Établissement et évaluation d’un modèle de rat diabétique présentant une artériosclérose oblittérante des membres inférieurs

Résumé

L’artériosclérose oblittérante des membres inférieurs est une complication courante du diabète sucré. Ici, nous présentons une nouvelle méthode de modélisation animale qui simule la progression de la maladie occlusive athéroscléreuse en injectant de l’éthanol dans les vaisseaux sanguins afin de perturber la structure vasculaire, offrant ainsi une nouvelle base pour le traitement des maladies vasculaires.

Résumé

Cette étude visait à établir et valider un nouveau modèle chez les rats de l’artériosclérose oblittérante des membres inférieurs (ASO) chez les rats diabétiques. Contrairement à la ligature traditionnelle de l’artère fémorale, nous avons injecté 95 % d’éthanol (0,1 mL) dans l’artère iliaque externe. Après l’opération, l’occlusion artérielle et l’ischémie du membre postérieur ont été évaluées les jours 1, 3, 7 et 14 à l’aide d’échographies Doppler, d’imagerie thermique et de mesures du poids musculaire humide. Une analyse histologique des vaisseaux sanguins et des tissus musculaires a été réalisée pour évaluer le taux de réussite et la stabilité du modèle. Une forte concentration d’éthanol (95 %) induit des lésions vasculaires des cellules endothéliales, entraînant une occlusion de l’artère fémorale. Comparé au groupe témoin, l’échographie Doppler a révélé une réduction progressive du diamètre artériel et une augmentation du débit dans le membre affecté. L’imagerie thermique a montré une diminution de la température des membres, tandis que la mesure du poids musculaire a montré une réduction significative de la masse musculaire ipsilatérale. L’analyse histopathologique a confirmé l’occlusion artérielle de la lumière, une diminution de la densité microvasculaire et une exacerbation progressive des lésions au fil du temps. En conclusion, l’injection de 95 % d’éthanol dans l’artère iliaque reproduit efficacement les caractéristiques physiopathologiques de l’occlusion artérielle des membres inférieurs, fournissant un nouveau modèle pour étudier l’artériosclérose oblittérante chez les rats diabétiques.

Introduction

L’occlusion artérielle des membres inférieurs (DLEAO) chez le diabète est une cause majeure d’incapacité et de mortalité chez les patients diabétiques, altissant gravement la qualité de vie et imposant un fardeau socioéconomique^{important 1}. La pathogenèse de la maladie artérielle diabétique implique des interactions complexes entre l’hyperglycémie, la dyslipidémie, l’inflammation chronique et le dysfonctionnement^{vasculaire 2}. Les modèles animaux ont joué un rôle clé dans l’élucidation de ces mécanismes, fournissant des perspectives cruciales pour le développement thérapeutique. Les modèles animaux servent d’outils précieux pour simuler la physiopathologie de la maladie artérielle périphérique (MAP) chez les patients diabétiques humains. Ces modèles permettent des études à haut débit et reproductibles pour étudier la progression de la maladie et élucider les mécanismes sous-jacents. De plus, les essais précliniques utilisant des modèles animaux fournissent des données essentielles pour de nouvelles thérapies, notamment des agents pharmacologiques, la thérapie génique et les approches de médecine régénérative (par exemple, la thérapie par cellules souches⁾³. De telles recherches fondamentales sont essentielles pour éclairer les essais cliniques ultérieurs et faire progresser la médecine translationnelle.

Actuellement, la méthode de ligature des artères fémorales (FAL) est largement utilisée en laboratoire pour établir des modèles chez le rat d’ischémie du membre^{postérieur 4}. Cette approche induit rapidement des manifestations ischémiques dans les membres^{inférieurs 5} ; cependant, la thrombose artérielle qui en résulte diffère de la progression physiopathologique observée chez les patients diabétiques atteints de maladie artérielle des membres inférieurs (LEAD), qui implique une lésion endothéliale, l’accumulation de facteurs inflammatoires et la prolifération des cellules musculaires^{lisses 2,6}. De plus, le FAL déclenche une néovascularisation rapide et la formation de vaisseaux collatéraux, rétablissant une perfusion à faible débit peu après le modélisation ^5,7. Cela contraste avec la progression chronique du LEAD diabétique. Il est donc nécessaire de développer un modèle animal qui reproduise plus fidèlement les mécanismes physiopathologiques de l’artériosclérose humaine.

Dans les modèles animaux diabétiques, une lésion mécanique de l’artère fémorale intime par cathéter ballonnet ou induction chimique (par exemple, stimulation au chlorure ferrique) déclenche efficacement des modifications pathologiques, notamment la dénudation endothéliale, l’infiltration des cellules inflammatoires et la migration/prolifération des cellules musculaires^{lisses 8}. Cette approche reproduit mieux les caractéristiques pathologiques caractéristiques de l’athérosclérose humaine. Comparé au modèle FAL traditionnel, l’avantage principal de la méthode induite à l’éthanol réside dans sa capacité à simuler avec plus de précision le processus pathophysiologique complexe du LEAD chez le diabétique. L’éthanol perturbe directement l’endothélium vasculaire, activant l’agrégation plaquettaire et la thrombose, imitant ainsi l’événement initial du LEAD⁹ diabétique. Plus important encore, en détruisant progressivement la microstructure vasculaire, l’éthanol évite efficacement la compensation rapide de la circulation collatérale couramment observée dans le modèle FAL, reproduisant ainsi avec succès l’état d’hypoperfusion chronique typique du LEAD¹⁰ diabétique. En revanche, le modèle d’ischémie induite par ligature de l’artère fémorale présente des limites notables : les rongeurs (par exemple, souris, rats) compensent rapidement l’ischémie aiguë grâce à leur circulation collatérale bien développée, ce qui entraîne une sévérité ischémique incohérente et une mauvaise réexposition de l’ischémie critique du membre humain (CLI^)11,12. De plus, la maladie arthérale périphérique humaine (PAP) provient principalement de la progression chronique de l’athérosclérose, tandis que le modèle de ligature de l’artère fémorale représente un événement ischémique aigu — des mécanismes physiopathologiques fondamentalement^{distincts 13}. L’objectif principal de cette étude était d’établir et de caractériser un modèle expérimental stable et à long terme de l’artériosclérose oblittérante du membre inférieur diabétique (LEAOD) qui imite avec précision la progression de la maladie chez les patients. L’occlusion induite par l’éthanol est opérationnellement simple, nécessitant seulement une injection peu invasive, ce qui réduit la barrière technique et la mortalité animale. Ses paramètres clés sont facilement standardisables, garantissant une grande reproductibilité. De plus, la méthode est économique, élimine le besoin d’équipements spécialisés et est facilement transférable entre les laboratoires. Actuellement, il manque encore des modèles animaux durables pour valider de nouvelles interventions thérapeutiques.

Protocole

Cette étude a été menée selon un protocole approuvé par le Comité d’éthique animale de l’hôpital Yantai Yuhuangding. Cette étude a utilisé 40 rats mâles de Sprague-Dawley (poids : 250-300 g, âge : 6 semaines) hébergés sous un cycle clair/sombre de 12 heures. À partir de 7 semaines, ils ont été nourris avec un régime riche en graisses et riche en saccharose¹⁴^,¹⁵ ad libitum, avec un accès gratuit à l’eau pendant 8 semaines. Au bout de 4 semaines de régime, le diabète a été induit par injection de streptozotocine (STZ)¹⁶. Après 8 semaines, l’établissement réussi du modèle diabétique a été confirmé avant les expériences ultérieures. Une chirurgie d’occlusion artérielle du membre postérieur a été réalisée sur des rats âgés de 14 semaines comme décrit ci-dessous.

1. Induction chirurgicale de l’artériosclérose oblittérante des membres postérieurs chez les rats diabétiques

1. Préparez tous les instruments et matériaux chirurgicaux comme indiqué dans le tableau des matériaux et illustré à la Figure 1.
2. Anesthésiez le rat à l’aide d’une machine anesthésiante délivrant de l’isoflurane (1,5-2,5 %) et de l’oxygène (O₂, 1-2 L/min). Maintenez une respiration spontanée tout au long de la période. Évaluez la profondeur de l’anesthésie via le réflexe de pincement des orteils afin d’assurer un plan d’anesthésie chirurgicale.
3. Placez le rat en position couchée sur une plateforme de contention. Enlever les poils de l’abdomen vers les membres inférieurs à l’aide d’une crème dépilatoire et d’une lame de rasoir.
4. Sécurisez les membres. Désinfectez la peau des membres postérieurs avec de l’alcool. Faites une incision de 2 à 3 cm sur la cuisse médiale droite à l’aide de pinces et de ciseaux courbés.
   REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées par un chirurgien expérimenté afin d’assurer la cohérence et la reproductibilité des modèles animaux.
5. Au microscope, disséquez les tissus environnants pour exposer l’artère/veine iliaque externe et le nerf fémoral. Isole les vaisseaux et le nerf. Retrace l’artère iliaque externe jusqu’à sa bifurcation en artères fémorales superficielles et profondes.
6. Pincez le segment central de l’artère fémorale et l’artère fémorale profonde avec des clips vasculaires. Injectez lentement 0,1 mL d’éthanol à 95 % dans l’artère iliaque externe distale. Après 60 s, retirez les clips ; Atteindre l’hémostasie par compression. Fermez la plaie strate par couche.
   REMARQUE : Lors de l’injection, un blanchiment immédiat de l’artère et un tremblement transitoire du pied ipsilatéral ont été observés, confirmant une administration intravasculaire réussie d’éthanol.
7. Ne pas immobiliser le membre affecté après l’opération. Administrez une injection intramusculaire de pénicilline sodique (400 000 UI) pour prévenir l’infection.
   REMARQUE : Dans ce modèle unilatéral d’occlusion artérielle du membre inférieur, le membre controlatéral sert de témoin. Le temps d’occlusion est calculé à partir de 24 heures après l’intervention.

2. Détermination de la température du membre inférieur

1. Anesthésiez le rat et placez-le en position couchée sur la plateforme chirurgicale.
2. Rase les deux membres postérieurs et positionne-les de façon symétrique.
3. Mesurez la température des deux membres postérieurs à l’aide d’un système de thermographie infrarouge.

3. Diamètre artériel et vitesse de circulation sanguine

1. Anesthésiez le rat.
2. Préparez le système d’échographie et la sonde.
   1. Allumez l’échographie en appuyant sur le bouton d’alimentation sur le panneau avant.
   2. Sélectionnez la sonde à réseau linéaire haute fréquence (par exemple, 40 MHz) et connectez-la au système.
   3. Appliquez une bonne quantité de gel acoustique sur la surface de la sonde.
3. Localiser l’artère fémorale superficielle.
   1. Placez le rat en position couchée sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle.
   2. Raser la fourrure de la cuisse médiale bilatéralement, à environ 1 à 2 cm au-dessus de l’articulation du genou, à l’aide d’une tondeuse électrique.
   3. Placez doucement la sonde perpendiculairement à la surface de la peau sur la zone rasée.
   4. Ajustez la position de la sonde en mode B pour visualiser l’artère fémorale comme une structure tubulaire pulsatile et anéchoïque.
4. Mesurez le diamètre artériel.
   1. Figez l’image en mode B en appuyant sur le bouton Freeze sur la machine ou l’interface logicielle.
   2. Sélectionnez l’outil Mesure dans le menu à l’écran.
   3. Utilisez la fonction de l’étrier pour mesurer le diamètre interne de la paroi proche à la paroi éloignée de l’artère.
   4. Répétez la mesure trois fois au même endroit et notez la valeur moyenne.
5. Mesurez la vitesse du flux sanguin.
   1. Passez en mode Doppler à onde pulsée en cliquant sur l’icône Doppler PW .
   2. Placez la porte d’échantillon au-dessus du centre de la lumière de l’artère.
   3. Ajustez l’angle Doppler à ≤ 60° en utilisant l’outil de correction d’angle.
   4. Appuyez sur Mettre à jour ou Capturer pour enregistrer la forme d’onde de vitesse sur au moins trois cycles cardiaques.
   5. Utilisez la fonction de traçage automatisée du logiciel pour calculer la vitesse systolique maximale (PSV) et la vitesse en fin de diastolie (EDV).
   6. Sauvegardez les données en cliquant sur Enregistrer et en exportant les résultats dans un fichier tableau (par exemple, CSV, Excel).

4. Pesée musculaire

1. Après une anesthésie profonde, euthanasiez le rat par luxation cervicale.
2. Disséquez les muscles gastrocnémiens des deux membres postérieurs, préservant ainsi les tendons d’Achille (Figure 2).
3. Placez immédiatement les muscles sur une balance électronique pour mesurer le poids mouillé.
4. Utilisez les muscles controlatéraux comme témoins.
5. Comparez les mesures de quatre points temporels et présentez-les dans un graphique de courbes.

5. Analyse histopathologique

1. À chacun des quatre moments chronologiques, euthanasiez rapidement un groupe de rats.
2. Prélèvez immédiatement les artères superficielles bilatérales fémorales.
3. Fixez les tissus artériels avec 4 % de paraformoldéhyde.
4. Insérez les tissus dans la paraffine et coupez-les à une épaisseur de 5 μm.
5. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour examiner les changements histopathologiques.

6. Analyse statistique

1. Exprimez toutes les données en moyenne ± écart-type (DE). Considérons des différences statistiquement significatives à une valeur p de <0,05.

Résultats

Cette étude a utilisé l’injection intra-artérielle d’éthanol pour établir un modèle chez les rats SD diabétiques (n = 40). Le modèle se caractérisait par un taux de réussite de 85 % (33/40), basé sur la confirmation ultrasonique d’une réduction du diamètre artériel controlatéral et de la vitesse du flux sanguin dans les 14 jours suivant l’injection. Un taux de mortalité lié au modèle de 8 % (5/40) a été enregistré, principalement durant la période initiale. Bien que la cytotoxicité de l’éthanol présente un risque de domm...

Discussion

En résumé, nous avons réussi à établir un modèle chez le rat d’occlusion artérielle progressive qui imite étroitement les manifestations cliniques observées chez les patients diabétiques. Des évaluations cohérentes de l’hypoperfusion du membre postérieur ont été réalisées par des mesures ultrasonographiques et des évaluations du poids humide musculaire pour des périodes dépassant deux semaines. La ligature de l’artère fémorale a induit une occlusion vasculaire superficielle, tout en perm...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GraphPad version 8.0.1			RRID : SCR_002798
Thermomètre infrarouge à base de téléphone	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Rat de Sprague-Dawley	Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.		250 g
Appareil à ultrasons	Vevo 2100