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Article de méthode

In vivo Enregistrement par patch-clamp de cellules entières de neurones peptidergiques hypothalamiques chez des larves de poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/68943

⸱

22 août 2025

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Shanghai University, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole d’enregistrement in vivo de l’activité électrique des neurones peptidergiques hypothalamiques à l’aide de l’électrophysiologie patch-clamp de cellules entières chez des larves intactes de poisson-zèbre.

Résumé

L’hypothalamus est une ancienne région du cerveau qui régule divers aspects de la physiologie et du comportement, notamment le sommeil et l’éveil, l’appétit, l’homéostasie énergétique, l’anxiété, la dépression et l’interaction sociale. Des populations neuronales spécifiques de l’hypothalamus exercent leurs effets via la libération de neurotransmetteurs et de neuropeptides. L’enregistrement par patch-clamp sur cellule entière est une approche indispensable pour étudier le rôle de ces facteurs dans la transmission synaptique et le fonctionnement du cerveau. Cependant, il est difficile d’accéder aux neurones hypothalamiques pour les enregistrements électrophysiologiques chez les mammifères intacts en raison de leur emplacement profond dans le cerveau. Par conséquent, notre compréhension des propriétés intrinsèques et des fonctions physiologiques des neurones hypothalamiques est limitée. La larve de poisson-zèbre est un modèle alternatif utile pour étudier les neurones hypothalamiques en raison de son cerveau vertébré transparent et petit, mais bien conservé. Ici, nous présentons un protocole pour l’enregistrement in vivo de neurones hypothalamiques dans des larves de poisson-zèbre intactes. En utilisant cette technique, nous pouvons enregistrer à partir de neurones peptidergiques dans l’hypothalamus, examiner les réponses de ces neurones aux stimuli sensoriels et explorer leurs effets sur les neurones en aval. Cette technique expérimentale fournit donc une approche utile pour étudier les fonctions physiologiques des neurones neuropeptidergiques hypothalamiques chez des animaux intacts.

Introduction

En tant que modèle animal vertébré populaire, le poisson-zèbre (Danio rerio) est largement utilisé dans la recherche en neurosciences et présente plusieurs avantages1. Leur complément de gènes et leur architecture cérébrale sont très conservés chez les mammifères, et ils ont un riche répertoire comportemental, ce qui les rend utiles pour étudier les mécanismes génétiques et neuronaux qui sous-tendent des comportements tels que le sommeil, l’anxiété, la dépression et l’interaction sociale.. Leur petite taille et leurs faibles coûts d’entretien les rendent idéaux pour le criblage à haut débit de gènes ou de médicaments visant à traiter les maladies neuropsychiatriques 7,8. Enfin, la transparence optique des larves de poisson-zèbre, combinée à des techniques avancées de microscope à feuillet de lumière et à la disponibilité de plusieurs rapporteurs fluorescents, les rend particulièrement bien adaptées à la surveillance de l’activité neuronale et astrogliale à une résolution cellulaire dans l’ensemble du cerveau 9,10,11.

L’hypothalamus du poisson zèbre, situé profondément dans le diencéphale ventral, est conservé anatomiquement et moléculairement avec l’hypothalamus des mammifères, mais il est 2 à 3 ordres de grandeur plus petit, ce qui permet d’obtenir un système plus simple pour étudier la fonction de l’hypothalamus12. Les neurones hypothalamiques forment des connexions synaptiques étendues avec plusieurs régions du cerveau, notamment le thalamus, le tronc cérébral, l’hypophyse et le télencéphale, à travers lesquelles ils régulent l’homéostasie physiologique, la signalisation neuroendocrinienne et les comportements autonomes13,14. Une telle modulation du comportement et de la physiologie repose en grande partie sur les neuropeptides, qui sont des acides aminés à chaîne courte qui agissent en se liant aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)15. Contrairement à la libération rapide de neurotransmetteurs d’acides aminés au niveau de la synapse, les neuropeptides peuvent se diffuser sur de plus longues distances via la transmission de volume et médier des effets modulateurs lents sur la transmission synaptique et l’excitabilité neuronale16.

Des études récentes chez le poisson-zèbre ont révélé diverses fonctions des neuropeptides hypothalamiques grâce à des approches multidisciplinaires telles que l’imagerie calcique du cerveau entier, le séquençage de l’ARN unicellulaire, l’analyse comportementale à haut débit et la cartographie des circuits neuronaux 4,12,17,18. Ces techniques émergentes ont transformé notre capacité à caractériser la diversité cellulaire à grande échelle, à faire le lien entre les mécanismes moléculaires et les fonctions neuropeptidiques au niveau du circuit et à cartographier les circuits neuronaux qui sous-tendent des comportements spécifiques19,20. Cependant, ces approches restent limitées dans leur capacité à résoudre la dynamique physiologique rapide et les mécanismes synaptiques précis qui sous-tendent la fonction neuropeptidique.

La technique du patch-clamp, développée par Neher et Sakmann, reste la référence pour l’étude de la physiologie neuronale en raison de sa résolution temporelle inégalée et de sa précision biophysique, permettant de mesurer directement les fluctuations du potentiel membranaire, les courants synaptiques et la dynamique des canaux ioniques21,22. Cette technique est particulièrement précieuse pour l’étude des cellules neuropeptidergiques, dont les modèles d’éclatement caractéristiques et les influences neuromodulatrices nécessitent une mesure électrophysiologique directe pour comprendre pleinement leurs rôles dans le comportement et l’homéostasie 15,16,23.

Ici, nous avons développé un protocole optimisé qui permet des enregistrements fiables de cellules entières de neurones peptidergiques hypothalamiques de poisson-zèbre, malgré les défis techniques posés par la localisation anatomique profonde de ces neurones. Cette méthodologie fournit un accès direct à l’activité électrique de ces cellules, permettant d’étudier en détail leurs réponses aux stimuli visuels et auditifs (Figure 1). En intégrant l’électrophysiologie patch-clamp à l’optogénétique, nous pouvons caractériser précisément la connectivité fonctionnelle entre les circuits hypothalamiques et les neurones en aval (Figure 2 et Figure 3), facilitant ainsi l’étude des neuropeptides dans l’homéostasie physiologique et le contrôle comportemental. Cette approche comble une lacune critique dans la recherche en neurosciences, permettant l’exploration mécaniste de la fonction des neurones hypothalamiques aux niveaux biophysique, cellulaire et des circuits simultanément.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par l’Institutional Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Shanghai (protocole animal YS 2025-169) et l’IACUC de l’Institut de technologie de Californie (protocole animal 1836). Des poissons-zèbres de 5 à 7 jours après la fécondation (dpf) ont été nourris avec des rotifères et utilisés pour des expériences. À ce stade de développement, le sexe n’est pas déterminé. Des poissons-zèbres adultes sur un fond de nacre [mitfa(w2/w2)]24 ont été utilisés pour la reproduction.

1. Solutions et recettes

  1. Préparez un milieu E3 contenant 5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2 et 0,33 mM de MgSO4. Ajustez la solution par NaOH à pH 7,2. Conserver à température ambiante pour une utilisation dans un délai de 1 mois.
  2. Préparez la solution extracellulaire contenant 134 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 2,1 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2, 10 mM d’HEPES et 10 mM de glucose. L’osmolalité de la solution extracellulaire est de ~290 mOsmol L-1. Ajustez la solution avec du NaOH à pH 7,8. Conserver à 4 °C pour une utilisation dans un délai de 1 mois.
  3. Préparez la solution intracellulaire contenant 100 mM de K-gluconate, 10 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GFP, 10 mM d’HEPES et 10 mM d’EGTA. L’osmolalité de la solution intracellulaire est de ~280 mOsmol L-1. Ajustez la solution par KOH à pH 7,4. Aliquote 100 μL de la solution interne dans des tubes à microfuge et stockage à -20 °C pour une utilisation dans un délai de 1 an.
    REMARQUE : L’ajout de Mg-ATP et de Na-GTP est recommandé pour des enregistrements prolongés et stables. La solution intracellulaire doit être filtrée à travers une membrane de 0,22 μm, qui élimine les particules et les contaminants microbiens qui pourraient compromettre la formation du joint ou entraîner le colmatage des pipettes.
  4. α-bungarotoxine : Dissoudre 1 mg de α-bungarotoxine dans 1 mL de milieu E3 jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL. Aliquote 20 μL de la solution dans des tubes microfuges et stockage à -20 °C pour une utilisation dans un délai de 1 an.
  5. Agarose à bas point de fusion : Dissoudre 0,75 g d’agarose dans 50 mL de milieu E3 dans une bouteille en verre jusqu’à une concentration finale de 1,5 %. Faites chauffer le mélange dans un four à micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit fondue et que la solution apparaisse claire et homogène. Maintenir l’agarose fondue à 42-45 °C dans un bain-marie pour une utilisation dans un délai de 1 mois.

2. Préparation et dissection du poisson-zèbre

  1. Placez des poissons adultes mâles et femelles contenant un transgène souhaité, par exemple, Tg(hcrt :RFP) fish 25, dans un bassin d’accouplement et séparez-les par un séparateur transparent pendant la nuit. Le matin du deuxième jour, retirez le séparateur pour permettre à la race des poissons. Récupérez les embryons fécondés au fond de l’aquarium et retournez les poissons adultes dans leurs aquariums d’origine en début d’après-midi.
  2. Élevez les embryons dans une boîte de Pétri de 9 cm de diamètre avec un milieu E3 contenant 0,0005 % de bleu de méthylène. Placez les embryons dans un incubateur à 28,5 °C avec des cycles lumière/obscurité de 14:10 h. Changez la solution E3 tous les jours.
    REMARQUE : Le bleu de méthylène dans le milieu E3 est utilisé pour prévenir la croissance fongique jusqu’à 3 jours après la fécondation (dpf), mais il est remplacé par le milieu E3 seul à 3 dpf, car le bleu de méthylène peut affecter le métabolisme cellulaire et la fonction mitochondriale aux stades ultérieurs du développement26.
  3. Criblez les larves de poissons sous un stéréomicroscope à épifluorescence avec un grossissement maximal (~115x) à partir d’environ 3 dpf. Placez les poissons dans des gouttelettes d’eau (plus grandes que leur taille) pour faciliter le tri. Pour les poissons de plus de 3 dpf, anesthésier le poisson à l’aide de 3 mL de milieu E3 contenant 0,01 % de tricaïne pour supprimer l’activité locomotrice spontanée. Recueillir les larves avec une expression fluorophore brillante dans l’hypothalamus.
    REMARQUE : Portez des gants en nitrile, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire lorsque vous manipulez de la tricaïne. L’excès de tricaïne doit être éliminé comme déchet chimique selon les protocoles animaux.
  4. Après le criblage, lavez immédiatement la tricaïne à l’aide du milieu E3 et remettez ces larves dans l’incubateur. Ajouter ~5 mL de solution d’alimentation contenant des rotifères dans la boîte de Pétri à partir de 5 dpf jusqu’au jour des expériences. Changez la solution E3 et nourrissez les poissons avec des rotifères tous les jours.
  5. À 5-7 dpf, collecter des larves de poissons qui semblent en bonne santé et qui montrent une locomotion active. Transférez-les dans une petite boîte de Pétri (3,5 cm de diamètre) à l’aide d’une pipette en verre.
  6. Retirez l’eau autour du poisson et ajoutez 20 μL de 1 mg/mL de α-bungarotoxine sur le poisson pendant ~30 s. Ensuite, lavez le médicament en ajoutant ~3 ml de milieu E3 dans la boîte de Pétri.
    REMARQUE : Portez des gants en nitrile, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire lors de la manipulation de la α-bungarotoxine. L’excès de α-bungarotoxine doit être éliminé comme déchet chimique selon les protocoles animaux.
  7. Recouvrez la boîte de Pétri de papier d’aluminium pour garder le poisson dans l’obscurité et devenir progressivement paralysé.
    REMARQUE : α-bungarotoxine est un bloqueur des récepteurs de l’acétylcholine qui agit spécifiquement sur la jonction neuromusculaire, paralysant ainsi le poisson sans affecter le système nerveux. Le poisson peut encore ressentir les stimuli environnementaux et la fonction cérébrale est normale après la paralysie 9,27.
  8. Vérifiez la paralysie après ~15 minutes à l’aide d’un stéréomicroscope et sélectionnez un poisson paralysé qui présente un rythme cardiaque normal et une circulation sanguine robuste dans le cerveau et le corps.
  9. Transférez le poisson dans une chambre d’enregistrement sur mesure, qui est une boîte de Pétri de 35 mm avec un trou de 10 mm de diamètre au centre et une lamelle en verre de 20 x 20 mm collée au fond pour couvrir le trou. Retirez l’eau et ajoutez ~200 μL d’agarose à bas point de fusion à 1,5 %.
  10. Positionnez le poisson côté dorsal vers le haut dans l’agarose à l’aide d’une pince (Dumont #5). Lorsque l’agarose s’est complètement solidifiée, ajoutez la solution extracellulaire pour couvrir l’agarose. Il faut 5 à 10 minutes pour que l’agarose se solidifie complètement.
  11. Coupez et retirez l’agarose au-dessus de la tête du poisson à l’aide d’un micro-couteau. Ensuite, faites une petite incision dans la peau au-dessus du ventricule cérébral entre le tectum optique et le cervelet à l’aide d’une micropipette en verre avec une ouverture de pointe de ~1 μm pour la pipette avançant dans le cerveau à l’étape suivante.
  12. Retirez les débris de tissu ou les caillots sanguins autour du trou de dissection à l’aide d’une pipette en verre brisée.

3 Enregistrement par patch-clamp à cellules entières

  1. Le jour de l’expérience, préparer des micropipettes enregistreuses avec une ouverture de pointe de ~1 μm et une résistance de ~20 MΩ à l’aide de capillaires en borosilicate. Conservez les micropipettes tirées dans un récipient et utilisez-les le même jour pour éviter toute contamination.
  2. Mettez sous tension l’ordinateur, la caméra CCD, le moniteur, l’amplificateur, le numériseur, le micromanipulateur et les logiciels associés. L’amplificateur et le numériseur doivent être allumés avant d’ouvrir le logiciel.
  3. Déplacez soigneusement le poisson vers un montage électrophysiologique où l’expérience de pince à patch sera effectuée.
  4. Perfuser le poisson avec une solution extracellulaire oxygénée à ~2 mL par minute à l’aide d’une pompe péristaltique pour maintenir la santé du poisson et la viabilité cellulaire.
  5. Déplacez la chambre d’enregistrement à l’aide d’un traducteur X-Y (sur mesure) pour centrer le poisson dans le champ visuel d’un objectif 4x sous un microscope vertical.
  6. Passez à un objectif 60x et déplacez le traducteur pour visualiser la région cible de l’hypothalamus. Ajustez le contraste interférentiel différentiel (DIC) de Nomarski avec une lumière infrarouge de 900 nm pour obtenir la meilleure visualisation des cellules.
  7. Allumez la source lumineuse d’excitation de fluorescence (par exemple, une ampoule au mercure) et utilisez-la pour visualiser les neurones fluorescents dans l’hypothalamus. Localisez les neurones sains qui présentent une fluorescence brillante et des limites cellulaires claires, ce qui indique souvent une bonne santé cellulaire et facilite les enregistrements électrophysiologiques de haute qualité.
  8. Remplissez lentement une micropipette d’enregistrement avec une solution intracellulaire à l’aide d’une pointe de microchargeur fine.
  9. Fixez l’électrode sur la tête de l’amplificateur et serrez le bouton pour éviter les fuites d’air. Appliquez une légère pression positive (~150-200 mBar) à l’intérieur de la micropipette à travers le tube relié au support, ce qui empêche les contaminants à l’interface air-solution de pénétrer dans la pointe de l’électrode.
  10. Abaissez la micropipette dans la solution du bain à l’aide d’un micromanipulateur en mode rapide et positionnez la pointe de la micropipette au-dessus du trou disséqué sous l’objectif 4x.
  11. Passez le micromanipulateur en mode lent et changez l’objectif pour le 60x. Avancez lentement la pointe de la pipette en verre à travers le trou de dissection et le long du ventricule entre les deux hémisphères tectal.
  12. Amenez la pointe de la pipette orthogonalement vers une cellule fluorescente cible visualisée à l’aide de la CID et de la fluorescence. Une fois que la pointe de la pipette touche la membrane cellulaire, une petite indentation se forme.
    REMARQUE : Pour visualiser les tissus profonds comme l’hypothalamus, l’IR-DIC de 900 nm est utilisé avec des filtres polarisants et analyseurs qui sont finement ajustés pour l’IR-DIC.
  13. Le relâchement rapide de la pression positive lorsque la pointe touche une cellule permet à la cellule de former un joint avec la pipette. En même temps, appliquez une brève pression négative via le tube relié au support.
    REMARQUE : La valeur de la résistance sur le logiciel doit rapidement augmenter jusqu’à > 1 GΩ, indiquant qu’un joint à haute résistance est formé. Lorsque la cellule hypothalamique fluorescente est enregistrée avec succès, il doit y avoir une membrane cellulaire fluorescente à l’extrémité de la micropipette d’enregistrement.
  14. Clampez la cellule à -60 mV et attendez 1 à 2 min jusqu’à ce que la ligne de base et la résistance d’accès soient stables. Appliquez une brève impulsion électrique ou une légère aspiration par la bouche pour rompre la membrane cellulaire sous l’extrémité de la micropipette.
  15. Compensez le courant capacitif et la résistance série dans une configuration logicielle électrophysiologique. Ignorez les données si la résistance série est supérieure à 100 MΩ et varie > 20 % dans les enregistrements.
  16. Appliquer une impulsion de tension de 1 s à 10 mV en mode tension pour surveiller la résistance intrinsèque de la membrane avant et après les expériences. Jetez la cellule si la résistance de la membrane ou le potentiel de la membrane varie beaucoup.
  17. Enregistrez d’abord en mode pince de tension (VC) lorsque la cellule est maintenue à une valeur négative. Après avoir établi un enregistrement stable, passez en mode pince de courant (IC) si nécessaire.
    REMARQUE : Le giga-seal peut ne pas être stable peu de temps après la rupture, de sorte que le fait de fixer la cellule à -60 mV en mode VC pendant quelques minutes au début d’une expérience peut fournir de meilleures conditions cellulaires.
  18. Traitez l’analyse des données électrophysiologiques et la détection des pointes hors ligne à l’aide de MATLAB une fois l’expérience terminée.
  19. Après les expériences, euthanasier les larves de poissons à l’aide d’hypochlorite de sodium à 1,5 % (NaClO) et les éliminer conformément aux protocoles de soins aux animaux de l’établissement.

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Résultats

Dans ce manuscrit, nous présentons une technique améliorée d’enregistrement in vivo de cellules entières pour étudier les neurones hypothalamiques chez le poisson-zèbre intact, en nous concentrant particulièrement sur les neurones d’hypocrétine (Hcrt).

Comme présenté dans la figure 1, notre méthodologie permet des enregistrements électrophysiologiques directs de ces neurones profondément dans le cerveau chez un animal intact (Figure 1...

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Discussion

Le protocole décrit ici permet d’enregistrer par patch-clamp les neurones peptidergiques dans l’hypothalamus larvaire du poisson-zèbre, l’une des régions cérébrales les plus profondes et les plus difficiles d’accès sur le plan technique. En raison de la difficulté inhérente à cette préparation, les enregistrements réussis à l’aide d’un patch-clamp nécessitent une attention méticuleuse à quelques paramètres critiques, à savoir la qualité de la pipette, la technique d’approche, la pureté d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts et rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Daniel Wagenaar pour son aide dans la conception de dispositifs pour les expériences optogénétiques. Ce travail a été soutenu par les subventions R35 NS122172 et R34 NS126800 des National Institutes of Health à D.A.P, et le Shanghai Overseas Talents Introduction Program à R.Z.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AmplificateurAxone700 milliards
Capillaires en verre borosilicatéSutterRéf. BF100-58-10
Caméra CCDDage-MTIIR-1000
Ordinateurs pour les enregistrements électrophysiologiquesVallonPrécision 3660
DigidataAxone1440A
Faraday CageSur mesure
ForcepsF.S.T.Dumont #5
IncubateurLonroyGZP-150B
Filtre à membraneMillipore SigmaSLGV004SL
Micro couteauF.S.T.10318-14
ObjectifOlympeMplan 5X/0.1 ; UMPlanFI/IR 60X/0.9w
Pompe péristaltiquePlusRéf. BT100-1L
Porte-pipetteNarishigeH-7pour la dissection
ExtracteurSutter InstrumentP-97
Stéréomicroscope pour le dépistage et la dissection par fluorescenceOlympeSZX16
StimulateurA.M.P.IMaster8
Micromanipulateur tridimensionnelSutter InstrumentMPC-325
Microscope DIC infrarouge droitOlympeBX51WI
Table d’isolation des vibrationsTMC61-541-06
Moniteur vidéoSUNSPORéf. SP-717
Bain-marieYihengLe HWS-12
Traducteur X-YSur mesure

Références

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