Imagerie cardiaque fonctionnelle chez les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie standard et de l’analyse vidéo : applications dans la recherche environnementale et biomédicale

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de microscopie optique peu coûteuse pour évaluer la morphologie et la fonction cardiaques chez les embryons de poisson-zèbre, permettant une évaluation reproductible de la cardiotoxicité pour le développement sans avoir besoin de systèmes d’imagerie avancés.

Résumé

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est largement utilisé comme modèle de vertébré dans la recherche cardiovasculaire en raison de sa similitude génétique avec l’homme, de sa transparence optique au cours du développement précoce et de sa facilité avec l’imagerie in vivo . Ce manuscrit présente un protocole standardisé et accessible pour évaluer la morphologie et la fonction cardiaques chez les embryons de poisson-zèbre à 96 h après la fécondation (hpf) à l’aide de la microscopie optique à fond clair. La méthode comprend le prélèvement d’embryons, le dépistage morphologique, l’immobilisation dans l’agarose, l’enregistrement vidéo du cœur battant et l’analyse basée sur l’image de paramètres cardiaques tels que les dimensions ventriculaires, le volume systolique, la fréquence cardiaque, la fraction d’éjection et le débit cardiaque. Les calculs sont basés sur des approximations géométriques du ventricule à l’aide de logiciels open source (par exemple, ImageJ, Zembryo Analyzer). Le protocole permet une évaluation quantitative des performances cardiaques à l’aide d’équipements largement disponibles, ce qui le rend adapté aux laboratoires disposant de ressources limitées et de dépistages à haut débit. Dans cette étude, 96 larves de poisson-zèbre hpf ont été analysées en enregistrant les battements du cœur au microscope optique. Les principaux paramètres cardiaques mesurés comprenaient les dimensions ventriculaires, qui ont été utilisées pour calculer le volume systolique et la fréquence cardiaque, déterminée en battements par minute. À partir de ceux-ci, la fraction d’éjection et le débit cardiaque ont été calculés pour évaluer la performance cardiaque globale. Des résultats représentatifs obtenus chez des embryons sains ont montré une contraction ventriculaire constante et des indices fonctionnels robustes, tandis que les embryons exposés au cadmium ont montré une morphologie cardiaque altérée et une réduction significative du débit cardiaque. Dans l’ensemble, la méthode est importante pour détecter la cardiotoxicité pour le développement et fournit une approche reproductible et non invasive pour évaluer la fonction cardiaque in vivo au cours du développement précoce du poisson-zèbre.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle de vertébré de premier plan dans la recherche cardiovasculaire en raison de son homologie génétique avec l’homme, de la fécondation externe, de la transparence optique des embryons et de son développement rapide ^1,2. Ces caractéristiques, combinées à la rentabilité et à l’évolutivité, rendent le poisson-zèbre particulièrement adapté à l’étude de la morphogenèse cardiaque précoce, des malformations cardiaques congénitales et de la cardiotoxicité développementale³. Leur pertinence est encore renforcée par la conservation élevée des gènes et des voies de signalisation qui régulent le développement cardiaque chez les espèces de vertébrés⁴. En particulier, les modèles de poisson-zèbre ont contribué de manière substantielle à la compréhension des bases génétiques et physiologiques de la formation, du remodelage et de la fonction cardiaques dans des conditions normales et pathologiques ^5,6.

Structurellement, le cœur du poisson-zèbre est composé d’un seul oreillette et d’un seul ventricule, reliés de manière linéaire, sans la cloison typique du cœur à quatre chambres des mammifères. Malgré cela, le cœur du poisson-zèbre récapitule des aspects clés de la physiologie cardiaque humaine, notamment la présence de couches endocardiques et myocardiques, un système de conduction cardiaque, une activité contractile rythmique et la régulation par des facteurs neurohormonaux ^7,8. Il est important de noter que le cœur du poisson-zèbre présente des événements morphogénétiques clés, notamment la boucle vers la droite du tube cardiaque et l’expansion et la délimitation ultérieures des cavités cardiaques, ressemblant à celles du développement embryonnaire humain⁹. De plus, le cœur du poisson-zèbre conserve de nombreuses propriétés électrophysiologiques et hémodynamiques observées chez les vertébrés supérieurs, notamment la propagation du potentiel d’action, la modulation de la contractilité et la dynamique du cycle du calcium⁷.

Compte tenu de ces similitudes, le poisson-zèbre est devenu un modèle pivot en toxicologie, en particulier pour évaluer comment l’exposition aux produits chimiques affecte le développement et la fonction cardiaques¹⁰. Cependant, l’une des principales limites dans ce domaine reste la dépendance à l’égard de techniques d’imagerie techniquement exigeantes. Les méthodes conventionnelles à haute résolution, telles que la microscopie confocale ou à feuillet de lumière, ou les raies transgéniques exprimant des marqueurs cardiaques fluorescents, bien que puissantes, sont coûteuses et nécessitent une infrastructure technique importante¹¹. Ces contraintes limitent la mise en œuvre plus large du phénotypage cardiaque à base de poisson zèbre, en particulier dans les environnements aux ressources limitées ou pour les applications nécessitant un dépistage à haut débit¹².

Il existe donc un besoin croissant d’approches méthodologiques permettant une évaluation fiable de la fonction cardiaque à l’aide d’instruments largement disponibles. La littérature existante contient des exemples de ces méthodes simplifiées, y compris l’imagerie en fond clair ou en microscopie optique combinée à des mesures manuelles ou semi-automatisées^13,14. Cependant, ces techniques ne sont pas toujours standardisées et varient souvent d’un groupe de recherche à l’autre en termes de protocole, de timing et de paramètres d’analyse d’images. Cette variabilité entrave la reproductibilité et limite la valeur comparative entre les études, en particulier dans des domaines tels que l’embryotoxicologie, la pharmacologie ou l’écotoxicologie, où les paramètres cardiovasculaires quantitatifs sont de plus en plus utilisés comme indicateurs de l’innocuité pour le développement¹⁵.

Dans ce contexte, le poisson-zèbre offre un modèle précieux pour le dépistage de la cardiotoxicité développementale in vivo. Les organismes de réglementation et les consortiums scientifiques reconnaissent de plus en plus l’importance du poisson-zèbre dans ce domaine, en particulier compte tenu de sa capacité à détecter des changements subtils dans la fonction cardiaque qui peuvent précéder des malformations structurelles ou une létalité¹⁴. L’embryon transparent permet une visualisation directe du cœur battant, ce qui permet une évaluation en direct et résolue dans le temps des performances cardiaques sans avoir besoin de procédures invasives. De plus, la simplicité de l’anatomie cardiaque du poisson-zèbre facilite la quantification de la dynamique auriculaire et ventriculaire, y compris les dimensions de la chambre et les paramètres de course, à l’aide de techniques d’imagerie de base¹⁵.

L’objectif global de la méthode décrite dans cet article est de fournir une approche accessible et reproductible pour l’évaluation morphofonctionnelle de la performance cardiaque embryonnaire du poisson-zèbre à l’aide de la microscopie optique standard. En se concentrant sur l’acquisition vidéo simple et l’analyse d’images a posteriori, la technique vise à combler le vide méthodologique entre l’imagerie haute résolution et la notation observationnelle qualitative. Ce protocole s’adapte à divers contextes de laboratoire et à divers niveaux de ressources, et s’applique particulièrement aux études toxicologiques, pharmacologiques ou génétiques axées sur l’évaluation de la fonction cardiaque.

En plus de ses avantages pratiques, le protocole contribue au domaine en offrant un flux de travail consolidé, étape par étape, qui combine les techniques couramment utilisées en un seul pipeline reproductible. Bien que des approches similaires existent dans la littérature, peu d’entre elles offrent ce niveau d’intégration avec la documentation visuelle, ce qui peut favoriser une adoption et une normalisation plus larges.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des embryons de poisson-zèbre ont été menées conformément aux directives institutionnelles de soin et d’utilisation des animaux approuvées par le comité d’éthique local. L’élevage et la manipulation d’embryons de poissons-zèbres ont été effectués conformément à la directive européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Entretien du poisson-zèbre et collecte d’embryons

1. Maintenir le poisson-zèbre adulte (Danio rerio) dans un système d’aquarium à recirculation à 28 °C± 1 °C sous un cycle de 14 h de lumière et 10 h d’obscurité.
2. Nourrissez les poissons trois fois par jour avec un aliment commercial riche en protéines en flocons ou en granulés adapté au poisson zèbre.
3. En fin d’après-midi, transférez les poissons-zèbres adultes dans des bassins d’élevage équipés d’un filet transparent pour séparer les poissons du fond du bassin. Utilisez un rapport homme-femme de 2:3, séparé pendant la nuit par un séparateur amovible.
4. Le lendemain matin, retirez le séparateur et ajoutez 50 à 100 ml d’eau froide de l’aquarium pour déclencher le frai.
5. Après la fécondation (dans les 30 à 60 minutes), retirez les poissons adultes du réservoir d’élevage pour éviter la prédation des embryons.
6. Prélevez les embryons à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et transférez-les dans des boîtes de Pétri stériles remplies de milieu embryonnaire E3.
   REMARQUE : Le milieu embryonnaire E3 est une solution saline tamponnée qui imite la composition ionique du liquide extracellulaire du poisson zèbre. Préparez le milieu E3 en dissolvant 580 mg de NaCl, 27 mg de KCl, 97 mg de CaCl₂·2H₂O et 163 mg de MgCl₂·6H₂O dans environ 800 mL d’eau distillée ultrapure. Ajustez le pH à 7,2 en utilisant 1 N de NaOH ou de HCl. Une fois que le pH est ajusté et stable, portez le volume total à 1 000 ml avec de l’eau distillée. Stérilisez la solution en la filtrant à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Ajouter 100 μL de bleu de méthylène à 1 % par litre pour prévenir la croissance fongique. Conservez le milieu E3 préparé à 4 °C et réchauffez-le à température ambiante avant utilisation.
7. Incuber les embryons à 28,5 °C dans un incubateur avec un cycle contrôlé lumière/obscurité (14 h/10 h).
   REMARQUE : Limitez le nombre d’embryons par boîte de Pétri (par exemple, 50 par boîte de 100 mm) pour éviter la surpopulation, qui peut provoquer une hypoxie et des défauts de développement.
8. Remplacez le milieu E3 tous les jours pour maintenir des conditions de développement optimales.

2. Sélection d’embryons morphologiquement normaux

1. Environ 6 h après la fécondation (hpf ; temps écoulé depuis la fécondation), transférez les embryons fécondés dans une boîte de Pétri propre contenant du milieu E3 frais.
2. Examinez les embryons au microscope stéréoscopique à un grossissement de 40x.
3. Jetez tous les embryons présentant des signes d’anomalie du développement, y compris :
   1. Embryons coagulés : Identifient par leur aspect opaque ou blanc, leur texture granuleuse et l’absence de structures internes distinctes. La coagulation est un signe de non-viabilité et se produit généralement dans les premières heures suivant la fécondation.
   2. Retard de développement : Exclure les embryons qui n’ont pas atteint le stade morphologique attendu (p. ex., absence d’épibolie ou arrangement cellulaire irrégulier), ce qui suggère une viabilité altérée.
   3. Anomalies du sac vitellin : Recherchez des sacs vitellins rompus, irréguliers ou asymétriques qui peuvent indiquer un développement défectueux ou un déséquilibre osmotique.
   4. Malformations externes : Exclure les embryons avec des axes corporels tordus, une distribution irrégulière de la masse cellulaire ou des formes anormales du chorion.
   5. Mauvaise intégrité du chorion : Évitez d’utiliser les embryons dont le chorion est affaissé, ratatiné ou rompu, car ils peuvent être soumis à un stress mécanique ou osmotique.
4. Ne conservez que les embryons qui répondent à tous les critères suivants : (1) Forme du corps transparente et symétrique, (2) Progression épibolique uniforme avec stratification cellulaire lisse, (3) Blastoderme clairement visible et chorion sphérique intact.
   REMARQUE : À 6 hpf, un embryon de poisson-zèbre morphologiquement normal est en forme de dôme avec un blastoderme clairement défini enveloppant le haut du jaune. Le cytoplasme doit être réparti uniformément, sans taches granulaires et sans signes de fragmentation ou d’agglutination.

3. Imagerie cardiaque par microscopie optique

1. À 96 hpf, montez les embryons individuellement dans des boîtes de Pétri à fond de verre de 35 mm remplies de milieu E3.
2. Préparez de l’agarose à faible point de fusion à 1,2 % dans un milieu E3 et préchauffez à 37-38 °C. Maintenez la température à l’aide d’un bloc de chaleur ou d’un bain-marie.
3. Incorporez chaque embryon dans de l’agarose et orientez-le doucement latéralement à l’aide de fines pinces avant que l’agarose ne se solidifie.
   REMARQUE : Assurez-vous que le cœur est clairement visible et tourné latéralement, avec l’oreillette et le ventricule dans le même plan focal.
4. Utilisez un microscope à lumière inversée équipé d’un appareil photo numérique pour enregistrer des vidéos haute résolution de 30 secondes axées spécifiquement sur la région cardiaque des embryons de poisson-zèbre. Capturez des vidéos à un grossissement de 40× ou 100× pour assurer une visualisation claire des structures cardiaques et des battements cardiaques.
   1. Enregistrez les vidéos à une fréquence d’images de 30 images par seconde (ips) dans des formats non compressés ou peu compressés (par exemple, AVI ou MOV) afin de préserver la qualité de l’image et de permettre une analyse précise de la dynamique des mouvements cardiaques. Cette configuration permet une évaluation détaillée des paramètres fonctionnels tels que la fréquence cardiaque, le rythme de contraction et la morphologie de la chambre.

4. Analyse d’images et mesure de la fonction cardiaque

1. Mesures manuelles dans ImageJ
   1. Importez des vidéos. Ouvrez des vidéos dans ImageJ à l’aide de l’option Fichier > Importer > AVI. Si nécessaire, convertissez la vidéo en une pile d’images via Piles de > d’images > Convertir les images en pile.
   2. Calibrez l’échelle de mesure. Utilisez l’option Analyser > Définir l’échelle, saisissez le diamètre de champ connu (par exemple, 4 mm pour un objectif de 10×) et activez l’option Global pour appliquer l’échelle à toutes les mesures.
   3. Définissez les régions d’intérêt (ROI). Utilisez les outils ROI (ligne, polygone, rectangle) pour marquer les axes ventriculaires longs et courts pendant la fin de la systole et la fin de la diastole (Figure 1). Gérez les retours sur investissement via des outils d’analyse > > ROI Manager.
2. Mesurer les diamètres et les aires pour le calcul des paramètres fonctionnels (Fichier supplémentaire 1)
   1. Déterminez l’aire de la surface ventriculaire (en utilisant l’approximation de l’ellipse) à l’aide de l’équation 1 :
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      Où DL = diamètre long, DS = diamètre court.
   2. Estimer le volume ventriculaire à l’ED et à l’ES à l’aide de la formule du volume ellipsoïde (équation 2)
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
   3. Calculez le changement fractionnaire de surface (FAC) et le raccourcissement fractionnel (FS) à l’aide de l’équation 3 et de l’équation 4 :
      FAC ( %) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      PIEDS carrés ( %) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      Où VAD = zone ventriculaire à l’urgence ; EVA = région ventriculaire au niveau de l’ES ; DDL = axe long à ED ; DSS = axe court à ES.
   4. Déterminez le volume systolique (SV) à l’aide de l’équation 5 :
      SV = VVD - VVS (5)
   5. Calculer la fraction d’éjection (FE) à l’aide de l’équation 6 :
      FE ( %) = (SV / VVD) × 100 (6)
3. Analyse automatisée dans ZembryoAnalyzer
   1. Lancez et chargez la vidéo capturée. Ouvrez ZembryoAnalyzer (disponible à l’adresse : https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser), et utilisez Fichier > Ouvrir la vidéo pour importer la vidéo souhaitée.
   2. Effectuez la détection automatique de la région cardiaque. Cliquez sur le bouton Détecter le cœur pour permettre au logiciel de localiser automatiquement la région d’intérêt (ROI) en fonction des fluctuations de luminosité entre les images vidéo. Ajustez le retour sur investissement manuellement si nécessaire à l’aide d’outils rectangles, elliptiques ou polygonaux.
   3. Effectuez l’estimation automatique de la fréquence cardiaque. Laissez le logiciel analyser les changements de luminosité dans le cadre du retour sur investissement détecté. La fréquence cardiaque est calculée en identifiant des pics d’intensité périodiques. L’algorithme applique un filtrage de seuil pour supprimer le bruit et les faux positifs, garantissant ainsi une détection précise des battements.
   4. Exportez les résultats. Exportez les données de fréquence cardiaque et les graphiques d’intensité correspondants à l’aide de l’option Exporter > PDF ou Exporter > Excel. Si vous le souhaitez, enregistrez les données brutes au format CSV ou JSON pour le traitement statistique en aval.
4. Calculez le débit cardiaque (CO) à l’aide de l’équation 7 :
   CO = SV × HR (7)

5. Évaluation de l’applicabilité du protocole dans les essais de cardiotoxicité utilisant des substances toxiques

1. Peser le chlorure de cadmium et préparer une solution de travail en la dissolvant directement dans le milieu E3 jusqu’à une concentration finale de 3 mg/L.
2. Transférez les embryons dans des boîtes de Pétri contenant la solution de cadmium 24 h après la fécondation (hpf).
3. Incuber les embryons dans la solution de cadmium jusqu’à 96 hpf à 28 °C± 1 °C avec un cycle de 14 h de lumière / 10 h d’obscurité.
4. Remplacez la solution de cadmium tous les jours pour maintenir une exposition constante.
5. À 96 hpf, enregistrer des vidéos cardiaques haute résolution, comme décrit précédemment, des embryons pour la mesure et l’analyse ultérieures des paramètres de la fonction cardiaque.
   REMARQUE : Utilisez ce protocole d’exposition au cadmium pour simuler la toxicité cardiaque pour le développement chez les embryons de poisson-zèbre, comme décrit dans une étude précédente¹⁶.

6. Gestion des données et réplications

1. Enregistrez toutes les mesures dans des feuilles de calcul structurées. Inclure l’identification de l’embryon, le groupe de traitement et tous les paramètres calculés.
2. Assurez-vous qu’au moins 20 à 30 embryons par groupe sont analysés pour une fiabilité statistique.
   REMARQUE : Les enregistrements vidéo de la région cardiaque peuvent être stockés et analysés ultérieurement sans compromettre la précision des mesures morphométriques ou fonctionnelles. Dans nos comparaisons internes, les résultats des analyses immédiates et différées étaient cohérents pour tous les paramètres cardiaques clés, soutenant la reproductibilité de l’évaluation vidéo différée.

Résultats

Ce protocole permet une analyse quantitative du développement cardiaque du poisson-zèbre 96 h après la fécondation (hpf), y compris des paramètres structurels et fonctionnels tels que la taille du ventricule, la contractilité, le volume systolique et la fraction d’éjection.

La figure 2 montre des images représentatives en fond clair du ventricule du poisson-zèbre à la fin de la diastole (DE) et à la fin de la systole (ES), ainsi q...

Discussion

L’une des étapes importantes de ce protocole est l’identification et la sélection précises d’embryons morphologiquement normaux 6 heures après la fécondation (hpf). Les embryons qui présentent des signes de coagulation, de retard de développement ou d’anomalies structurelles peuvent compromettre considérablement la cohérence et l’interprétabilité des mesures cardiovasculaires. L’ablation précoce d’embryons non viables ou malformés garantit une base de référence fiable pour évaluer le dév...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 & micro ; Filtre à membrane m	Millipore	SLGP033RS	0,22 & micro ; Filtre à membrane m
Solution HCl 1 N	Sigma-Aldrich	320331	Solution d’acide chlorhydrique pour l’ajustement du pH
Solution NaOH 1 N	Sigma-Aldrich	72068	Solution d’hydroxyde de sodium pour l’ajustement du pH
Poisson-zèbre adulte (Danio rerio)	Établissement local d’élevage	N/A	Organisme modèle
Aquariums d’élevage avec maille	/	/	Séparation des adultes pour la ponte
CaCl ?· ; 2H ? O	Sigma-Aldrich	C5670	Chlorure de calcium dihydraté, grade réactif
Chlorure de cadmium	Sigma-Aldrich	202908	Substance toxique utilisée pour l’exposition à 3 mg/L
Alimentation commerciale pour poissons-zèbres	Mini Gran, Nutri Pet, Gornji Milanovac	/	Aliments en flocons ou granulaires riches en protéines, adaptés aux poissons-zèbres
Appareil photo numérique (microscope)	Hamamatsu Photonique	ORCA-Flash4.0 V3	Caméra pour enregistrement vidéo à 30 fps
Bloc chauffant	Eppendorf	5382000010	Dispositif de chauffage à température contrôlée
Logiciel ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/	Logiciels de traitement d’image open source
Microscope à lumière inversée	Nikon	Ti2-E	Microscope avec appareil photo numérique, 40 et plus de fois ; et 100 et plus de fois ; Objectifs
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	Chlorure de potassium, qualité réactif
Agarose à point de fusion bas (1,2 %)	Thermo Fisher Scientific	16520050	Pour l’inclusion des embryons
Bleu de méthylène (1 %)	Sigma-Aldrich	M9140	Agent antifongique ajouté au milieu E3
MgCl ?· ; 6H ? O	Sigma-Aldrich	M9272	Chlorure de magnésium hexahydraté, qualité réactif
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Chlorure de sodium, qualité réactif
Plaques de Petri stériles (100 mm)	Corning	430167	Plaques de Petri en plastique pour la culture d’embryons
Plaques de Petri stériles (35 mm)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Plaques de Petri à fond de verre pour monter des embryons
Eau distillée ultrapure	Millipore	Référence Milli-Q	Eau pour la préparation de la solution
Logiciel ZembryoAnalyzer	GitHub (Darko Puflovic)	https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser	Logiciel d’analyse de la fonction cardiaque