Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Etablissement et quantification de l’infection lytique de novo par l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi acellulaire

1.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/68959

⸱

15 août 2025

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un système in vitro permettant de modéliser l’infection lytique de novo de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi à l’aide de virions dérivés de BAC16. La méthode permet d’étudier la réplication et la dissémination virales précoces. La production de virus infectieux est quantifiée par des tests d’unités infectieuses basées sur la GFP et une PCR en temps réel des génomes viraux encapsidés.

Résumé

L’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV), un gammaherpèsvirus impliqué dans de multiples tumeurs malignes humaines, peut subir une réplication lytique au cours de l’infection primaire, un processus qui contribue à la dissémination virale, à l’évasion immunitaire et à la pathogenèse de la maladie. Cependant, l’absence de systèmes in vitro robustes pour l’infection de novo a limité les informations sur les événements précoces de l’infection. Ici, nous présentons un protocole traitable qui utilise les cellules HCT 116 du cancer colorectal humain comme cibles d’infection par des virions acellulaires dérivés de cellules productrices d’iSLK réactivées par le chromosome 16 artificiel bactérien KSHV (BAC16). Ce modèle récapitule les étapes clés de l’infection primaire, notamment l’entrée virale, l’administration du génome, l’expression des gènes lytiques et la production de descendance. L’infection est synchronisée par spinoculation et surveillée temporellement. La production virale est quantifiée à l’aide d’un système à double lecture comprenant des dosages d’unités infectieuses (UI) basées sur la protéine de fluorescence verte (GFP) et une qPCR de l’ADN viral encapsulé. Ces approches permettent une analyse détaillée de la cinétique de réplication virale. Alors que le protocole actuel met l’accent sur la détection des événements de stade avancé, le système est adaptable pour étudier les phases précoces de l’infection grâce à des points de temps d’échantillonnage modifiés. En offrant une plate-forme reproductible et évolutive pour une infection de novo productive, ce système comble une lacune méthodologique dans la recherche sur le KSHV et soutient les études mécanistes de l’interaction herpèsvirus-hôte et les stratégies antivirales.

Introduction

L’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) est un gammaherpèsvirus humain étiologiquement lié au sarcome de Kaposi (SK), au lymphome primitif d’épanchement (PEL), à la maladie de Castleman multicentrique (MCD) et au syndrome de cytokines inflammatoiresdu KSHV 1,2. Comme tous les virus de l’herpès, le KSHV établit une persistance à vie dans l’hôte, alternant entre les phases latentes et lytiques. Alors que la latence prédomine dans la plupart des cellules infectées, un sous-ensemble peut entrer dans le cycle lytique soit lors d’une infection primaire (de novo), soit par réactivation à partir de la latence3. La réplication lytique implique une cascade ordonnée d’expression des gènes viraux, aboutissant à la réplication du génome, à l’assemblage des virions et à la libération de la descendance. Ce processus est essentiel à la dissémination virale et à la progression de la maladie 4,5. Les premières études sur la réplication lytique du KSHV reposaient souvent sur l’expression ectopique de gènes viraux individuels dans des systèmes hétérologues. Bien qu’informatives, ces approches n’ont pas permis de saisir la régulation coordonnée des gènes et l’interaction virus-hôte présentes lors d’une infection authentique. Le développement de BAC-16, un chromosome artificiel bactérien recombinant (BAC) portant le génome complet du KSHV, a permis la production de virus génétiquement manipulables qui conservent leur compétence pour la réplication et la production de virions infectieux6. Ce système facilite la mutagénèse ciblée et l’analyse fonctionnelle des gènes viraux dans le contexte du génome complet. Les modèles de réactivation utilisant des cellules iSLK ou BCBL-1 infectées de manière latente avec BAC-16 ou KSHV sont depuis devenus standard pour l’étude de la réplication lytique du KSHV. Ces systèmes permettent l’induction synchronisée du cycle lytique à l’aide d’agents tels que la doxycycline (Dox) et le butyrate de sodium 7,8. Cependant, parce que les modèles de réactivation contournent les étapes précoces de l’infection - y compris l’entrée virale, le trafic intracellulaire et la décision initiale entre la latence et la réplication lytique - ils ne peuvent pas récapituler complètement la dynamique de l’infection primaire.

Les modèles d’infection de novo offrent un cadre complémentaire pour combler ces lacunes. Il a été démontré que plusieurs modèles de cellules primaires, tels que les cellules endothéliales humaines et les cellules épithéliales gingivales, soutiennent la réplication lytique après une infection de novo par le KSHV 3,9,10,11. Cependant, leur durée de vie limitée, leur coût élevé et leur faible facilité de manipulation génétique limitent leur reproductibilité et leur évolutivité pour les études mécanistes. Dans ce protocole, nous décrivons un modèle traitable et évolutif de l’infection lytique de novo par le KSHV à l’aide de la lignée cellulaire de carcinome colorectal humain HCT 116. Bien qu’elles ne soient pas une cible naturelle du KSHV, les cellules HCT116 présentent une permissivité robuste à l’infection et fournissent une plate-forme stable et rentable adaptée aux études mécanistes et aux applications à haut débit. Étant donné la capacité limitée de formation de plaques du KSHV en culture, nous utilisons le système BAC16 incorporant un rapporteur GFP pour générer un virus acellulaire pour l’infection. Cela permet de visualiser directement les cellules infectées et de quantifier les titres infectieux à l’aide de dosages d’unités infectieuses (UI) basés sur la GFP12. En complément, l’ADN associé au virion est mesuré par PCR quantitative en temps réel (qPCR) après un traitement par DNase, offrant une méthode sensible pour détecter les génomes viraux encapsidés. Ensemble, ces tests permettent une analyse quantitative résolue dans le temps de la dynamique de réplication lytique au cours de l’infection primaire.

Ce protocole fournit une plate-forme fiable et flexible pour modéliser l’infection lytique de novo par le KSHV in vitro, facilitant la dissection des événements précoces du cycle de vie viral, permettant l’évaluation de la fonction des gènes et de l’activité antivirale.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Le KSHV est classé comme un agent pathogène humain de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Effectuer toutes les procédures impliquant des matières infectieuses dans une enceinte de biosécurité certifiée BSL-2. Décontaminer les surfaces de travail avec de l’éthanol à 70 % avant et après chaque procédure. Éliminer tous les déchets conformément aux réglementations institutionnelles en matière de biosécurité et aux directives BSL-2 de l’OMS. La figure 1 présente un aperçu schématique de l’ensemble du flux de travail. La procédure comprend la génération de KSHV acellulaire dérivé de BAC16 à partir de cellules iSLK réactivées, l’infection de novo des cellules HCT 116, la quantification des titres viraux par dosage d’unités infectieuses (UI) et l’analyse qPCR de l’ADN viral associé au virion. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Production de KSHV acellulaire dérivé de BAC16

  1. Ensemencez cinq flacons T75 de cellules iSLK inductibles par Dox hébergeant le kshv BAC 16 de type large (WT) (ISLK-BAC16) avec une confluence d’environ 80 %. Incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO 2 pendant 24 h.
  2. Induire la réactivation lytique en ajoutant 1 μg/mL de Dox et 1 mM de butyrate de sodium dans chaque fiole. Poursuivre l’incubation pendant 72 à 96 h.
  3. Surveillez quotidiennement les cellules par microscopie à contraste de phase. Prélever le surnageant une fois que >90 % des cellules présentent un arrondi, un détachement de la surface du ballon et/ou une lyse visible, caractéristiques de l’effet cytopathique (EPC) indiquant une réaction lytique robuste. Après la collecte du surnageant, décontaminer et jeter les cellules iSLK-BAC16 induites lytiquement à l’aide d’eau de Javel à 10 %.
  4. Centrifugez les surnageants collectés à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris. Filtrez le surnageant clarifié à travers un filtre à membrane en polyéthersulfone (PES) de 0,45 μm sans perturber la pastille.
  5. Transférez les surnageants filtrés dans des tubes d’ultracentrifugation. Granuler les particules virales par centrifugation à 25 000 x g pendant 3 h à 4 °C à l’aide d’un rotor SW28.
  6. Jetez soigneusement le surnageant dans de l’eau de Javel à 10 %. Remettre la pastille virale en suspension dans 1 mL de milieu modifié Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM) sans sérum.
  7. Aliquote le virus remis en suspension dans des tubes à microcentrifuger stériles de 1,5 mL à bouchon à vis. Conserver les aliquotes à -80 °C jusqu’à utilisation. Déterminer les titres infectieux du stock de virus à l’aide de dosages d’unités infectieuses (UI) basés sur la GFP dans les cellules SLK (voir étape 3).

2. Infection de novo des cellules HCT116

REMARQUE : Une multiplicité élevée de l’infection (MOI) est essentielle pour initier efficacement la réplication lytique dans les cellules HCT116 après une infection de novo par le KSHV. Cette condition permet une expression génique virale robuste et une réplication productive sans avoir besoin de stimuli exogènes. Un résultat représentatif démontrant l’effet dépendant du MOI-dépendant sur la production de virions est fourni dans la figure supplémentaire 1A.

  1. Ensemencez 1 x 105 cellules HCT116 par puits dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO 2 .
  2. Diluer le stock de virus concentré dans du DMEM préchauffé et sans sérum jusqu’à un volume final de 250 μL pour obtenir une multiplicité d’infection (MOI) de 10.
  3. Aspirer le milieu de culture de chaque puits. Ajoutez 250 μL de virus dilué directement dans les cellules.
  4. Centrifuger la plaque à 1 500 x g pendant 1 h à 30 °C pour synchroniser l’infection (spinoculation). Transférez immédiatement la plaque dans un incubateur à 37 °C et poursuivez l’incubation pendant 1 h supplémentaire.
  5. Aspirez l’inoculum et lavez les cellules trois fois avec du PBS préchauffé pour éliminer le virus résiduel. Ajouter 1 mL de DMEM complet dans chaque puits.
  6. Surveiller l’expression de la GFP dans les cellules infectées par microscopie à fluorescence 36 h, 60 h et 96 h après l’infection. À chaque point temporel, prélever 1 mL de surnageant de culture dans chaque puits.
    REMARQUE : Après la collecte du surnageant, les cellules HCT116 infectées par le KSHV peuvent être conservées pour des applications en aval telles que l’extraction d’ARN, l’analyse de protéines, l’immunofluorescence ou la cytométrie en flux, sur la base d’objectifs expérimentaux.
  7. Centrifuger les surnageants collectés à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Transférez les surnageants clarifiés dans des tubes frais. Congeler instantanément dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C pour une analyse plus approfondie.

3. Dosage des unités infectieuses (dosage IU)

REMARQUE : Les cellules SLK sont permissives à l’entrée du KSHV et soutiennent l’expression précoce des gènes lytiques. Ce test quantifie les unités infectieuses en fonction de l’expression de la GFP dans les cellules SLK infectées après exposition à des surnageants contenant des virus dilués en série.

  1. Ensemencer 1 x 10cellules 4 SLK par puits dans une plaque de 96 puits 24 h avant l’infection. Assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties et atteignent une confluence de ~60 % à 70 % le jour de l’infection.
  2. Étiquetez neuf tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pour des dilutions en série en deux : Tube 1 (non dilué, 1:1), Tube 2 (1:2), Tube 3 (1:4), Tube 4 (1:8), Tube 5 (1:16), Tube 6 (1:32), Tube 7 (1:64), Tube 8 (1:128) et Tube 9 (1:256).
  3. Ajouter 200 μL de surnageant viral dans le tube 1. Ajouter 100 μL de DMEM préchauffé et sans sérum dans chacun des tubes 2 à 9. Pour commencer la série de dilution, transférez 100 μL du tube 1 au tube 2 et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas. Transférez ensuite 100 μL du tube 2 au tube 3 et répétez ce processus séquentiellement dans le tube 9, en mélangeant soigneusement à chaque étape.
    REMARQUE : Chaque tube doit contenir un volume final de 100 μL. Effectuer toutes les dilutions en trois exemplaires.
  4. Aspirez le milieu de culture à partir de cellules SLK. Ajouter 100 μL de chaque dilution virale dans les puits désignés. Utilisez 27 puits au total (3 puits par dilution de 1:1 à 1:256).
  5. Centrifuger la plaque à 96 puits à 1 500 x g pendant 1 h à 30 °C pour favoriser l’adsorption du flacon. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C CO 2 pendant 1 h supplémentaire.
  6. Retirez l’inoculum et ajoutez délicatement 100 μL de DMEM complet dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C.
  7. Récoltez les cellules et analysez l’expression de la GFP par cytométrie en flux. Notez le nombre de cellules GFP positives par puits.
  8. Calculer le nombre d’unités infectieuses par mL (UI/mL) à l’aide de la formule suivante13 :
    UI/mL = [(nombre de cellules GFP positives par puits)/volume d’inoculum (mL)] x facteur de dilution. Déterminer le titre viral final à l’aide de la dernière dilution avec des cellules GFP positives détectables

4. Quantification des génomes viraux encapsidés par qPCR

  1. Ajouter la DNase I à une concentration finale de 100 U/mL à 400 μL de surnageant clarifié (voir l’étape 1 pour la clarification du surnageant et l’élimination des débris). Incuber pendant 15 min à 37 °C pour digérer les ADN viraux et cellulaires non encapsulés. Un résultat représentatif démontrant la spécificité et l’efficacité du traitement par DNase est présenté dans la figure supplémentaire 1B.
  2. Ajouter de l’EDTA à une concentration finale de 50 mM pour arrêter la réaction de DNase. Incuber à 75 °C pendant 15 min pour inactiver la DNase I.
  3. Extrayez l’ADN viral du surnageant traité à la DNase à l’aide du Mini Kit ADN selon le protocole du fabricant.
  4. Éluer l’ADN viral dans 30 μL de tampon d’élution. Utilisez 5 μL d’ADN élué pour chaque réaction qPCR.
  5. Amplifiez le cadre de lecture ouvert KSHV 73 (ORF 73) à l’aide des amorces suivantes : Avant : 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3' ; Revers : 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. Préparez des réactions qPCR en trois exemplaires à l’aide de SYBR Green Master SuperMix. Réglez les conditions de cycle comme suit : Dénaturation initiale : 95 °C pendant 3 min ; Amplification : 40 cycles de 95 °C pendant 10 s, 52 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; Analyse de la courbe de fusion : rampe standard pour la spécificité de l’amplicon.
  7. Générer une courbe standard en utilisant des dilutions en série de 10 fois de l’ADN viral dérivé de BAC-16, allant de 109 à 101 copies par réaction. Tracez les valeurs Ct par rapport au log10 du nombre de copies d’entrée pour évaluer la linéarité du test. Une courbe standard représentative est illustrée à la figure supplémentaire 1C.
  8. Déterminez le nombre de copies du génome viral en comparant les valeurs Ct à la courbe standard. Normaliser et rapporter les résultats sous forme de copies d’ADN viral par mL de surnageant.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Pour quantifier le titre du virus infectieux, les surnageants récoltés 72 h après la réactivation lytique des cellules iSLK-BAC16 ont été soumis à une dilution en série double et utilisés pour infecter les cellules SLK. Le nombre de cellules SLK positives à la GFP à chaque dilution est illustré à la figure 2A, et les unités infectieuses (UI) correspondantes par mL ont été calculées et présentées à la figu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La modélisation de l’infection lytique de novo du KSHV a longtemps été entravée par la forte propension du virus à établir une latence dans la plupart des types de cellules permissives. Bien qu’il ait été démontré que certaines cellules primaires, telles que les cellules endothéliales et épithéliales buccales, favorisent la réplication lytique après une infection de novo 9,10, leur durée de vie limitée, leur coût élevé et leur difficul...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jae U. Jung (Cleveland Clinic) d’avoir partagé la lignée cellulaire iSLK-BAC16 produisant le KSHV recombinant. La conception graphique a été créée à l’aide de BioRender.com, pour lesquels les auteurs possèdent une licence. Ce travail a été soutenu par les bourses R21 DE028256, R01 CA140964 et R01 CA262631 à C. Liang (PI), la bourse postdoctorale Wistar Science Accelerator à Q. Zhu.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 et micro ; Filtre en polyéthersulfome (PES)  ;VWR76479-020
Bio-renduBio-renduN/ALa conception graphique a été
créée avec BioRender.com, pour laquelle les auteurs possèdent une licence
Système PCR en temps réel CFX Opus 96Bio-Rad184-5072
DMEM completLe milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM ; Sigma-Aldrich) complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS ; Gibco), 2 mM de L-glutamine (Gibco) et 100U/ml de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep ; GenClone).
DNase IBiolabs de la Nouvelle-AngleterreM0303S
DoxycyclineSigma-AldrichD9891
Cytomètre en flux LSR II 18BD BiosciencesN/A
PerfeCTa SYBR Green Master SuperMixQuantabioRéférence 95054-02K
QIAamp Mini Kit ADNQiagen56304
butyrate de sodium (NaB)Sigma-AldrichRéf. B5887
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020

Références

  1. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).
  2. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).
  3. Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Virology. 536, 27-31 (2019).
  4. Dittmer, D. P., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy. J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).
  5. Chang, H. H., Ganem, D. A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity. Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).
  6. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Grundhoff, A., Ganem, D. Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis. J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).
  9. Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells. J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).
  10. Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop. J Virol. 97 (3), e0169622(2023).
  11. Lagunoff, M., et al. De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells. J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  12. ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity. J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).
  13. Chandran, B. Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells. J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).
  14. Zhu, Q., et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production. Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).
  15. Lee, S. C., et al. Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection. J Virol. 97 (11), e0097223(2023).
  16. White, I. E., Campbell, T. B. Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR. J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).
  17. Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).
  18. Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions. J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).
  19. Watzinger, F., et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).
  20. Cho, H. J., et al. Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses. Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).
  21. Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication. Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Infection lytique par le KSHVInfection de novoKSHV acellulaireCellules HCT116Virus BAC16SpinoculationDosage GFPCytométrie en fluxPCR quantitativeRéplication virale
Etablissement et quantification de l’infection lytique de novo par l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi acellulaire
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.