souris, imagées à l’aide du petit 3D-FICS. (E) Nombre moyen de microspheres détectées par section cérébrale coronale de 50 μm à environ bregma ± 0,5 mm pour les conditions de contrôle et préadolescent20. Les barres représentent l’écart-type moyen ±. Les mesures individuelles sont indiquées sous forme de points. La comparaison statistique a été réalisée à l’aide d’un test t non apparié ; La valeur p est indiquée dans le graphique. Les valeurs aberrantes ont été identifiées et supprimées à l’aide de la méthode de la plage interquartile (IQR) (n = 1 pour les deux groupes), ce qui donne une taille finale de groupe de n = 3 pour les témoins et n = 14 pour les préadolescents 20. (F) Changements de poids normalisés au fil du temps après une chirurgie d’embolie microvasculaire au moment 0. Les poids ont été normalisés à la base de chaque animal lors de l’opération. Les lignes montrent la moyenne ± DS par groupe (Contrôle, n = 4 ; Tween20, n = 5) avec Control en bleu et Tween20 en orange foncé. La signification statistique entre les groupes à chaque moment a été évaluée à l’aide de tests t à deux queues non appariés. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Injection de microsphère et microscopie à deux photons in vivo

Lors de l’injection de microsphères, les cathéters recouverts de 5 % de BSA ont montré que de nombreuses microspheres adhéraient à la surface du cathéter, et les microsphères en mouvement étaient souvent regroupées, ce qui peut potentiellement provoquer des occlusions plus importantes (voir Vidéo supplémentaire 1). De plus, ajouter 5 % de BSA dans le mélange de microsphère pour prévenir l’adhésion et le regroupement n’est pas souhaitable en raison d’une réponse immunitaire potentielle lors de l’injection43,44. Pour contourner cela, une solution Tween20 à 0,1 % a été utilisée dans le mélange de microsphères, ce qui a permis d’obtenir un nombre visiblement plus élevé de microspheres circulant dans le cathéter et du nombre souhaité (> 20) de microsphères dans la fenêtre d’imagerie (Figure 4 et vidéo complémentaire 2). La figure 4A,B montre une image d’ensemble par microscopie à fluorescence du cortex cérébral 0,5 h après la chirurgie de l’embolie microvasculaire. Chaque point blanc représente une microsphère qui occulte un capillaire dans la microvascularisation cérébrale. La figure 4C,D montre par exemple la projection 2D des images z-stack à deux photons. Les microsphères provoquent des embolies microvasculaires cérébrales avec une perfusion altérée, indiquées par l’absence de colorant intraluminal en aval de la microsphère (Figure 4E et vidéo complémentaire 3). De plus, ces embolies provoquent une perturbation de la BBB lors de l’extravasation du colorant FITC-Dextran (Figure 4F,G).

Ces résultats sont conformes au faible nombre de microspheres adhérées au cathéter et au faible regroupement de microsphères, observé dans le cathéter lors de l’injection du mélange microsphère-Tween. Cependant, un grand nombre de microspheres se sont regroupées dans les 20 μL finaux du mélange de microsphères dans le cathéter, qui ne doit pas être injecté pour éviter la possible apparition d’un infarctus important (voir Vidéo supplémentaire 4).

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Figure 4 : Microscopie in vivo à deux photons des microsphères logées. Exemples d’images fluorescentes in vivo et à deux photons de microsphères logées dans le cortex de la souris. (A) Vue d’ensemble fluorescente à travers la fenêtre crânienne des microsphères du lodge. (B) Image fluorescente du ROI sélectionné. (C,D) Images microscopiques à deux photons de microspheres piégées dans la microcirculation cérébrale avec un ROI sélectionné pour une imagerie détaillée. Les images Z-stack sont représentées en 2D en calculant l’écart-type des intensités de pixels le long de la Z-stack. (E-G) Images microscopiques représentatives à deux photons in vivo montrant trois embolies microvasculaires cérébrales. Les flèches rouges mettent en évidence les zones d’extravasation du FITC-Dextrane, indiquant une perturbation du BBB et une fuite de colorant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau complémentaire 1 : Spécifications du système de microscope à deux photons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2 : Réglages de microscope à deux photons pour l’imagerie FITC-dextran et microsphere. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau complémentaire 3 : Paramètres du système Cryomicrotome pour imagerie cérébrale de souris avec microsphères bleues d’imagerie 3D fluorescente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 4 : Spécifications du système de Cryomicrotome à imagerie fluorescente 3D pour l’imagerie cérébrale de souris avec microsphères bleues. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 5 : Grands réglages du système Cryomicrotome à imagerie fluorescente 3D pour l’imagerie complète de la souris avec microsphères rouges. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 6 : Spécifications du système de cryomicrotome à imagerie fluorescente 3D pour l’imagerie de la souris entière avec microsphères rouges. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Vidéo complémentaire 1 : Cathéter recouvert de BSA à 5 % avec adhésion de la microsphère à la paroi du cathéter et regroupement de microsphère dans les 25 mg/mL de mélange de microsphère FITC-Dextran lors de l’injection. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo complémentaire 2 : Cathéter revêtu de Tween20 à 0,1 % avec une certaine adhérence de microsphère à la paroi du cathéter mais sans regroupement de microsphères dans le mélange de 25 mg/mL FITC-Dextran avec 0,1 % de Tween20 avec microspheres lors de l’injection. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo complémentaire 3 : Segmentation 3D des occlusions microvasculaires par microsphères. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo complémentaire 4 : Volume final de l’injection de microsphère avec une forte concentration de microsphère dans 25 mg/ml de FITC-Dextran avec un mélange Tween20 à 0,1 %. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : Adhésion de la microsphère à la validation des pointes de pipette. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Évaluation immunohistochimique de la couverture CD45 à 1, 7 et 28 jours après la chirurgie de microembolie en comparant les hémisphères ipsilatéraux et controlatéraux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour modéliser les embolies microvasculaires, un protocole d’injection de micro-sphères dans la circulation cérébrale des souris a été décrit, permettant l’étude de la micro-embolie à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo . Cette méthode a optimisé l’emprisonnement des microspheres dans le cerveau, avec plusieurs microsphères piégées dans les premiers 500 μm du cortex ipsilatéral, permettant une imagerie efficace à deux photons.

Un nombre élevé de microsphères dans la zone corticale du cerveau est crucial pour l’imagerie in vivo à deux photons. La perte de microsphères a été minimisée lors de la préparation du mélange de microsphères en recouvrant les pointes de la pipette avec 5 % de BSA ou 0,1 % de Tween20, réduisant ainsi l’adhésion des microsphères (voir Fichier Supplémentaire 1). Bien que le nombre exact de microsphères collées n’ait pas pu être quantifié, les mesures d’intensité moyenne ont montré l’effet des revêtements. De plus, Tween20 semblait empêcher le regroupement des microspheres dans le cathéter, ce qui entraînait un nombre visuellement plus élevé de microspheres singulières circulant à travers le cathéter, bien que cela ne soit pas quantifié. Cela réduit le risque d’occlusions de grands vaisseaux et la formation potentielle de grandes régions ischémiques et hypoxiques, ce qui est indésirable compte tenu de l’objectif de modéliser les embolisations microvasculaires. De plus, les souris ont montré une perte de poids moindre et se sont rétablies plus rapidement avec des poids pré-chirurgicaux lorsqu’elles ont été injectées avec un mélange de microsphère contenant de faibles concentrations de Tween20. Tween20 est un dispersantcouramment utilisé 45,46,47, par conséquent, les faibles concentrations utilisées dans cette étude ne devraient pas provoquer de toxicité ou d’effets néfastes sur l’intégrité du BBB. De plus, nos données montrent que la fuite de BBB ne se produit qu’à proximité (ou après le passage) de l’encastrement de la microsphère et non de manière systématique, sans provoquer d’augmentation significative de la couverture totale des leucocytes (voir Fichier Supplémentaire 2), ce qui soutient l’utilisation de 0,1 % de Tween20. Dans l’ensemble, l’ajout de Tween20 contribue à réduire les regroupements de microspheres et à augmenter la livraison de microsphères à la circulation cérébrale, confirmé par le nombre de microspheres dans les tranches cérébrales, et permet de voir suffisamment de microsphères pour la microscopie à deux photons. Bien que l’utilisation de Tween20 augmente le nombre de microspheres logées dans le cerveau, la variabilité de l’injection de microsphères demeure. Plusieurs facteurs peuvent contribuer à cette variation. Premièrement, la formation de thrombus dans le cathéter ou la vascularisation peut entraîner l’adhésion des microsphères au caillot. Deuxièmement, la présence de bulles d’air peut gêner une livraison fluide. Enfin, une restauration incomplète du flux sanguin dans la CCA ou l’ICA peut modifier l’hémodynamique, favorisant potentiellement l’adhésion de la microsphère à la paroi du vaisseau ou le regroupement au sein de la lumière. Malheureusement, ces écarts ne peuvent pas être détectés pendant la procédure d’injection.

Les microspheres en polystyrène sont plus denses que l’eau, ce qui entraîne une répartition inégale une fois le mélange de microsphères chargé dans le cathéter. La plupart des microspheres se déposent près de la paroi du cathéter, où la friction du fluide ralentit leur mouvement par rapport au flux central plus rapide. Cela aboutit finalement à une accumulation de microsphères dans les 20 μL finaux du cathéter. Il faut éviter l’injection de cette partie concentrée, car elle peut provoquer de grosses embolies et des événements ischémiques. Pour éviter cela, le volume du mélange de microsphères doit être préparé à deux fois le volume d’injection souhaité.

La chirurgie de l’embolie microvasculaire exige une formation et une précision approfondies. L’une des étapes les plus techniques impliquant de placer une suture autour du PPA, de l’OA et des branches latérales de l’ICA afin d’assurer une livraison précise du mélange de microsphères dans le cercle de Willis et le territoire MCA. Cette étape est compliquée par la proximité du nerf vague près du CCA, le petit diamètre des vaisseaux et l’espace chirurgical limité, ce qui rend difficile le positionnement des points sans causer des lésions nerveuses ou des lésions vasculaires.

Bien qu’un clip de vaisseau puisse être envisagé comme une alternative à la ligature temporaire de la PPA à l’aide d’une suture, il introduit des risques supplémentaires. Les clips peuvent se détacher involontairement, ce qui entraîne la réouverture des vaisseaux. De plus, utiliser un second clip au niveau du PPA en plus du clip existant sur l’ICA augmente le risque de détachement du clip ICA en raison de l’espace limité. Si cela se produit, cela provoquera une hémorragie importante et, sans intervention immédiate, peut entraîner une interruption précoce de l’expérience. Par conséquent, la fermeture du PPA à l’aide d’un clip de récipient n’est pas recommandée.

Le protocole actuel utilise un cathéter, plutôt qu’une seringue33, pour l’injection de microsphère. Cette approche offre un meilleur contrôle de la vitesse et du volume d’injection, et permet l’injection des microspheres à plus distance (par exemple, à l’intérieur d’une modalité d’imagerie telle qu’un microscope ou un scanner IRM).

Choisir l’ECA plutôt que le CCA comme point d’entrée permet au CCA de rester complètement ouvert pendant la procédure d’injection, ce qui aide à maintenir une perfusion cérébrale plus physiologique tout au long de la chirurgie. De plus, l’injection des microspheres via l’ECA au lieu du CCA présente d’autresavantages 48 : i) réduction du temps total d’opération pendant la réperfusion ; ii) diminution du risque de saignement lors de l’injection et après l’opération ; iii) avec la méthode d’entrée CCA, une sténose et une thrombose instables se forment dans la CCA après le retrait de l’aiguille49. Cela provoque des troubles du flux sanguin, ainsi qu’un risque de formation de microthrombes, qui peuvent se retrouver dans le cerveau. De plus, entrer via la CCA impliquerait un risque élevé de fermer définitivement la CCA, ce qui peut entraîner une réperfusion cérébrale sous-optimale pendant la période de survie après l’opération, aggravée par la forte variation du cercle de Willis chez lasouris 50,51

Bien que totalement optimisé, le protocole présente certaines limites. Premièrement, l’observation que les microspheres voyagent plus lentement le long des parois du cathéter et ne sont pas réparties uniformément lors de l’injection suggère que moins de microspheres sont injectées dans l’ACI que prévu. Malgré l’utilisation du Tween-20 pour réduire l’adhérence, certaines microsphères restent collées aux pointes de la pipette, au tube d’Eppendorf et au cathéter. Par conséquent, le nombre réel de microspheres injectées est probablement inférieur au calcul de 7,2 x 104 particules par souris. Néanmoins, suffisamment de microsphères atteignent la circulation cérébrale pour permettre l’imagerie par microscopie à deux photons. Le protocole d’injection et la composition du mélange sont optimisés pour les microsphères de polystyrène de 10 μm. Si les matériaux utilisés (embouts, tubes, cathéters) ou la taille des microsphères sont modifiés, la solution et la procédure d’injection doivent être réévaluées en conséquence. Deuxièmement, des études explorant la meilleure méthode pour l’occlusion des gros vaisseaux via l’occlusion intraluminale de l’ACM ont montré que l’entrée du système vasculaire par ligature permanente de l’ACE entraîne une ischémie des muscles masticateurs et déglutitives52. Cela peut entraîner une diminution de la consommation alimentaire des souris et, par conséquent, une perte de poids excessive, une altération de la fonction motrice et un déficit neurologique accru. Cependant, cette affirmation a été contredite pard’autres 48. Dans cette étude, la surveillance du poids a montré une baisse attendue après l’opération mais une récupération rapide vers les poids pré-opératoires en quelques jours, indiquant que les souris se rétablissent et mangent et boivent normalement après une ligature permanente d’ECA. Bien que le poids des animaux ait été surveillé, cela n’est qu’un indicateur indirect du bien-être de l’animal et n’exclut pas totalement des troubles fonctionnels tels que des déficits masticateurs ou moteurs locaux. Aucune évaluation directe de la récupération fonctionnelle n’a été réalisée, ce qui constitue une limitation de cette étude. Une autre étude a comparé l’entrée du système vasculaire via la CCA ou l’ECA et a montré que l’entrée via la CCA peut entraîner une altération de la réperfusion de la circulation cérébrale, concluant que la méthode d’entrée ECA estpréférée 53. Troisièmement, un placement correct et sécurisé du cathéter sans introduire de bulles d’air, de caillots sanguins ou de fuites, et sans obstruer le flux dans le CCA et l’ICA, nécessite une pratique significative. Enfin, contrairement à d’autres méthodes de micro-occlusion comme la photothrombose utilisant l’injection de Rose-Bengal22, on ne peut pas prédire où les microsphères finiront par se loger dans la circulation.

La présente étude n’inclut délibérément pas les groupes témoins négatifs (simulés) ou positifs (photothrombose), car ceux-ci n’apporteraient pas de valeur supplémentaire pour l’objectif principal. Le succès de ce modèle est défini par le nombre de microsphères logées dans la microcirculation cérébrale, en particulier dans la zone de la fenêtre crânienne, permettant une microscopie in vivo à haute résolution. Une procédure simulée ne produirait, par définition, aucune microsphère dans la zone cible et n’offrirait donc aucune comparaison pertinente pour le point d’arrivée d’imagerie in vivo . De même, l’inclusion d’un modèle de photothrombose aborderait un mécanisme physiopathologique fondamentalement différent et dépasse donc le cadre de ce travail, qui se concentre sur la caractérisation du modèle d’embolie microvasculaire plutôt que sur la comparaison des méthodologies. Des analyses histologiques plus larges des embolies et de leur effet potentiel sur la BBB ou tissu neuronal local n’ont pas été poursuivies, car l’étude visait à privilégier la visualisation 3D in vivo plutôt que la validation au niveau tissulaire.

Le protocole chirurgical détaillé pour la préparation de la fenêtre crânienne et le modèle d’embolie microvasculaire permet une étude fiable et reproductible des modifications microvasculaires associées à une embolie microvasculaire et à la survenue d’infarctus cérébraux silencieux dans tout l’hémisphère ipsilatéral. La préparation optimisée et l’injection du mélange de microsphères renforcent encore la cohérence et la validité de cette approche expérimentale.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les auteurs souhaitent exprimer leur sincère gratitude au Dr Iwan Dobbe pour le développement du logiciel Articulus , utilisé pour les reconstitutions d’images 3D in situ. Nous remercions également le Professeur Dr Nikolaus Plesnila d’avoir aimablement fourni des souris TIE2-GFP (Jackson Laboratory, stock n° 003658) utilisées pour la reproduction interne.

Cette étude a été financée par Amsterdam Neuroscience (813294 à I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (appel d’équipement 2021 et 2023 à I.M.) et la Fondation néerlandaise du cœur (03-006-2021-T019 à I.M.).

Cette recherche est également financée par la Dutch Heart Foundation et The Brain Foundation Netherlands, et est menée en collaboration avec et soutenue par la Dutch CardioVascular Alliance, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. De plus, ce travail a été financé en partie par des financements illimités de Stryker, Medtronic et Penumbra. Les sources de financement n’ont pas été impliquées dans la conception des études, le suivi, la collecte de données, les analyses statistiques, l’interprétation des résultats ou la rédaction des manuscrits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille de calibre 27 (0,1x16 mm)Terumo-Aiguille calibre 27 (Étape 2.1.2.)
Logiciel Articulus--Logiciels d’analyse 3D (Étapes 4.2.2 & 4.3.3)
Bétadine 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Bétadine/iode (Étape 1.1.8. & 2.2.10.)
C& Monomère BSun Medical7111Composant de la super glue (Étape 1.3.1.)
Lames chirurgicales en acier au carbone (n°15)Swann-Morton205Lame pour griffer le crâne (Étape 1.2.4.)
Carprofène (50 mg/ml)Zoetis-Médicaments antidouleur (étapes 1.1, 1.6, 2.2 & 2.8)
CatalyseurSun Medical7110Composant de la super glue (Étape 1.3.1.)
Cathéter (DI 0,31 DO 0,64 mm)Freudenberg228-0661Cathéter transparent (Étape 2.1.1.)
Crochet de mouchoir fabriqué par Costom--Crochet de mouchoir (Étape 2.3.4)
Pointes en coton--Embout de coton (Étapes 1.1.8, 1.2.4 & 1.5.1.)
Verre de couvertureInstruments Warner64-0724Verre de couvercle crânien (Étape 1.4.2.)
Barre de tête de souris sur mesure--Barre de tête pour le support d’imagerie (Étape 1.3.2.)  ;
Support d’imagerie souris personnalisé & nbsp ;--Support de souris d’imagerie (Étape 1.4.1. & 3.1.1.)
Cadre stéréotaxique sur mesure--Cadre stéréotaxique (Étape 1.1.7.)
Fluide de cament dentaireKulzer64707937Composant du ciment dentaire (Étape 1.3.3.)
Poudre de ciment dentaireKulzer64707945Composant du ciment dentaire (Étape 1.3.3.)
Perceuse dentaire & nbsp ;Saeshin  ; L-206Exercice (Étape 1.4.3.)
Dexaméthasone (4 mg/ml)Centrafarm-Médication préopératoire (Étape 1.1.4.)
Pinces de dissectionBraun-AesculapBD023RPinces (Étape 1.2.2. & 2.3.2.)
mèche à meule de forage PK/100,5 (0,5 mm)Sciences fines19007-05Mèche de forage (Étape 1.4.3.)
Duratears (3,5 g)Alcon-Pommade oculaire (Étape 1.1.8 & 2.2.7.)
Colle époxy (1g)Pattex9H PSMG3XColle époxy (Étape 1.5.2. & 2.1.1.)
Micropinces fines droitesOutils scientifiques de qualitéDumont #5Micro-pinces fines (Étape 2.6.6.)
FITC-Dextrane (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SSolution FITC-Dextran (Étape 2.5.2.)
Isoflurane (1000 mg/g)Laboratorios Karizoo S.A.118938Anesthésie (Étape 1.1.6. & 2.2.5.)
grand cryomicrotome d’imagerie fluorescente 3D   ;Sur mesure-grands-3D-FICS (Étape 4.3.3)
Lidocaïne (100 mg/ml)Aspen-Anesthésie locale (Étapes 1.2.3 & 2.2.10)
Microciseaux Vannas 3-3/8 PouceBraun-AesculapOC498RMicrociseaux (Étape 2.6.2)
Micro suture de serrage des pinces avec poignée rondeBraun-AesculapFD280RMicroforéceptiques (Étape 2.3.3.)
Micro suture pour attacher des pinces avec poignée ronde courbéeBraun-AesculapFD281RMicroforécepts pliés (Étape 1.5.1. & 2.3.3.)
Micro clip vasculaireBraun-AesculapFD562RClip de vaisseau (Étape 2.6.1.)
Micro-cathéter (PE 0,23114 mm diamètre 0,27432 mm)MicrolumenMicro-cathéter (Étape 2.1.1.)
Tapis chauffant de souris et sonde rectaleStoelting53800RBouillotte (Étape 1.1.2 & 2.2.2.)
Souris NG2-DsRedJackson Laboratory, Bar Harbor, États-Unis, stock n° 008241
Monolaurate de sorbitan de polyéthylène glycolSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Étape 2.5.2.)
Polystyrène FluorSpheres Blue (365/415)InvitrogenF8829Microsphères bleues (Étape 2.5.1.)
Polystyrène FluorSpheres rouge (580/605)InvitrogenF8834Microsphère rouge (Étape 2.5.1.)
Cage de récupération--Cage de récupération (Étapes 1.6.2 & Étapes 2.8.2.)
Découpe inversée de l’aiguille courbe 3/8 (12 mm) avec sutureBbraun0762067Suture (Étape 2.7.5)
Ropivaca & iuml ; Ne (2 mg/ml)--Médicaments  ; (Étape 1.1.5.)
petit Cryomicrotome d’imagerie fluorescente 3D ;   ;Sur mesurePetites-3D-FICS (Étape 4.2.2)
SpongostanEthiconMS0005Spongostan (Étape 1.4.6.)
Microscope chirurgicalEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BMicroscope pour la chirurgie (Étape 1.2. 2.1.1.)
Ciseaux chirurgicauxBraun-AesculapBC303RCiseaux chirurgicaux (Étape 1.2.2. & 2.3.2.)
Pompe à seringue (pour seringues de 1 ml)Appareil Havard70-2208Pompe à seringue de 1 ml (Étape 2.5.6.)
Fil, 100 m, et nbsp ; 4/0 1,5  ;   ;BbraunF1134035Fils de discussion 4/0.15 (Étape 2.4.3)
Souris TIE2-GFPJackson Laboratory, Bar Harbor, États-Unis, stock n° 003658
Plumer ultra purThorlabsCA6-EUAir comprimé (Étape 1.2.5.)
Transparent polymère universelSun MedicalT058EComposant de la super glue (Étape 1.3.1.)

Références

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