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Article de méthode

Intégration de la pharmacologie en réseau pour étudier l’effet protecteur de la cinnamaldéhyde contre la neurotoxicité induite par l’oxaliplatine

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DOI :

10.3791/69013

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28 novembre 2025

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1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette étude étudie les effets protecteurs de la cinnamaldéhyde (AC) contre les lésions induites par l’oxaliplatine (OXA) dans les cellules ganglionnaires de la racine dorsale (DRG) de rat. Le mécanisme sous-jacent implique la suppression de la voie de signalisation JAK2/STAT3 et l’activation de la voie SLC7A11-GSH-GPX4, telle que révélée par la pharmacologie en réseau et la validation expérimentale.

Résumé

Cette étude étudie les effets protecteurs de la cinnamaldéhyde (AC) contre les lésions induites par l’oxaliplatine (OXA) dans les cellules ganglionnaires de la racine dorsale (DRG) de rat. Les activités pharmacologiques de l’AC ont été analysées, et ses cibles potentielles, ainsi que celles de ses métabolites, ont été identifiées à l’aide de la base de données et de l’analyse des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP), de la plateforme de recherche en réseau basée sur la pharmacologie intégrative de la médecine traditionnelle chinoise (TCMIP) et des plateformes PharmMapper. Le test CCK-8 est utilisé pour déterminer les concentrations optimales des médicaments, tandis que des tests au malondiadéhyde (MDA) sont appliqués pour évaluer le niveau de peroxydation lipidique. Les niveaux intracellulaires de Fe2+ et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été quantifiés à l’aide de sondes fluorescentes. L’impact de la CA sur les niveaux d’expression des protéines, y compris p-STAT3, XCT et GPX4, dans les cellules DRG traitées à OXA a été examiné par immunoblotting. L’analyse pharmacologique en réseau a identifié 14 cibles qui se chevauchent parmi la « douleur neuropathique (NP)-ferroptose ». Les résultats expérimentaux ont montré qu’un traitement de 24 heures avec 4,0 μmol/L CA produisait des effets optimaux, réduisant significativement les niveaux de MDA, Fe2+ et ROS dans les cellules DRG (P < 0,05). De plus, le traitement par AC a sous-régulé l’expression de JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 et le facteur nucléaire-kappa B (NF-κB) (P < 0,05) tout en augmentant l’expression de XCT, GPX4 et FTH1 (P < 0,05). Ces résultats suggèrent que la CA atténue les dommages induits par l’OXA dans les cellules DRG en inhibant la voie de signalisation JAK2/STAT3 et en activant l’axe SLC7A11-GSH-GPX4.

Introduction

Ces dernières années, la ferroptose, en tant que mode de mort cellulaire non apoptotique, a été prouvée impliquée dans les lésions tissulaires induites par divers médicaments chimiothérapeutiques. Le mécanisme central de la ferroptose est l’accumulation de produits de peroxydation lipidique dépendants dufer 1. Les recherches sur les mécanismes de la neurotoxicité du cisplatine révèlent que ce médicament induit la ferroptose neuronale par plusieurs voies, ce processus étant directement lié au développement de la neurotoxicité. Plus précisément, le cisplatine inhibe l’activité de la glutathion peroxydase 4 (GPX4). En tant que « molécule de frein » critique dans la ferroptose, l’inactivation de GPX4 empêche l’élimination des hydroperoxydes lipidiques (L-OOH), causant ainsi des dommages oxydatifs aux membranes cellulairesneuronales 2. Par ailleurs, l’oxaliplatine peut favoriser la libération de ferroptose dans les cellules nerveuses et aggraver la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) via la réaction de Fenton, amplifiant ainsi la cascade deferroptose 3. Ces preuves suggèrent que la régulation ciblée de la neurodégénérescence pourrait être une stratégie potentielle pour atténuer la neurotoxicité de l’oxaliplatine.

L’oxaliplatine (OXA), un agent chimiothérapeutique de troisième génération à base de platine largement utilisé pour le cancer colorectal, offre une efficacité antitumorale robuste mais est fréquemment associé à une neurotoxicité significative. L’administration chronique conduit souvent à une douleur neuropathique induite par l’OXA (OINP), avec un taux d’incidence atteignant 60 %, caractérisée par une allodynie mécanique, une hyperalgésie thermique et une hypersensibilité aufroid 5. Malgré sa prévalence, les stratégies de traitement actuelles pour l’OINP restent inadéquates, ce qui diminue considérablement la qualité de vie des patients. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes moléculaires sous-jacents à l’OINP et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques restent des domaines critiques de la rechercheen cours 6.

La cinnamaldéhyde (AC), constituant actif principal de l’huile essentielle de cannelle, est un liquide jaune etvisqueux 7,8 aux activités biologiques variées, notammentinsecticide 9,antimicrobien 10, antifongique11,antioxydant 12, antidiabétique13,anticancéreux 14, anti-inflammatoire et effets protecteursneurovasculaires 15,16. Les preuves émergentes suggèrent que la CA pourrait inhiber l’activation de la voie de signalisationJAK/STAT 17. La formule chimique de la CA est C9H8O, et sa structure chimique est illustrée à la Figure 1. En tant que monomère naturel de la médecine traditionnelle chinoise, l’AC présente un large éventail d’activités pharmacologiques. En matière de neuroprotection, plusieurs études ont confirmé que la CA peut pénétrer dans le système nerveux central par la barrière hémato-encéphalique, favoriser l’expression d’enzymes antioxydantes (telles que HO-1 et NQO1) en activant la voie de signalisation Nrf2/AR, réduire l’accumulation de ROS dans les cellules nerveuses, et ainsi atténuer les dommages neuro-oxydatifs lors de l’AVC ischémique. La maladie d’Alzheimer, et d’autresmaladies 18,19. Parallèlement, l’AC peut inhiber l’hyperactivation de la microglie, réduire la libération de facteurs inflammatoires (tels que TNF-α, IL-1β) et diminuer la réponseneuro-inflammatoire 20. Cependant, il n’a pas été rapporté que l’AC puisse atténuer la neurotoxicité induite par l’oxaliplatine en régulant la voie de la ferroptose.

La voie de signalisation JAK2/STAT3 est un mécanisme important de transduction intracellulaire du signal qui transmet les signaux reçus à la membrane cellulaire vers le noyau cellulaire, et est étroitement liée à des processus biologiques clés tels que la prolifération cellulaire, la différenciation, l’apoptose, le stress oxydatif et les réponsesinflammatoires 21. En tant que voie étroitement liée aux réponses inflammatoires, la voie de signalisation JAK3/STAT3 peut déclencher des réponses inflammatoires à un état activé, entraînant des lésions inflammatoires tissulaires. Des études indiquent que l’inhibition de la voie de signalisation JAK3/STAT3 peut réduire la réponse inflammatoire et les dommages oxydatifs chez les rats atteints de démence vasculaire, améliorant ainsi la fonction cognitive desrats 22. De plus, inhiber la voie de signalisation JAK3/STAT3 peut également atténuer la réponse inflammatoire chez les rats épileptiques, réduire le taux d’apoptose neuronale et atténuer les lésionscérébrales 23. Bien que l’acide caféique (AC) ait un certain effet protecteur sur le système nerveux, il n’est pas encore clairement conclu si son effet d’amélioration est lié à la régulation de la voie de signalisation JAK3/STAT3.

Cette étude vise à valider si l’inhibition in vitro de la signalisation JAK2/STAT3 et l’activation de l’axe LC7A11-GSH-GPX4 peuvent atténuer les dommages induits par l’OXA dans les cellules DRG de rat. De plus, il explore les effets anti-ferroptotiques potentiels de l’AC et examine le rôle des cibles clés identifiées par la pharmacologie en réseau dans la modulation de l’inflammation dans les cellules DRG.

Les approches thérapeutiques actuelles pour la neurotoxicité induite par l’oxaliplatine se concentrent principalement sur la chélation des ions platine libres pour atténuer les lésions nerveuses, comme l’utilisation de complexes calcium-magnésium, avec pour objectif principal d’atténuer les neuropathies périphériques aiguës (par exemple, engourdissements et picotements dans les mains et les pieds)24. Cependant, les mécanismes exacts restent flous. Ces traitements manquent de capacité à inverser des affections chroniques telles que la dégénérescence axonale et la détérioration des fibres nerveuses causées par l’oxaliplatine, et démontrent une efficacité limitée dans la prévention de la neurotoxicité cumulative. Dans cette expérience, l’effet neuroprotecteur de 4 μM de CA sous traitement à 5 μM d’OXA a été exploré en combinant des mécanismes anti-inflammatoires et anti-ferroptose. Les résultats confirment que l’activation de ce mécanisme constitue une étape d’initiation critique dans l’OINP. La découverte d’inhibiteurs spécifiques pourrait remplacer les approches non spécifiques existantes, améliorant ainsi à la fois la précision et l’efficacité des interventions thérapeutiques.

Le modèle in vitro utilisé dans cette expérience implique des neurones ganglionnaires dorsaux (DRG) isolés de rats pour étudier l’OINP. Cependant, ce modèle diffère significativement des cellules primaires humaines par son fond génétique, ses caractéristiques métaboliques et sa sensibilité à la toxicité, ce qui peut rendre les conclusions de recherche difficiles à appliquer directement en clinique. De plus, le maintien fonctionnel des tissus neuronaux in vivo repose sur une régulation précise de la coordination multicellulaire et des microenvironnements dynamiques – des facteurs complexes qui sont difficiles à reproduire pleinement des modèles in vitro .

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Protocole

REMARQUE : La lignée cellulaire a été dérivée de lignées cellulaires de rats.

1. Analyse de pharmacologie des réseaux

REMARQUE : Les liens se trouvent dans le tableau des matériaux.

  1. Trouver des cibles possibles de l’AC
    1. Récupérez les informations structurelles de la base de données PubChem et explorez les mécanismes biologiques potentiels de l’AC. Ensuite, réalisez l’analyse de prédiction des cibles en utilisant SwissTargetPrediction, en tirant parti de ses capacités informatiques avancées.
    2. Pour améliorer la précision et l’exhaustivité de l’analyse, croisez les cibles prédites avec des bases de données spécifiques à la médecine traditionnelle chinoise, y compris TCMSP et TCMIP.
    3. Examinez la littérature pertinente pour identifier d’autres cibles potentielles. Dupliquez la liste de cibles consolidée pour créer un ensemble de données complet, servant de référence essentielle pour d’autres études d’activité biologique et le développement de médicaments impliquant l’AC.
  2. Identification des cibles potentielles de la douleur neuropathique (NP)
    1. En utilisant la base de données GeneCards et la base de données TTD, effectuez une recherche approfondie en utilisant les mots-clés « douleur neuropathique » et « ferroptose ». Prioriser les cibles géniques issues de la base de données GeneCards avec un « score de pertinence » supérieur à la médiane, car ces gènes démontrent une pertinence plus élevée pour le focus de recherche.
    2. Intégrez les cibles génétiques précédemment sélectionnées avec les données extraites de la TTD (Therapeutic Target Database). Assurez une identification complète des cibles potentielles lors du processus d’intégration en croisant toutes les cibles génétiques sélectionnées avec les entrées de la base de données TTD. Supprimez systématiquement les entrées dupliquées du jeu de données intégré des cibles géniques. Vérifiez que l’ensemble de données résultant contient une liste unique de cibles potentielles.
  3. Identification des cibles d’intersection de la « CA-NP- Ferroptose »
    1. Déterminez l’intersection des cibles pour l’AC, la NP et la ferroptose à l’aide d’un diagramme de Venn généré en ligne.
    2. Ces cibles d’intersection ont été désignées comme candidates potentielles pour la « voie NP-ferroptose régulée par CA ».
  4. Construire le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP)
    1. Pour approfondir l’enquête, soumettez les cibles communes pour « CA-NP-ferroptose », « CA-NP » et « CA-ferroptose » à la base de données STRING.
    2. Fixez le seuil de score d’interaction à « la plus haute confiance > 0,4 » et restreignez le nombre maximal d’interacteurs à 10 pour les première et deuxième couches d’interaction. Appliquez les paramètres par défaut pour tous les autres paramètres, et construisez un réseau PPI à 4,5 pour la « CA-NP-ferroptose ».
  5. Analyses d’enrichissement GO et KEGG
    1. Téléchargez les cibles d’intersection pour la « CA-NP-ferroptose » sur la plateforme DAVID avec les paramètres suivants : « sélectionner l’identifiant : symbole génique officiel », « type de liste : généliste » et « espèce : Homo sapiens ». L’analyse d’enrichissement de l’ontologie génique (GO) a été réalisée dans trois catégories : processus biologique (BP), composante cellulaire (CC) et fonction moléculaire (MF).
    2. Effectuez l’analyse d’enrichissement des voies KEGG et visualisez les données résultantes à l’aide de diagrammes en barres créés sur la plateforme Hiplot.

2. Amarrage moléculaire

  1. Pour élucider l’interaction entre les composés actifs et leurs cibles associées à la maladie, obtenez des informations structurales sur les substances actives à partir de la base de données PubChem sous forme de petites molécules, tout en récupérant les structures 3D des protéines cibles à partir de la Protein Data Bank (PDB) sous forme de modèles protéiques.
  2. Utilisez PyMOL pour prétraiter les structures des récepteurs protéiques en retirant les molécules d’eau et les ligands non essentiels. Ensuite, préparez les protéines cibles et les substances actives pour l’amarrage avec AutoDock Tools 1.5.7, et exécutez un amarrage moléculaire semi-flexible avec AutoDock Vina.
  3. Analysez les énergies de liaison et les sites actifs de liaison des substances sur les protéines réceptrices. Pour la protéine JAK2, sa structure (ID PDB : 3e64) a été sélectionnée à partir de la base de données PDB sur la base de données cristallographies aux rayons X et de la résolution optimale.
  4. Utilisez le logiciel PyMOL pour préparer la structure JAK2 en éliminant les ligands, en éliminant les molécules d’eau et en ajoutant des hydrogènes. Les structures de petites molécules des composés actifs proviennent de PubChem.
  5. Chargez à la fois les structures protéiques et composées dans AutoDock Tools 1.5.7, définissez les boîtes d’amarrage et effectuez l’amarrage moléculaire avec AutoDock Vina.

3. Culture cellulaire

REMARQUE : Les étapes suivantes seront répétées dans l’expérience de validation. Respectez des techniques strictes d’aseptique. Cette partie de l’expérience utilisait une centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse.

  1. Désinfectez les emballages extérieurs et les flacons de cultures de cellules stériles achetées avec 75 % d’alcool, puis transférez dans des gamelles de culture sur un établi très propre pour la sous-culture jusqu’à ce que les cellules soient réparties sur cinq boîtes de Petri de 10 cm de diamètre pour garantir un stock cellulaire suffisant.
  2. Cryopréservation des cellules à -80 °C pour les expériences ultérieures.
    1. Préparez le DMEM, le DMSO de qualité culture cellulaire, le sérum bovin fœtal (FBS), des tubes centrifugeuses de 15 mL, des pipettes, des cryoviaux et un bain de glace. Mélangez 1 mL de DMSO, 1 mL de FBS et 8 mL de DMEM pour obtenir un volume total de 10 mL. Laissez refroidir le DMSO sur la glace pendant 15 minutes. Commencez par transférer le milieu de base dans le tube centrifugeuse, puis ajouter lentement le DMSO pré-refroidi en tournant. Mélangez soigneusement avec une pipette, puis ajoutez doucement le FBS et mélangez à nouveau. Conservez le mélange dans le bain de glace pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE : Une concentration de 20 % à 50 % de DMSO a entraîné une augmentation significative de la libération de LDH, indiquant que de fortes concentrations de DMSO sont cytotoxiques, tandis que 10 % de DMSO sont relativement sûres. Cela n’a pas affecté notre expérience25.
    2. Prenez des cellules en croissance logarithmique, lavez-les 3 fois avec du PBS, puis ajoutez 0,25 % de trypsine à 400 μL/10 cm de réciproque.
      REMARQUE : Une fois la rétraction cytoplasmique effectuée, les connexions se desserrent ou s’il y a des signes de flottement à grande échelle, le processus de digestion est immédiatement arrêté.
    3. Préparation avant la digestion : Préchauffer les réactifs clés (solution de trypsine-EDTA à 0,25 % et milieu complet DRG) à 37 °C. Retirez la fiole de culture cellulaire de l’incubateur et jetez l’ancien milieu à l’aide d’une pipette stérile pour éviter que le milieu résiduel n’affecte l’efficacité digestive. Rincez doucement les cellules cultivées en couche unique deux fois avec 5 mL de PBS stérile pour éliminer le sérum résiduel tout en évitant l’élution cellulaire.
    4. Ajoutez 2 mL de solution préchauffée de trypsine-EDTA à 0,25 % dans le récipient de culture, afin de recouvrer complètement la couche cellulaire unique. Incubez à température ambiante pendant 1 à 3 minutes. Pendant cette période, observez les cellules au microscope inversé tous les 30 s. Arrêtez immédiatement la digestion lorsque la plupart des cellules commencent à se contracter, à devenir rondes et à montrer des espaces intercellulaires distincts (pour éviter la surdigestion et les dommages cellulaires).
    5. Ajoutez rapidement 4 mL de substrat entièrement préchauffé dans le récipient de culture. Pipettez doucement le mélange cinq fois avec une pipette stérile pour disperser le groupe cellulaire en une suspension monocellulaire. Transférez l’ensemble de la suspension monocellule dans des tubes centrifugeuses stériles de 15 mL et collectez la pelote par centrifugation à 300 x g 5 min à l’aide d’une centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse à 25 °C.
    6. Jetez le surnageant et ajoutez 5 mL de milieu de cryoconservation préparé. Soufflez doucement avec une pipette pour mélanger les cellules uniformément. Répartissez-les également en 5 flacons.
    7. Étiquetez le cryovial avec le nom de la cellule, la date de congélation et l’opérateur ; Placez-le dans un récipient congelant et conservez-le dans un congélateur à -80 °C, puis transférez-le en azote liquide après une nuit de stockage.
  3. Réanimation cellulaire
    1. Portez des gants, retirez le flacon du contenant d’azote liquide, puis immergez-le immédiatement dans de l’eau tiède à 37 °C tout en le secouant de temps en temps pour assurer un dégel rapide (en moins d’une minute).
    2. Retirez le flacon du bain marie à 37 °C, ouvrez le bouchon, aspirez la suspension cellulaire avec une pipette, transférez-la dans un tube centrifugeuse, ajoutez 10 fois le volume de milieu de culture, mélangez bien, puis centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes (25 °C).
    3. Éliminer le surnageant, ajouter 5 mL de milieu de culture complété avec un sérum bovin fœtal à 10 % (le milieu complet pour cette condition de culture cellulaire), inoculer la boîte de culture et incuber statiquement dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % deCO-2 .
    4. Remplacez le milieu de culture le lendemain (pour éliminer les résidus de DMSO et les cellules mortes), et continuez à observer la culture pour détecter les conditions de croissance. Si la densité cellulaire est élevée, effectuer rapidement une sous-culture pour les expériences ultérieures.
  4. Comptage cellulaire
    REMARQUE : Cette partie de l’expérience utilisait une centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse.
    1. Préparez à 75 % d’alcool à l’avance pour nettoyer la chambre de comptage et couvrir la barbe, puis séchez les objets pour une utilisation ultérieure.
    2. Resuspendez les cellules digérées et centrifugées dans 1 mL de milieu, puis diluez 50 μL de la suspension cellulaire avec 150 μL de milieu dans un tube EP de 1,5 mL pour effectuer une dilution quadruple.
    3. Oscillez uniformément, prenez 10 μL, et injectez entre le couvercle et la chambre de comptage pour remplir complètement la chambre tout en évitant les bulles. Placez sous le microscope pour observation et comptage. Principes de comptage : Ne pas omettre ni recompter ; Comptez les cellules touchant les bordures supérieure et gauche, mais excluez celles touchant les bordures inférieure et droite.
    4. Selon les exigences expérimentales, calculer le volume cellulaire en fonction du nombre de cellules souhaité pour le plaquage ou l’ensemencement de la vaisselle et les résultats du comptage, puis compléter le volume total du milieu par un milieu complet.

4. Protocole de test de viabilité cellulaire

REMARQUE : La duloxétine a été sélectionnée comme agent témoin de la médecine occidentale car c’est un médicament largement utilisé et cliniquement validé pour le traitement de la douleur neuropathique périphérique. Son efficacité établie dans cette indication (soutenue par des recommandations cliniques et des essais contrôlés randomisés) garantit que le groupe témoin peut fournir une référence fiable pour évaluer l’efficacité relative de l’intervention testée.

  1. D’abord, retirez l’ancien milieu de culture du récipient de culture et rincez la surface cellulaire avec 5 mL de PBS pour éliminer le sérum résiduel. Ensuite, ajoutez 2 mL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % et faites couver à température ambiante pendant 1 à 3 minutes. Lorsque l’observation microscopique révèle un rétrécissement cellulaire, un arrondi et un décollement, ajoutez immédiatement 4 mL de milieu complet DRG pour interrompre la digestion et resuspendre les cellules par pipetage.
  2. Transférez la suspension de la cellule dans un tube centrifugeuse et collectez la pellete de la cellule en centrifugant à 300 x g pendant 5 minutes à l’aide d’une centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse à 25 °C. Jetez le surnageant et remettez la pastille de cellule dans un tube centrifugeuse de 15 mL, puis resuspendez soigneusement et mélangez la suspension.
  3. Prenez un tube EP de 1,5 mL, puis ajoutez d’abord 150 μL de milieu de culture, suivi de 50 μL de suspension cellulaire. Mélangez bien pour obtenir une dilution quadruple.
  4. Ensuite, utilisez de l’alcool à 75 % pour nettoyer la chambre de comptage et couvrir le verre, séchez-les, puis secouez à nouveau le tube EP uniformément.
  5. Retirez 10 μL de suspension à cellules et injectez-les entre le verre de couverture et la chambre de comptage, afin que le liquide remplisse la chambre sans générer de bulles.
  6. Observez au microscope et comptez le nombre de cellules selon le principe de comptage, en évitant les omissions ou les doublons.
    REMARQUE : Si le nombre de cellules compté est n, alors la concentration de cellules dans le tube centrifugeuse est n/mL.
  7. Selon les exigences expérimentales, il faut semer les cellules dans une plaque de 96 puits à une densité de 2 000 cellules par puits selon les besoins.
  8. D’abord, injectez 200 μL de PBS dans chaque puits du cercle périphérique d’une plaque à 96 puits, puis ajoutez un milieu de culture contenant des cellules selon le groupement.
  9. Après incubation dans l’incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % deCO 2 pendant 24 heures, aspirez l’ancien milieu et lavez deux fois avec 200 μL de PBS. Selon la configuration expérimentale, diluer la CA par étapes (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) et ajouter 200 μL à une plaque à 96 puits.
  10. Prétraiter les cellules avec OXA (5 μM) pendant 24 heures, puis traiter les cellules DRG avec des concentrations variables de CA (0 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 32 μM) pendant 24 heures, respectivement.
    REMARQUE : Cette section de l’expérience vise à déterminer la concentration optimale de médicament pour l’AC.
  11. Lavez la plaque à 96 puits trois fois avec un tampon PBS, puis ajoutez 200 μL de solution de travail CCK-8 fraîchement préparée à chaque puits. Cette étape s’effectue dans l’obscurité, et le temps de l’expérience est contrôlé pour être complété en moins de 10 minutes. Incubez la solution pendant 4 heures dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 . Enfin, mesurez les valeurs d’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques. Répétez toutes les expériences au moins trois fois dans des conditions identiques.

5. MDA

  1. Semez 10 ×10 cellules de 6 DRG dans un plat de 15 cm et cultivez toute la nuit dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 . Retirez le milieu de culture, ajoutez des médicaments et faites éclore pendant 24 heures dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 .
  2. Retirez le milieu de culture et lavez une fois avec 5 mL de PBS. Après la digestion, collectez les cellules dans un tube conique à l’aide d’un milieu DMEM.
  3. Ajoutez les cellules DRG traitées à des microtubes de 5 mL, respectivement. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes avec une centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse, puis retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 1 mL de PBS, mélangez par pipetage, puis transférez dans un nouveau microtube de 1,5 mL. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes avec une centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse, puis retirez le surnageant.
  4. Ajoutez 100 μL de solution antioxydante PBS, pipetez pour mélanger, puis préparez la suspension cellulaire. Préparez la solution standard MDA.
    REMARQUE : Voir la préparation de la solution standard de MDA utilisant la méthode de fluorescence ; se référer à la section « Composants du kit » pour des procédures détaillées.
  5. Ajoutez 100 μL de tampon de lyse au tube échantillon et au tube standard respectivement, puis mélangez soigneusement à l’aide d’un oscillateur vortex. Laissez-la reposer à température ambiante pendant 5 minutes.
  6. Ajoutez 250 μL de la solution de travail préparée à chaque tube, puis mélangez soigneusement à l’aide d’un mélangeur vortex. Chauffez le bain-marie à 95 °C dans un environnement naturel pendant 15 minutes, puis mettez-le dans le bain de glace pendant 5 minutes pour refroidir. Centrifugeuse à rotor angulaire à grande vitesse à 10 000 x g pendant 10 minutes (4 °C).
  7. Prenez 100 μL de surnageant et ajoutez-les à une plaque noire à 96 puits. Mesurez l’intensité de fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence (ex : 540 nm, Em : 590 nm). Calculez la concentration de MDA dans l’échantillon en fonction de la courbe standard.

6. Teneur en Fe2+ dans les cellules mesurée à l’aide d’unkit de détection Fe2+

  1. Préchauffez le bain-marie à l’avance et augmentez la température à 37 °C. Portez des gants, récupérez les cellules DRG de l’azote liquide, enveloppez-les dans une couche de sac plastique, puis plongez-les dans de l’eau tiède à 37 °C tout en les secouant doucement de temps en temps pour assurer une décongélation complète en 1 minute.
  2. Après décongélation, retirez la fiole du bain-marie à 37 °C, ouvrez le bouchon, aspirez la suspension de la cellule, transférez-la dans un tube centrifuge de 15 mL, puis ajoutez 10 mL de milieu de culture goutte par goutte, en mélangeant soigneusement. Centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse à 300 x g pendant 5 min (25 °C).
  3. Après centrifugation, jetez le surnageant, ajoutez 10 mL de milieu de culture frais, pipetez pour bien mélanger, puis centrifugez à nouveau. Répétez cette procédure 3 fois avant d’inoculer sur de nouvelles boîtes de culture.
  4. Cultivez les cellules statiquement dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 . Remplacez le milieu le lendemain pour éliminer les résidus de DMSO et les cellules mortes, puis continuez la culture. Si la densité cellulaire est élevée, sous-culture à temps. Ensuite, on collecte les cellules en phase de croissance logarithmique, on les digère, on centrifuge puis on les resuspend. Ensemencer les cellules en suspension dans des plaques à 12 puits à une densité de 70 % à 80 %, puis replacer les plaques dans l’incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 pour une culture ultérieure.
  5. Observez l’état cellulaire le lendemain, fournissez les traitements correspondants selon le dispositif expérimental, puis replacez-les dans l’incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % deCO-2 pour une culture continue.
  6. Après 24 heures d’administration du médicament, jetez le milieu de culture d’origine et lavez les cellules une fois avec du PBS. Ajoutez 300 μL/puits de sonde FerroOrange (1 μM) diluée dans du HBSS, et incubez à 37 °C, 95 % d’humidité, 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.
  7. Ensuite, ajoutez la solution de coloration des cellules vivantes Hoechst 33342 (100x) sur la plaque cellulaire dans un ratio de 1:100, incubez à température ambiante dans le noir pendant 5 minutes pour colorer les noyaux cellulaires.
  8. Observez l’effet de coloration au microscope à fluorescence et prenez des photographies pour la documentation. Ensuite, utilisez ImageJ pour calculer l’intensité moyenne de fluorescence, l’expérience étant répétée trois fois pour l’analyse statistique.

7. Kit de détection ROS

  1. Prenez les cellules en phase de croissance logarithmique, digérez-les, centrifuge-les et resuspendez-les, puis ensemencez les cellules dans une plaque de 12 puits à une densité (70 %-80 %). Après avoir bien mélangé les cellules, placez-les dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 pour poursuivre la culture.
    REMARQUE : Pour les étapes de digestion, centrifugation et resuspension, veuillez consulter l’étape 4.1.
  2. Observez l’état des cellules le lendemain, administrez les traitements correspondants selon le cadre expérimental, puis remettez les cellules dans l’incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % deCO2 pour poursuivre la culture. Après 24 heures d’administration du médicament, jeter le milieu de culture original et laver les cellules deux fois avec du HBSS.
  3. Ajoutez 200 μL de solution de travail à colorants DCFH-DA très sensible, puis incubez à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 pendant 30 minutes.
  4. Écartez le surnageant, lavez deux fois avec du HBSS, puis colorez avec 2 μL de solution de coloration Hoechst 33342 pour cellules vivantes (100x) pendant 5 minutes, puis examinez au microscope à fluorescence. Répétez l’expérience trois fois avec une analyse statistique.

8. Morphologie mitochondriale des cellules observées à l’aide des TEM

  1. Éliminez le milieu de culture des cellules bien cultivées, ajoutez 1 mL de solution fixative de glutaraldéhyde à 2,5 % à température ambiante, et fixez les cellules dans l’obscurité à température ambiante pendant environ 5 minutes. Grattez doucement les cellules dans une direction à l’aide d’un grattoir à cellules.
  2. Transférez la suspension à cellules dans un tube centrifugeuse et centrifugez à 25 °C, 600 x g pendant 3 minutes à l’aide d’une centrifugeuse à rotor horizontal à basse vitesse.
  3. Après avoir éliminé le surnageant de la solution fixative, ajoutez un nouveau fixateur de microscopie électronique (utilisez 1 mL par puits pour une plaque à 12 puits), fixez à température ambiante, loin de la lumière, pendant 30 minutes, puis transférez à 4 °C pour le stockage.
  4. Infiltration par déshydratation : Insérez l’échantillon dans la plaque d’incrustation et placez-le dans un four à 37 °C toute la nuit.
  5. Polymérisez le milieu d’immersion dans un four à 60 °C pendant 48 secondes. Coupez des sections ultrafines de 60 à 80 nm à l’aide d’un ultramicrotome.
  6. Colorez les sections avec une solution alcoolique saturée à 2 % d’acétate d’uranyle pendant 15 minutes, puis avec du citrate de plomb pendant encore 15 minutes. Séchez les parties teintées toute la nuit à température ambiante. Observez et photographiez les sections au microscope électronique à transmission.

9. Plaque western

  1. Extraire la protéine totale des cellules
    1. Traitez et inoculez les cellules dans une boîte de Petri de 6 cm jusqu’à atteindre 70 % de densité.
      REMARQUE : Consultez l’étape 3.3 pour les instructions sur la réanimation cellulaire et l’inoculation.
    2. Dans le plat de culture, ajoutez 3 mL d’OA (5 μM) et après 4 heures, ajoutez du CA (4 μM).
    3. Préparez à l’avance une boîte de glace, du PBS pré-refroidi, des grattoirs à cellules, un tampon de lyse préparé et plusieurs tubes EP étiquetés.
    4. Après le traitement médicamenteux, retirez le milieu de culture des cellules et lavez-les deux fois avec du PBS pré-refroidi. Effectuez ce processus sur de la glace et aspirez tout PBS résiduel à l’aide d’une centrifugeuse à vide.
    5. Étiquetez chaque boîte de Petri, puis ajoutez 300 μL de tampon de lyse et laissez-la reposer sur de la glace pendant 5 minutes avec une agitation constante pour éviter une lyse incomplète et la congélation.
    6. Ensuite, utilisez un grattoir à cellules pré-refroidies pour détacher les cellules adhérentes, en collectant 300 μL dans un tube EP après chaque grattage. Utilisez un grattoir à cellules neuves pour chaque grattage et ne le réutilisez pas.
    7. Tenez le dessus du tube EP et mélangez soigneusement sur un batteur vortex, puis continuez à le poser sur la glace pendant 25 minutes. À ce moment-là, allumez à l’avance la centrifugeuse à rotor angulaire à grande vitesse à 4 °C, car le pré-refroidissement de la centrifugeuse nécessite un certain temps.
    8. Après la fin du minuteur, un nouveau vortex, puis une centrifugeuse à rotor angulaire à grande vitesse à 4500 x g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse à 4 °C.
    9. Allumez maintenant le chauffage du bain sec et réglez la température à 100 °C.
    10. Sortez le kit de quantification des protéines BCA, ajoutez des échantillons et des réactifs à la plaque à 96 puits, mélangez bien, et réagissez dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % deCO-2 pendant 30 minutes. Mesurez la teneur en protéines extraite à l’aide d’un lecteur multifonction de microplaques, puis ajustez avec le tampon de lyse restant en fonction des résultats pour garantir que la concentration de chaque échantillon reste constante.
    11. Enfin, en fonction du contenu de chaque surnageant, ajoutez 1/5 de volume de 6× tampon de chargement pour préparer le système de chargement des protéines. Aspirez soigneusement 150 μL de surnageant dans un nouveau tube EP. Ajoutez 30 μL de tampon de charge 6× au surnageant et mélangez soigneusement (généralement à un ratio de 1:5). Conservez le mélange sur de la glace.
    12. Ensuite, chauffez à 100 °C sur un chauffage pendant 6 minutes, en veillant à bien maintenir le bouchon du tube EP enfoncé pour éviter qu’il ne s’ouvre. Après avoir chauffé, refroidissez-le dans un bain de glace.
  2. Préparez un gel protéique à 10 % de concentration.
    1. Rincez la plaque de gel à l’eau pure, séchez-la à l’air libre, essuyez l’excès d’humidité et évitez autant que possible les taches d’eau et la poussière.
    2. Retirez le support de gel pour mouler, avec les plaques courtes des deux plaques de verre à l’avant et les longues plaques à l’arrière, alignez le fond pour que l’espace entre les plaques de verre s’ajuste bien avec la bande de scellement en bas du support pour éviter les fuites, puis serrez les plaques solidement pour préparer le gel jet.
    3. Préparez le gel inférieur avec 6 mL d’eau pure, 3,75 mL de 1,5 M de Tris-HCl (pH 8,8), 0,15 mL de SDS à 10 %, 5 mL d’Acry/bis à 30 %, 75 μL de 10 % d’APS et 7,5 μL de TEMED.
    4. Faites doucement tourner pour éviter la mousse, puis ajoutez rapidement et uniformément entre les deux plaques de verre pour laisser de la place pour le gel supérieur. Ensuite, aplanez la surface du liquide avec 1 mL d’isopropanol et laissez-la reposer environ 30 minutes.
    5. Rincez le peigne pour la préparation en gel à l’eau pure, séchez à l’air libre, puis mettez de côté. Une fois que le gel inférieur s’est complètement solidifié, versez l’isopropanol, rincez soigneusement 2 à 3 fois avec de l’eau pure, absorbez le liquide, puis inversez la plaque de gel pour évacuer le reste du liquide.
    6. Préparez le gel d’empilement supérieur avec 6 mL d’eau pure, 2,5 mL de 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 mL de SDS à 10 %, 1,34 mL d’Acry/bis à 30 %, 50 μL d’APS à 10 % et 10 μL de TEMED.
    7. Remplissez la couche supérieure et insérez soigneusement un peigne de 15 puits et 1,5 mm d’épaisseur. Après 1 à 2 minutes, rechargez les espaces en veillant à minimiser la formation de bulles pendant ce processus. Utilisez un gel entièrement polymérisé.
  3. Électrophorèse en gel protéique
    1. Préconfigurez le tampon de fonctionnement et le tampon de transfert, avec le tampon de transfert pré-refroidi dans un réfrigérateur à 4 °C.
    2. Rincez le gel protéique avec de l’eau ultrapure, sortez un réservoir d’électrophorèse propre, pincez les deux plaques courtes du gel protéique vers l’intérieur et en face, versez le tampon courant, et vérifiez toute fuite.
    3. Retirez soigneusement le peigne, chargez 10 μL par puits avec un total de 4 groupes d’échantillons. Chargez 3 groupes échantillons par gel, séparés par un marqueur protéique de 4 μL entre chaque groupe, soit un total de 15 puits.
    4. Après avoir chargé les échantillons, versez tout le tampon de fonctionnement restant dans le réservoir d’électrophorèse, couvrez-le avec le couvercle, réglez la tension à 140 V, et effectuez une électrophorèse en tension constante pendant 20 minutes.
    5. Lorsque les bandes protéiques entrent dans le gel de séparation après la concentration, ajustez la tension à 120 V pour une électrophorèse en tension constante. Pendant ce processus, imbibez la membrane NC dans un tampon de transfert. Arrêtez l’électrophorèse lorsque le bleu de bromophénol indique que l’échantillon a atteint le bord inférieur du gel, et préparez-vous au transfert par membrane.
    6. Remplissez une boîte en mousse à moitié avec de la glace, retirez le collier de transfert, le tampon de transfert pré-refroidi et la membrane NC trempée. Verser la moitié du tampon de transfert dans un récipient carré plat.
    7. Retirez le gel protéiné, rincez-le soigneusement avec de l’eau ultrapure, placez le côté noir vers le bas et le côté transparent vers le haut. Au milieu, placez une couche d’éponge, une couche de papier filtre, le gel protéique, la membrane NC, puis placez une autre couche de papier filtrant et une éponge.
    8. Après avoir pressé pour enlever les bulles d’air, serrez la cassette de transfert et placez-la dans le réservoir de transfert. Une fois les deux gels protéinés complètement insérés, versez tout le tampon de transfert dans le réservoir de transfert, puis ajoutez deux poches de glace pour refroidir et couvrez avec le couvercle.
    9. Entourez la cassette de transfert de glace et transférez à une tension constante de 120 V pendant 90 minutes. Le processus de transfert génère une chaleur importante, donc un bain de glace est nécessaire pour le refroidissement.
    10. Retirez la membrane NC, immergez-la et colorez-la dans 20 mL de solution colorante Ponceau S, marquez la taille du marqueur avec un crayon, puis coupez la membrane au crayon selon la taille de la protéine cible à détecter.
    11. Récupérez la solution de coloration Ponceau S. Rince la solution de coloration avec du PBS et incube la membrane NC avec 20 mL de tampon de blocage, puis bloque à température ambiante sur un shaker à basse vitesse pendant 1 à 2 heures.
    12. Éliminez la solution bloqueante, rincez rapidement la membrane deux fois avec du PBS sur un shaker décolorant pour éliminer complètement la solution bloqueante, puis ajoutez les anticorps correspondants selon les rapports d’utilisation du Western Blot de chaque anticorps dans la boîte d’incubation des anticorps, et incubez toute la nuit à 4 °C.
    13. Récupérer séparément les anticorps primaires et stocker à -20 °C. Les membranes ont été rapidement lavées 4 fois avec TBST sur un shaker décolorant, 5 minutes à chaque fois, pour éliminer complètement les anticorps primaires. Ensuite, ajoutez 4 mL de tampon bloquant avec des anticorps secondaires, et incubez les membranes à température ambiante sur un secoueur lent pendant 1 heure.
    14. Lavez l’anticorps secondaire quatre fois avec un tampon TBST pendant 5 minutes chacun, puis remplacez par un tampon PBS pour humidifier complètement la membrane NC.
    15. Selon le manuel d’instructions du réactif de chimiluminescence ECL, préparez la solution luminescente et déposez-la sur la surface de la membrane, puis incubez pendant 1 à 2 minutes avant de développer avec un système d’imagerie en gel.
    16. Traitez les données brutes dans le système d’imagerie Image J, puis transférez-les dans le logiciel Photoshop pour la création de figures.

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Résultats

Pharmacologie des réseaux et amarrage moléculaire
Identification des cibles potentielles de l’AC : Dans l’enquête approfondie sur l’activité pharmacologique de la CA, 60 cibles potentielles ont été méticuleusement sélectionnées à partir d’une revue approfondie de la littérature pertinente. Pour élargir davantage le champ de l’analyse, 12 cibles potentielles supplémentaires associées à l’AC ont été identifiées via la base de données TCMSP. Pour une précision et une rig...

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Discussion

La ferroptose, un mode de mort cellulaire récemment identifié, se caractérise par une accumulation excessive de fer intracellulaire et une peroxydation lipidique. Morphologiquement, la ferroptose se manifeste par un rétrécissement mitochondrial, une perte ou une réduction des structures des cristes, et une augmentation de la densité membranaire, tandis que la membrane cellulaire et la morphologie nucléaire restentintactes 26. Sur le plan mécanistique, la ferroptos...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de conflits d’intérêts financiers à divulguer

Remerciements

Nous exprimons notre sincère gratitude pour les conditions supérieures offertes par l’hôpital et ses services, qui nous ont permis d’atteindre ces résultats. En même temps, nous adressons également nos sincères remerciements aux nombreux membres du laboratoire pour leurs efforts inlassables et leurs précieuses contributions au fil des années. Le travail acharné de chaque participant est une partie indispensable de notre réussite, et à l’avenir, nous continuerons à travailler ensemble pour faire progresser le domaine de la médecine. Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82104838), le programme Spark de la China Promotion Foundation (XH-D001), le programme clé de recherche et développement de la province du Liaoning (2024JH2/102500062), et la Fondation provinciale des sciences naturelles du Liaoning (2025-MSLH-490).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ; GlycineBiofroxx1275KG001
  ; Tris-baseBiofrooxx1115KG001
0,5  ; M  ; Tampon Tris-HCl (pH  ; 6,8)Biorad1610799
1 M Tris-Hcl (PH 7,5)BeyotimeST775
1,5  ; M  ; Tampon Tris-HCl (pH  ; 8,8)Biorad1610798
APSBeyotimeST005
Alimentation électrique de base pour électrophorèseBIO-RAD  ;PowerPac Basic
Kit de quantification des protéines BCABeyotimeP0012
Anticorps recombinant bêta-actineHuabio81115-1-RR
Incubateur à dioxyde de carboneThermo150L
Kit d’analyse CCK-8ApexbioK1018
Kit d’analyse d’activité cellulaire et de cytotoxicitéBeyotimeC2015M
Cinnamaldéhyde (CA)MacklinC805134pureté 98 %
Shaker décolorantKylin-BellTS-100
DMEM (Eagle Medium modifié de Dulbecco)BasalMediaL110KJ
DMSOSigmaD2650
Ganglione de la racine dorsale (DRG)Biographie de FuhengFH165Numéro de série : 20211227-1
Médium complet DRGBiographie de FuhengFH-DRG
Solution luminescente ECLThermo34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
Fœtal  ; Bovin  ; SérumMacklinFO193
Sonde de détection d’ions ferreux - FerroOrangeDojindoF374
FTH1Technologie de signalisation cellulaire4393S1:1000
Système d’imagerie sur gelBIO-RAD  ;ChemiDoc Touch
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)SolarbioH1025
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseEppendorf5804R
Hoechst 33342 Solution de coloration pour cellules vivantesBeyotimeC1028
Kit d’immunohistochimieBiosharpBS-24-PB
Système de microscope à fluorescence inverséeLeicaLeica DMI 8
Anticorps monoclonal recombinant du lapin JAK2 [SY0245]HuabioET1607-351:2000
Microscope de laboratoire à contraste de phase inverséLeicaLeica DMI 1
Centrifugeuse à basse vitesseEppendorf5804
Kit de détection de contenu MDASangonD799762
Lecteur de microplaquesLEVER DU SOLEIL & NBSP ;TECAN
Lecteur multifonction de microplaquesBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-& kappa ; Anticorps polyclonal B p65Proteintech10745-1-AP1:1000
ParaformélélidoïdeMacklinP804536
Solution de coloration PonceauBeyotimeP0022
Marqueur protéiqueThermo26617
P-STAT3 (Ser727)Technologie de signalisation cellulaire9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)Technologie de signalisation cellulaire9145S1:2000
Anticorps anti-glutathion peroxydase 4 recombinant[EPNCIR144]Abcamab1250661:1000
Anticorps anti-XCT recombinant[EPR27115-64]Abcamab3076011:1000
Kit d’analyse ROSDojindoR252
Tampon de chargement de protéines SDS-PAGE (6X)BeyotimeP0289
Lait écrémé en poudreBiosharpBS102-500g
SDS du dodécyle sulfate de sodiumBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSC-80191:200
TEMEDSolarbio  ;   ; T8090  ;   ;
TFRCInvitrogen13-68000,5 & micro ; g/mL
Tween80SelleckS6702
Établi ultra-propreHDLDL-CJ-2NDI
Microscope verticalOlympeCX 31
Électrophorèse verticaleBIO-RAD  ;Mini Tétra Protéien
Réservoir de transfert humideBIO-RAD  ;Mini Trans Blot
&alpha ;-Tubuline&alpha ;-TubulineER130905
GraphPad PrismAnalyse statistique
Logiciel ImageJObtenir la valeur grise de la tache protéique

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