Le protocole décrit la procédure opérationnelle standard pour tester des matériaux potentiellement biodégradables, synthétiques et naturels, dans des conditions aérobies à l’aide d’un inoculum naturel d’eau de mer et d’un système automatisé de respirométrie en boucle fermée.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Essai de biodégradation aérobie de matériaux à l’aide d’un inoculum naturel d’eau de mer marine et d’un respiromètre en boucle fermée
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’évaluation correcte des matériaux biodégradables dépend de l’adoption généralisée de méthodes d’essai standard. Bien que de telles méthodes existent, la capacité d’analyse reste limitée, limitée par le coût et le temps nécessaire à la création de nouveaux laboratoires. Ce protocole de dépistage modifié est basé sur la norme ASTM International D6691-24a, Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium or Natural Sea Water Inoculum. Il évalue la biodégradation des matériaux dans un environnement marin, en comparant les résultats aux contrôles positifs et négatifs, et utilise un inoculum naturel d’eau de mer complété par de l’ammonium et du phosphate pour éviter la limitation des nutriments. Les matériaux sont exposés à cette eau de mer enrichie en nutriments et incubés à 30 °C. Un respiromètre Micro-Oxymax mesure la production de biogaz (dioxyde de carbone, CO2) au cours du temps. Le degré de minéralisation (biodégradation) est déterminé en calculant la proportion de carbone dérivé de la matière convertie en carbone biogaz. Le pourcentage de production de CO2 , exprimé en fraction de la teneur en carbone mesurée ou théorique, est rapporté en fonction du temps. Le système de respirométrie en boucle fermée accueille une gamme de cuves de réacteur, préparées en trois exemplaires pour chaque matériau, un témoin négatif (inoculum d’eau de mer uniquement) et un témoin positif (cellulose par chromatographie sur couche mince). Cette méthode est importante pour l’évaluation des matériaux dans l’environnement marin et vise à prévenir la pollution mondiale.
Introduction
Les déchets plastiques constituent une menace pour les écosystèmes marins et la santé humaine1. L’inquiétude croissante suscitée par la pollution plastique, ainsi que par les débris marins provenant de tous les matériaux présents dans l’océan, souligne la nécessité de solutions durables, telles qu’une meilleure gestion des déchets en fin de vie et des matériaux biodégradables qui se biodégradent facilement dans l’environnement marin. Contrairement aux plastiques synthétiques traditionnels, qui persistent pendant des décennies, voire des siècles, et génèrent des microplastiques qui s’accumulent dans les réseaux trophiques 2,3,4, les matériaux biodégradables, composants organiques du carbone, peuvent être métabolisés en CO2 et en méthane (CH4), ou assimilés en biomasse microbienne5. Il est donc essentiel de comprendre la biodégradation des matériaux dans l’eau de mer pour quantifier et atténuer les impacts environnementaux des débris marins.
La biodégradation dans l’environnement marin est contrôlée par l’interaction de variables spatio-temporelles, notamment la disponibilité de la lumière et des nutriments, la pression, la température, la composition des espèces microbiennes, la nature physicochimique et la structure du polymère, qui déterminent toutes le taux, le degré et le mécanisme de dégradation6. Ces variables représentent un défi important pour les études de biodégradation en laboratoire simulant les environnements marins. Cette procédure opérationnelle standard (SOP) utilise de l’eau de mer naturelle comme inoculum, capturant la communauté microbienne in situ présente, et enregistre les variables pertinentes, notamment les nutriments dissous dans l’eau de mer, le carbone et l’azote particulaires, la chlorophylle, la salinité, le pH et la température. Cette approche contrôlée en laboratoire optimise les conditions de promotion de la minéralisation et permet des mesures directes de la biodégradation qui ne sont pas réalisables in situ. La norme ASTM International D6691-24a, Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium or Natural Sea Water Inoculum (ci-après la norme ASTM D6691), et la présente POS ont été élaborées en tant qu’outil de dépistage rapide et fiable pour évaluer la biodégradabilité des matériaux 7,8,9,10.
Aligné sur la norme ASTM D6691, un test de dépistage de la biodégradabilité inhérente des polymères, ce protocole évalue la biodégradation des matériaux dans des conditions optimales, 30 °C, la surface maximale de l’échantillon broyé et l’excès de nutriments inorganiques (azote, 130 mg/L ; phosphore, 23 mg/L)9, afin de favoriser la minéralisation et de prévenir les limitations en nutriments. Bien que les tests de dépistage offrent des informations initiales précieuses, d’autres tests, tels que les mouillages côtiers et en haute mer, qui mesurent la perte de poids en fonction du temps, peuvent être nécessaires pour une évaluation complète dans des conditions marines naturelles. Étant donné que ces tests d’amarrage côtiers et profonds estiment la biodégradation en fonction de la perte de poids en fonction du temps10,11, les chercheurs devraient d’abord effectuer ce test de dépistage, qui mesure directement le métabolisme microbien, avant de passer à une expérience d’amarrage in situ sur les côtes et les grands fonds, également plus coûteuse.
La méthode d’essai standard ASTM D6691 décrit les procédures d’évaluation de la biodégradation aérobie des matériaux plastiques non flottants dans les environnements marins. Cette norme, ainsi que des normes de spécification, telles que la norme ASTM D7081 (Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment ; focusing on biodegradability in a aquous, actuellement retirée de l’ASTM et en cours de réexamen), fournit un cadre pour la certification des polymères expérimentaux comme biodégradables en mer 9,12. En général, une spécification est une norme consensuelle d’ASTM International qui définit les exigences auxquelles un matériau, un produit ou un système doit répondre. Il garantit que les matériaux conçus pour se biodégrader dans les environnements marins le font dans des délais acceptables et ne libèrent pas d’additifs potentiellement toxiques, tels que des colorants ou des plastifiants.
S’appuyant sur la norme ASTM D6691, ce protocole quantifie le taux et le degré de biodégradation aérobie des matériaux (substrat expérimental) dans l’eau de mer naturelle et s’étend sur les contrôles positifs des matériaux (c.-à-d. cellulose, papier kraft, chitine/chitosane), dont la biodégradabilité dansl’environnement marin a été démontrée par le passé7,9,10 . L’objectif de cette méthode est de cribler les matériaux dans des conditions optimisées pour voir si les matériaux se biodégradent dans l’environnement marin. L’inoculum tire parti de la communauté microbienne naturelle présente dans l’eau de mer, recueillie conformément aux directives spécifiques décrites dans l’ASTM. Ces directives mettent l’accent sur l’utilisation d’eau de mer d’une salinité d’environ 32, recueillie dans un endroit exempt de polluants tels que les eaux usées, les décharges de produits chimiques ou les déversements de pétrole. L’essai utilise un respiromètre automatisé en boucle fermée avec des cuves de réacteur de 250 mL maintenues à 30 °C, chacune contenant 75 mL d’eau de mer et ~20 mg du substrat expérimental ou témoin8. La minéralisation (biodégradation) est exprimée en pourcentage de biogaz de carbone net (CO2-C) produit par rapport à la masse de carbone initiale ajoutée. Cette méthode ne tient pas compte de l’assimilation du carbone dans la biomasse microbienne.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Collecte et caractérisation de l’eau de mer
- Identifiez un site de collecte d’eau de mer non affecté par les eaux usées, les produits chimiques, les nappes d’hydrocarbures ou une forte influence de l’eau douce.
- Sur le site de collecte, consigner la source (emplacement, latitude et longitude, profondeur de collecte, profondeur totale et température), la date de prélèvement de l’échantillon et les conditions de l’eau observées.
- Recueillir et combiner des échantillons d’eau de mer provenant de plusieurs profondeurs, emplacements de sites et événements d’échantillonnage pour promouvoir une composition diversifiée de la communauté microbienne.
- Dans une tourie lixiviée à l’acide de 20 L, recueillir 10 à 20 L d’eau de mer à l’aide d’une grande bouteille Niskin et transporter au laboratoire.
- À partir de la tourie, transférez 1 L de sous-échantillon d’eau de mer entière dans une bouteille en polyéthylène haute densité ambré (PEHD) de 1 L lixiviée à l’acide pour l’analyse en laboratoire des particules de carbone et de l’azote dans les conditions initiales de l’eau de mer. À partir de l’échantillon de 1 L, filtrer (0,2 μm ; acétate de cellulose à faible teneur en azote) et prélever un sous-échantillon de 60 mL dans une bouteille en polyéthylène lixivié à l’acide pour l’analyse des constituants inorganiques et organiques de l’azote (N) et du phosphore (P) dissous.
- Étiquetez les sous-échantillons avec le nom du projet, l’ID de l’échantillon et la date. Mesurer les concentrations de NH4+ à l’aide de la méthode de l’indophénol (4500-NH3)13,14 et les niveaux de PO43- à l’aide de la méthode de la solution unique (4500-P E)13,15. Quantifier l’azote et le carbone particulaires à l’aide de la méthode d’analyse élémentaire16. Mesurer les concentrations de chlorophylle-a en suivant les protocoles décrits par Parsons et al.17(10150 A, 10150 C)13.
REMARQUE : Les analyses de la qualité de l’eau liées aux nutriments sont facultatives. Ce protocole suppose que les analyses sont effectuées par un laboratoire externe. - Couvrez sans serrer l’ouverture de la tourie pour maintenir les conditions aérobies et stockez l’eau de mer à 30 °C dans l’obscurité jusqu’à 7 jours.
REMARQUE : L’eau de mer peut également être aérée à l’aide d’une pompe à air et d’un système de barbotage.
2. Préparation du substrat expérimental
- Ajoutez 10 à 15 g de substrat expérimental (c.-à-d. polysaccharides naturels, bois, panneaux de fibres, polymères) qui peut se présenter sous forme de granulés, de fragments et de morceaux formés dans un pot de broyage en acier inoxydable de 50 ml avec une bille d’acier de 20 mm. Broyer le substrat expérimental jusqu’à ce qu’il atteigne une granulométrie uniforme (0,10 à 0,25 mm) avant le début de l’essai.
- Immergez le bol de broyage dans l’azote liquide et fragilisez-le pendant 15 minutes jusqu’à ce que l’azote liquide cesse de bouillir.
ATTENTION : L’azote liquide est un liquide cryogénique qui peut causer des brûlures, des blessures ou des engelures. Lisez et suivez toutes les fiches de données de sécurité avant utilisation. Portez un équipement de protection individuelle approprié. - Fixez le bocal de broyage dans l’accessoire du broyeur à boulets et réglez les paramètres de l’instrument sur 30 Hz et 2:30 min, puis appuyez sur Start. Répétez l’opération 4 fois avec un refroidissement de 30 s dans de l’azote liquide entre les essais. Si le matériau est un polymère à faible température de transition vitreuse, effectuez des cycles de broyage supplémentaires si nécessaire pour produire une distribution granulométrique uniforme.
- Vérifier l’uniformité de la taille et caractériser la distribution granulométrique des particules par analyse par tamis comme décrit dans la norme ASTM D1921-9618. Assemblez des tamis standard couvrant la plage de tailles de particules prévue, avec la plus petite taille de maille sur le fond. Placez l’échantillon broyé sur le tamis supérieur et fixez la pile de tamis dans un agitateur mécanique. Agitez jusqu’à ce que les particules passent à travers le grillage. Recueillir et peser le matériau retenu de chaque tamis pour calculer la distribution granulométrique. Utilisez le même ensemble de tamis pour tous les traitements afin de maintenir la comparabilité. Enregistrez la répartition sur la fiche technique.
- Déterminer la teneur en carbone par sous-échantillon de poids sec du substrat expérimental broyé par analyse élémentaire16.
REMARQUE : Ce protocole suppose que l’analyse élémentaire est effectuée par un laboratoire externe.
3. Préparation des nutriments supplémentaires pour l’eau de mer
- Remplissez à moitié une fiole jaugée de 2 L ou 4 L avec de l’eau de mer. Le volume total nécessaire dépend du nombre de cuves de réacteur à utiliser dans l’expérience. Chaque cuve de réacteur contiendra 75 mL d’eau de mer. Si la source d’eau de mer contient de fortes concentrations de matières organiques particulaires, tamisez l’eau de mer à travers une maille de 20 μm pour éliminer la contamination hétérogène par de grosses particules.
- À l’aide d’une balance de précision d’une sensibilité de 0,001 g, tarer une balance et peser 0,5 g/L de chlorure d’ammonium (NH4Cl) puis 0,1 g/L de phosphate de potassium monobasique (KH2PO4) sur la base de 2 L ou 4 L d’eau de mer.
ATTENTION : Le chlorure d’ammonium peut causer des lésions ou une irritation des yeux. Lisez et suivez toutes les fiches de données de sécurité avant utilisation et portez un équipement de protection individuelle approprié.
REMARQUE : Éliminer les déchets monobasiques de chlorure d’ammonium et de phosphate de potassium dans des conteneurs de déchets dangereux dédiés, conformément aux procédures institutionnelles et aux réglementations locales. De petits volumes de solutions diluées (<1 %) de NH4Cl et de KH2PO4 peuvent être éligibles à l’évacuation par drainage après dilution avec de l’eau abondante, si l’établissement et les autorités locales chargées des eaux usées l’autorisent. - Ajoutez les nutriments inorganiques dans la fiole jaugée de 2 L ou 4 L, portez au volume avec de l’eau de mer, ajoutez une barre d’agitation et remuez sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que tous les sels se dissolvent. La solution doit être claire, sans particules visibles.
- Sous-échantillonner 20 à 30 mL d’eau de mer enrichie en nutriments pour la mesure du pH et de la salinité. Filtrer 60 mL supplémentaires à travers un filtre en acétate de cellulose à faible teneur en azote de 0,2 μm dans une bouteille en polyéthylène lixivié à l’acide pour l’analyse de l’azote et du phosphore inorganiques dissous en suivant les méthodes standard de l’étape 1.5.
- Mesurez le pH et la salinité sur un appareil de mesure de paillasse en suivant les instructions du fabricant. Une diminution du pH d’environ une unité est attendue pour l’eau de mer pleine concentration en raison de l’acidité du supplément nutritif.
4. Préparation à l’incubation de la cuve du réacteur
- Lixiviation à l’acide de toute la verrerie, y compris les cuves de réacteur de 250 mL pour les échantillons et la pipette volumétrique de 75 mL dans de l’acide chlorhydrique à 10 % (HCl) pendant 24 h et rincer 3 fois à l’eau déminéralisée.
ATTENTION : HCl peut causer de graves brûlures et des lésions oculaires. Lisez et suivez toutes les fiches de données de sécurité avant utilisation. Portez un équipement de protection individuelle approprié.
REMARQUE : Les déchets de HCl à 10 % peuvent être neutralisés avec du bicarbonate de sodium pour former une solution neutre avant d’être éliminés. Effectuer la neutralisation conformément aux procédures institutionnelles en matière de déchets dangereux et aux réglementations locales applicables. - Autoclave les cuves de réacteur vides de 250 mL lixiviées à l’acide, les couvercles avec orifices, les joints toriques d’étanchéité en silicone et les bouchons à vis dans un autoclave à 121 °C pendant 15 minutes avant le jour de l’expérience.
- Étiquetez les flacons d’échantillon avec le numéro de canal/ID correspondant aux récipients recevant l’échantillon ou le matériel de contrôle.
- À l’aide de la balance analytique, tarer un flacon (avec bouchon) et peser 20 mg (± 0,1 mg) de l’expérimental ou du témoin, consigner le poids complet indiqué et réserver. Répéter l’opération pour toutes les répétitions expérimentales et témoins.
REMARQUE : Assurez-vous que les poids sont exacts. Il est recommandé de peser tous les substrats le même jour et par la même personne. - Allumez l’incubateur la veille de l’ajout des récipients et réglez la température à 30 °C. Allumez le respiromètre au moins 2 h avant d’exécuter les diagnostics du système et l’étalonnage du capteur selon les instructions du fabricant.
REMARQUE : La préparation de la cuve du réacteur peut commencer une fois que la température de l’incubateur atteint et se maintient à 30 ± 2 °C. - Préparez la fiche technique en enregistrant les ID d’échantillons/répétitions et le numéro de canal correspondant. Organisez les cuves du réacteur et les assemblages de capuchon (couvercle avec orifices/joint torique) par ordre de numéro de canal/ID (assurez-vous que chaque cuve est clairement étiquetée). Vérifiez les joints toriques et les couvercles/ports pour vous assurer qu’ils sont propres, secs et intacts.
5. Mise en place des cuves du réacteur
- À l’aide d’une pipette volumétrique de 75 mL lixiviée à l’acide et d’un contrôleur de pipette motorisé, on peut distribuer 75 mL d’eau de mer enrichie en nutriments dans chaque cuve de réacteur.
- Retirez une pipette jetable d’eau de mer (~3 ml) de chaque récipient et déposez-la sur une surface propre à côté. Cette eau de mer sera utilisée pour rincer les substrats expérimentaux et de contrôle broyés du flacon taré (Figure 1).
- Transférez les substrats dans des récipients appropriés.
- Placez un joint torique sur le bord de la cuve du réacteur, puis placez un couvercle à deux orifices directement sur le joint torique. Fixez le joint torique et le couvercle en place avec un bouchon à vis.
- Adaptez la cuve du réacteur à ses conduites de gaz/condensation correspondantes. Insérez fermement les conduites de gaz dans les orifices d’entrée/sortie appropriés dans le couvercle du récipient.
- Allumez la plate-forme de l’agitateur à 0,05 x g (mode continu). Effectuez une vérification visuelle pour vous assurer que tous les récipients sont sécurisés, puis fermez la porte de l’incubateur.
- Enregistrez la température de l’incubateur (lecture et sonde à thermistance) et la pression atmosphérique à l’aide d’un baromètre.
Figure 1 : Installation et préparation du navire. (A) l’ajout d’eau de mer, (B) l’ajout de l’échantillon et (C) l’ajout du joint torique, du couvercle métallique et du bouchon à vis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
6. Démarrage du système de respirométrie
- Lancez le logiciel sur l’ordinateur connecté. Vérifiez que le système détecte le matériel via la connexion RS-232. Si le matériel est introuvable, une notification indiquera que l’appareil n’est pas connecté et que le programme doit être redémarré.
- Dans le menu principal du logiciel, sélectionnez Outils > Diagnostics > Opérations de base. Cliquez sur Enregistrer le fichier journal. Cliquez sur Vannes et capteurs. Le logiciel indiquera RÉUSSITE ou ÉCHEC pour chaque test. Ne passez à l’étalonnage en deux points du capteur de CO2 que si les deux tests réussissent.
7. Étalonnage du capteur de CO2
- Connectez une colonne de chaux sodée à l’orifice d’azote sur le panneau arrière de la pompe d’échantillonnage pour éliminer le CO2 ambiant pour un étalonnage zéro. Assurez-vous que la chaux sodée apparaît d’un blanc crayeux et non décolorée (par exemple, rose ou violet).
- Sélectionnez Outils > l’étalonnage. Cliquez sur Démarrer l’étalonnage dans le coin inférieur droit. Lorsque vous y êtes invité, ajustez le débit d’échantillonnage à 0,5 L/min à l’aide de la commande de la pompe d’échantillonnage du panneau avant. Cliquez sur OK.
- Lorsque la minuterie atteint zéro, appuyez sur les boutons de décalage haut et bas du capteur de CO2 pour régler la lecture à l’écran à 0,000 (ou aussi près que possible). Les valeurs deviennent vertes lorsqu’elles se situent dans la plage acceptable. Cliquez sur Gaz suivant.
- Lorsque vous y êtes invité, connectez la bouteille de gaz d’étalonnage à l’orifice d’étalonnage sur le panneau arrière de la pompe d’échantillonnage. Ajustez la pression de sortie du gaz d’étalonnage à 5 PSIG. Assurez-vous que l’excès de gaz s’écoule à travers le raccord en T de manière à ce que l’utilisateur puisse entendre et sentir le gaz près du raccord, avant de cliquer sur OK.
- Lorsque la minuterie atteint zéro, appuyez sur les boutons de plage Haut et Bas du capteur de CO2 pour régler la lecture à l’écran à 2.700 (ou aussi près que possible). Les valeurs deviennent vertes lorsqu’elles se situent dans la plage acceptable. Cliquez sur Gaz suivant pour terminer l’étalonnage.
REMARQUE : Les concentrations de gaz de l’étendue sont déterminées par le mélange de gaz d’étalon primaire certifié, tel que documenté dans le certificat d’analyse du fournisseur.
8. Configuration de l’expérience dans le logiciel
- Sélectionnez Expérimenter > Configuration. Entrez les numéros de canal de début et de fin dans les menus déroulants en fonction des canaux occupés.
- Définissez le seuil d’actualisation ( %) sur 0,50, l’intervalle d’actualisation sur N.A. et l’actualisation de la fenêtre (s) sur Auto.
- Sous Divers configurations, cochez la case Capteurs de purge ; assurez-vous que les options Mesure automatique du volume, Consommation O2 Positive et Activer le mode d’écoulement ouvert ne sont pas sélectionnées.
- Réglez l’intervalle d’échantillonnage (heures) sur 8,00 et la durée de l’expérience (heures) sur N.A. Réglez les unités de gaz et de temps selon vos besoins.
- Si vous utilisez la sonde de température primaire pour la correction de la température d’incubation, assurez-vous que l’option Entrer manuellement les températures de la chambre n’est pas sélectionnée. Cochez la case Mode de ventilation et assurez-vous que le mode de vidange n’est pas sélectionné.
- Assurez-vous que le mode de ventilation anaérobie n’est pas sélectionné.
- Sélectionnez Configuration de la chambre. Saisissez des libellés de canal descriptifs (par exemple, NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
- Cliquez sur Utilitaires. Cliquez sur Cellules dans la colonne EN pour les canaux occupés uniquement. Cliquez sur Restriction. Le logiciel indiquera PASS ou FAIL pour chaque canal. Ne poursuivez que si tous les tests de restriction réussissent.
- Cliquez sur Volume pour mesurer les volumes de l’espace de tête.
REMARQUE : Le volume de l’espace de tête est égal au volume d’air à l’intérieur de la cuve du réacteur d’échantillonnage et du tube en boucle fermée. Confirmer que les volumes sont raisonnables pour la taille du navire et la longueur des tubes. - Cliquez sur Fuite. Le logiciel indiquera PASS ou FAIL pour chaque canal en fonction du volume de l’espace de tête. En cas de défaillance d’un canal, effectuez les opérations suivantes.
- Assurez-vous que le joint torique est propre et exempt de particules et de fibres et correctement placé entre le bord du récipient et le couvercle métallique.
- Serrez le bouchon à vis. Vérifiez le raccord et le tube au niveau des ports et des raccords IN/OUT. Coupez les extrémités des tubes usées ou déformées avec une lame tranchante pour assurer une coupe nette et droite.
- Si le canal continue de tomber en panne, remplacez le joint torique par un nouveau joint compatible spécifié par le fabricant.
- Cliquez sur Volume pour remesurer les volumes d’espace de tête. Cliquez sur Quitter. Assurez-vous que la colonne Volume de l’onglet Configuration de la chambre est renseignée pour tous les canaux occupés.
- Dans le menu principal, sélectionnez Outils > Menu de service. Confirmez que la sonde de température primaire, mesurant la température de l’incubateur, est à 30 °C ± 2 °C et stable.
- Cliquez sur Exécuter. Enregistrez le fichier à l’aide d’un nom descriptif qui inclut la date (par exemple, 030325PositiveControlValidation). Enregistrez le nom du fichier sur la feuille de données.
- Sélectionnez Expérience > Afficher > graphiques pour afficher des graphiques en temps réel. La production de biogaz apparaît comme des taux de production deCO2 positifs. Les contrôles négatifs peuvent fluctuer autour de zéro ; Cependant, leur taux moyen doit être nul ou positif.
- Si le système comprend des sécheurs d’air à condensation, tenez un registre quotidien de la condensation visible dans les tuyaux. Agitez doucement la tubulure pour perturber les blocages et permettre le drainage, si nécessaire.
- Mettez à jour les fichiers de données (fichiers texte ASCII) à la fin de chaque intervalle d’échantillonnage. Les données, y compris la température, le pourcentage de gaz (composition du gaz), le taux et l’accumulation, peuvent être téléchargées dans divers autres progiciels pendant l’expérience ou à la fin.
- Pour ouvrir .dat fichiers dans une feuille de calcul, lancez Excel et sélectionnez Fichier > Ouvrir. Accédez au dossier contenant le fichier .dat. Dans le menu déroulant du type de fichier, sélectionnez Tous les fichiers , puis choisissez le fichier souhaité.
- Lorsque l’Assistant Importation de texte vous y invite, sélectionnez Délimité comme type de fichier et cliquez sur Suivant.
- Sous Délimiteurs, cochez la case Virgule. Assurez-vous qu’aucun autre délimiteur n’est sélectionné. La fenêtre d’aperçu doit afficher les données séparées en colonnes. Cliquez sur Terminer pour charger les données dans la feuille de calcul.
- Enregistrez le fichier au format .xlsx ou .csv pour une analyse et un archivage plus approfondis.
- Analysez périodiquement les données pour vous assurer que les répétitions du traitement sont cohérentes. L’erreur-type des répétitions de traitement doit être inférieure à 5 % de la production cumulative moyenne de CO2 . Répéter les tests qui échouent à ce seuil.
- Cliquez sur Arrêter lorsque l’incubation est terminée.
- Les incubations peuvent durer de 10 à 90 jours. Si les matériaux d’essai sont hautement biodégradables, mettre fin à l’incubation lorsque la production cumulative de CO2 atteint un plateau ou la prolonger si aucune dégradation n’est observée après 90 jours.
- Conclure des expériences lorsqu’aucune production nette de gaz n’est observée pendant au moins 5 jours dans les récipients de contrôle et d’essai. L’absence de production nette est définie comme une variation inférieure à 1 % du pourcentage de biodégradation sur 5 jours.
- Arrêtez le système ou préparez-vous pour la prochaine expérience.
9. Décomposition de l’expérience
- Enregistrement de la température de l’incubateur (sonde à thermistance et lecture de l’incubateur). Débranchez le tube des cuves du réacteur du respiromètre et pesez chaque cuve du réacteur à l’aide d’une balance de précision. Consigner les poids pour déterminer s’il y a eu perte de poids ou d’eau pendant la période d’incubation.
- Prélever un sous-échantillon de 20 à 30 mL d’eau de mer dans chaque cuve du réacteur pour mesurer le pH et la salinité, puis comparer ces valeurs à celles enregistrées à l’étape 3.4 pour vérifier la stabilité pendant l’incubation. Filtrer 60 mL supplémentaires à travers un filtre en acétate de cellulose à faible teneur en azote de 0,2 μm dans une bouteille en polyéthylène lixivié à l’acide pour l’analyse de l’azote et du phosphore inorganiques dissous en suivant les méthodes normalisées de l’étape 1.5.
REMARQUE : Les échantillons d’eau de mer résiduels peuvent être filtrés pour éliminer les plastiques restants, dilués pour réduire les concentrations de nutriments et éliminés par décharge de drain conformément aux réglementations institutionnelles et locales. - Rincez les récipients, les joints toriques, les couvercles métalliques et les bouchons à vis avec de l’eau du robinet. Placez la verrerie dans un bain d’acide HCl à 10 % pendant au moins 24 h. Autoclave et stockage recouverts de papier d’aluminium pour la prochaine incubation
10. Calcul du pourcentage de biodégradation
- Calculer le carbone total dans le substrat expérimental/témoin comme suit :
où le % C (teneur en carbone) est déterminé par analyse élémentaire.
REMARQUE : Le carbone total dans les substrats expérimentaux et témoins peut subir la transformation biochimique suivante au cours de l’incubation aérobie :
C + O2 → CO2
Chaque mmole (12 mg) de carbone organique du substrat expérimental/témoin peut être converti en 1 mmol de CO2 gazeux. Un mmole de gaz produit occupe 22,4 mL à température et pression standard (STP). - Calculez le pourcentage de biodégradation comme suit :
où Cg = quantité de carbone gazeux produite à partir du substrat expérimental/témoin et du témoin négatif (inoculum d’eau de mer seulement), mmoles, et Ci = quantité de carbone dans le substrat expérimental ajouté, mmoles. - Calculer l’erreur-type, se, du pourcentage de biodégradation comme suit :
où n1 et n2 = nombre de substrats expérimentaux/témoins répétés et de cuves de réacteur à témoin négatif, respectivement, et s = écart-type du carbone gazeux total produit. - Calculez les limites de confiance (CL) à 95 % comme suit :
où t = valeur de la distribution t pour une probabilité de 95 % avec (n1 + n2 − 2) degrés de liberté, donc n = 3 + 3 − 2 = 4.
11. Fin du protocole
- Après avoir terminé les calculs et l’analyse des données, compilez les résultats dans le rapport final ou saisissez-les dans une base de données partagée conformément aux plans de gestion des données du projet ou de l’établissement. Assurez-vous que tous les matériaux sont éliminés conformément aux directives de l’établissement en matière de déchets dangereux, et que tout l’équipement est nettoyé et entreposé.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Les résultats des essais de biodégradation marine sont présentés. La biodégradation a été évaluée pour chaque échantillon en mesurant la proportion de carbone convertie en dioxyde de carbone. Les graphiques de biodégradation cumulative, de taux et de pourcentage présentent généralement une phase de latence, suivie d’une phase de croissance et finalement d’un plateau. Le moment et l’ampleur de ces phases dépendent du matériau de l’échantillon, des conditions expérimentales et de la compos...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les performances de la commande positive déterminent la validité du test. Une biodégradation d’au moins 70 % d’un substrat témoin positif biodégradable facilement marin (p. ex., cellulose de qualité analytique, papier kraft, etc.), en fonction de son rendement maximal théorique en gaz, est requise. Ce repère vérifie des conditions favorables et une activité microbienne suffisante dans l’eau de mer naturelle pendant l’incubation. Le non-respect de ce seuil indique un problème potentiel li...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Les auteurs remercient Columbus Instruments et le laboratoire de biodégradabilité de l’École des sciences et technologies marines de l’Université du Massachusetts à Dartmouth pour leur soutien technique et l’accès aux installations. Le financement du système de respirométrie Micro-Oxymax de Columbus Instruments et du démarrage du laboratoire a été fourni par PrimaLoft et le Massachusetts Technology Collaborative.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,2 & micro ; M, filtre acétate de cellulose de 47 mm | Géofiltre géotechnique | 83100056 | Filtrer l’eau de mer |
| Pipette volumétrique de 100 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2U | Classe A ; L’acide lixivié et rincé à l’eau déionisée |
| Béchers en verre de 100 à 600 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 50-194-5690 | Classe A ; L’acide lixivié et rincé à l’eau déionisée |
| Des billes de fraisage de 20 mm | Retsch | 53680062 | Acier inoxydable. Utilisé avec un bocal de mouture pour le mouture cryogénique du polymère |
| Bocaux de broyage de 50 mL | Retsch | 14620216 | Acier inoxydable. Utilisé avec des boules de mouture de 400 et de 20 mm Mixer Mill pour le moulin cryogénique du polymère |
| Pipet volumétrique de 75 mL | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-650-2T | Classe A ; L’acide lixivié et rincé à l’eau déionisée |
| Pompe à air et système de bulles | Tetra | 77846 | Aérer l’eau de mer lors de l’équilibre avant l’incubation |
| Feuille d’aluminium | Fisherbrand | 01-213-100 | Couverture pour l’autoclavage et un stockage propre |
| Chlorure d’ammonium (NH4Cl) | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | A661-500 | Pic de nutriments dans l’eau de mer |
| Bilan analytique | Mettler | AT201 | Peser les substrats expérimentaux et de contrôle |
| Autoclave | Tuttnauer | MFI-TTN-3870EA | Stériliser les récipients et les ensembles de couvercles |
| Micro-Oxymax de base 120VAC à canal unique | Columbus Instruments | 0135-8000 | Utilisé pour stocker des contrôles positifs et des polymères |
| Gaz d’étalonnage | Airgas | X03NI92P3000001 | Mélanges primaires de gaz standard ; 2,7 % de dioxyde de carbone, 4,5 % de méthane, équilibre azote |
| Moniteur d’ordinateur | Dell | 210-BMKK | Moniteur hub USB-C Dell Pro 24 Plus. Utilisé avec ordinateur pour exécuter le logiciel Micro-Oxymax |
| Gants cryogéniques | Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Gants Cryo | 11-394-306 | Utilisé pour manipuler l’azote liquide |
| Thermomètre à cadran | Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac | 13-201-433 | Thermomètre calibré pour la température de l’eau de mer au moment de la collecte |
| Pipettes jetables | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 13-711-7M | Rincez les parois du récipient pour libérer le matériau |
| Boîtier ENC52 à contrôle de température et de lumière | Columbus Instruments | 4740-4054 | Maintenir les conditions de température et de lumière |
| Pinces à flasques | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | S07387 | Utilisé pour manipuler des bocaux de mouture dans de l’azote liquide |
| Fioles, 250 mL | DWK Sciences de la Vie | 14395-250 | Récipients du réacteur d’échantillons |
| Fioles en coquille de verre avec bouchons de type bouchon | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-339-26D | Stockage des échantillons |
| Profondeur portatif H22PX | West Marine, Norcross Marine | 6849368 | Déterminer la profondeur du site de collecte de l’eau de mer |
| GPS portable 73 | Garmin | 10-01504-00 | Utilisé pour déterminer l’emplacement du site de collecte de l’eau de mer |
| Poêle HDPE | Thermo Scientific, Nalgene | 13-359-26 | Utilisé pour faire l’acidification de la verrerie ; dans une solution à 10 % HCl |
| Acide chlorhydrique (solution d’eau acide) | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | A144-212 | ACS certifié Plus, 36,5 à 38,0 %. Contrôle des capteurs CO2 et verrerie à lessivation d’acide |
| Hotte à écoulement laminaire | Sciences de l’air | FLOW-48-A | Minimiser les contaminants aériens lors de la préparation de l’échantillon |
| Grand Niskin ; Bouteille Beta Plus uniquement - 8,2L horizontal, PVC | La science d’abord | 3-1980-H65 | Pour la collecte d’eau de mer depuis la jetée ou le bateau |
| Bac à azote liquide | Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2 | 11-999-063 | Conserver de l’azote liquide ; |
| Récipient de transfert d’azote liquide, 10 L | Thermo Scientific | TY509X2 | Stocker et distribuer de l’azote liquide pour la cryousine |
| Azote liquide, qualité industrielle, 22 PSI | Airgas | NI 180LT22 | Utilisé pour fragiliser et moudre les polymères |
| Crible mécanique | Humbolt, Grainger | 5DPL6 | Analyse de tamisage pour la distribution de la taille des particules |
| Micro-Oxymax ; | Columbus Instrumentts | 7395-113-D64 | Joint torique scellé en silicone, port métallique avec 3 raccords, et bouchon à vis GL45 & nbsp ; |
| Interface d’expansion Micro-Oxymax 10 canaux | Columbus Instruments | 0135-8101 | Composant du système de respirométrie |
| Micro-Oxymax Respiromètre (capteur CO2 3 %) | Columbus Instruments | 0135-8403 | Infrarouge non dispersif |
| Broyeur mélangeur 400 | Retsch | 207450001 | Moulin à mélangeur 400. Utilisé pour le mouture cryogénique de polymères |
| Contrôleur de pipette motorisée | Eppendorf | 4430000018 | Transfert de l’eau de mer vers les récipients du réacteur d’échantillonnage |
| Bouteille de laboratoire HDPE à bouche étroite ambrée, 1 L | Thermo Scientific, Nalgene | 02-923-5 | Échantillon discret d’eau de mer en eau entière |
| Nylon mesh 20 microns | ELKO Filtering Co. | 41718 | Utilisé pour tamiser l’eau de mer brute afin d’éliminer les particules hétérogènes plus grandes |
| Vibrateur orbital en plein air | Thermo Fisher Scientific | SK4000 | Maintenir le mouvement orbital des récipients du réacteur pendant l’incubation |
| OptiPlex 5090 Petit Ordinateur de Forme | Dell | C0SL03 | Ordinateur Desktom utilisé pour exécuter le logiciel Micro-Oxymax & nbsp ; |
| Compteur pH/Cond | Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic | 30046252 | Compteur de pH/conductivité de laboratoire pour mesurer l’inoculum initial et final de l’eau de mer |
| Bouteille de polyéthylène, 60 mL | Qorpak | PLC-03564 | Échantillon discret d’eau de mer filtrée |
| Phosphate de potassium monobase (KH2(PO4)) | Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagents | BP362-500 | Pic de nutriments dans l’eau de mer |
| Équilibre de précision | Sartorius | Practum2102-1S | Pèser le tare et le poids total des récipients |
| Carboy rond, 20 L | Thermo Fisher Scientific | 02961A | Lixiviation acide pour le stockage de l’eau de mer |
| Lunettes de sécurité | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | 19-181-513 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula | 01-257-567 | Scoopula de laboratoire en acier inoxydable |
| Tamis | Advantech, Grainger | 40PR18-40PR55 | Tamis en acier inoxydable. Le nombre de tamis et les tailles dépendront du matériau testé. |
| Cellulose Sigmacell, Type 101 | Sigma-Aldrich | 435236-250G | Poudre, substrat de contrôle positif |
| Sodium Bicarbonate | Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical | S233-500 | Contrôle du capteur CO2 |
| Sulfite de sodium, anhydre, 98 % | Thermo Fisher Scientifique, Thermo Sciences Chimiques | AAA1793336 | Contrôle du capteur CO2 |
| Sonde thermomètre/thermistance | Fisherbrand | 15-079-700 | Vérifier la température de l’incubateur |
| Baromètre à cadran de précision traçable | Fisherbrand | 14-648-51 | Enregistrer la pression atmosphérique au début de l’expérience |
| Victor Régulateur à deux étages à hydrogène de moyenne capacité, méthane, CGA - 350 | AirGas | VIC0781-3559 | Régulateur de gaz d’étalonnage & nbsp ; |
| Fioles volumétriques, 2 L | Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand | FB4002000 | Classe A ; l’acide lixivié et rincé à l’eau déionisée. Utilisé pour préparer de l’eau de mer riche en nutriments. |
| Bassins de pesée | Thermo Fisher Scientific | 02-202-101 | Polyéthylène |
Références
- Avio, C. G., Gorbi, S., Regoli, F. Plastics and microplastics in the oceans: From emerging pollutants to emerged threat. Marine Environ Res. 128, 2-11 (2017).
- Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine Poll Bullet. 62 (12), 2588-2597 (2011).
- Andrady, A. L. Plastics and Environmental Sustainability. , John Wiley and Sons. (2015).
- Rosato, A., et al. Bacterial colonization dynamics of different microplastic types in an anoxic salt marsh sediment and impact of adsorbed polychlorinated biphenyls on the plastisphere. Environ Poll. 315, 120411(2022).
- Flury, M., Narayan, R. Biodegradable plastic as an integral part of the solution to plastic waste pollution of the environment. Curr Opin Green Sustain Chem. 30, 100490(2021).
- Chamas, A., et al. Degradation rates of plastics in the environment. ACS Sustain Chem Eng. 8 (9), 3494-3511 (2020).
- Allen, A. L., Mayer, J., Stote, R., Kaplan, D. L. Simulated marine respirometry of biodegradable polymers. J Environ Poly Degradat. 2, 237-244 (1994).
- Briassoulis, D., Pikasi, A., Papardaki, N. G., Mistriotis, A. Biodegradation of plastics in the pelagic environment of the coastal zone - Proposed test method under controlled laboratory conditions. Sci Tot Environ. 912, 168889(2024).
- Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium or Natural Sea Water Inoculum ASTM D6691-24a, ASTM International. , ASTM International. (2024).
- Ratto, J. A., Russo, J., Allen, A., Hebert, J., Wirsen, C. Biodegradable polymers in the marine environment: A tiered approach to assessing microbial degradability. Biopol Polysacch Agroprot ACS Symp Series. 786, 316-336 (2001).
- Standard Test Method for Weight Attrition of Plastic Materials in the Marine Environment by Open System Aquarium Incubations, ASTM-D7473-12. , ASTM International. (2012).
- Standard Specification for Non-Floating Biodegradable Plastics in the Marine Environment ASTM D7081-05 (withdrawn 2014). , ASTM International. (2005).
- American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 24th, Washington, DC. (2023).
- Scheiner, D. Determination of ammonia and Kjeldahl nitrogen by indophenol method. Water Res. 10 (1), 31-36 (1976).
- Murphy, J., Riley, J. P. A single-solution method for the determination of soluble phosphate in seawater. J Marine Biol Assoc U K. 37, 9-14 (1958).
- Kirsten, W. Organic Elemental Analysis: Ultramicro, Micro, and Trace Methods. , Academic Press/Harcourt Brace Jovanovich. (1983).
- Parsons, T. R., Maita, Y., Lalli, C. Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater Analysis. , Pergamon Press. (1989).
- Standard Test Methods for Particle Size (Sieve Analysis) of Plastic Materials, ASTM D1921-96. , ASTM International. (1996).
- Gilbert, J. A., et al. The taxonomic and functional diversity of microbes at a temperate coastal site: a 'multi-omic' study of seasonal and diel temporal variation. PLoS ONE. 5 (11), e15545(2010).
- Chafee, M., et al. Recurrent patterns of microdiversity in a temperate coastal marine environment. ISME J. 12 (1), 237-252 (2018).
- Jannasch, H. W., Eimhjellen, K., Wirsen, C. O., Farmanfarmaian, A. Microbial degradation of organic matter in the deep sea. Science. 171 (3972), 672-675 (1971).
- Zumstein, M. T., et al. Biodegradation of synthetic polymers in soils: Tracking carbon into CO2 and microbial biomass. Sci Adv. 4, eaas9024(2018).
- Zumstein, M. T., Narayan, R., Kohler, H. P. E., McNeill, K., Sander, M. Dos and do nots when assessing the biodegradation of plastics. Science. 366 (6470), 9967-9969 (2019).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
