Article de recherche

Le cholestérol et le stéaramide interviennent dans l’apoptose des lymphocytes et la sécrétion de cytokines dans le lupus érythémateux disséminé

553 vues

⸱

DOI :

10.3791/69038

⸱

17 octobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University of Science & Technology, The First Hospital, 2Department of Rheumatism and Immunology, Peking University Shenzhen Hospital, 3School of Computer Science and Engineering, Anhui University of Science & Technology, 4Taizhou University of Medicine, 5School of Medicine, Anhui University of Science & Technology, 6Department of Radiotherapy, Shenzhen Traditional Chinese Hospital, the Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, the Clinical Medical Research Center of Shenzhen People's Hospital, 7Anhui Provincial Academician Workstation of Anhui University of Science & Technology for Autoimmune Disease Diagnostic Technology, 8Departments of Nephrology, Shenzhen People's Hospital

Auteurs correspondants : Jingquan He <astroh@163.com>, Yong Dai <daiyong22@aust.edu.cn>

Dans cet article

Avis d’erratum

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Résumé

Ici, nous présentons une étude qui intègre la randomisation mendélienne à deux échantillons, la validation métabolomique basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) et des tests fonctionnels utilisant des lymphocytes dérivés de patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED) pour évaluer les réponses de l’apoptose et des cytokines après stimulation des métabolites, dans le but d’identifier des biomarqueurs liés aux lipides et d’étudier leurs rôles immunorégulateurs dans le LED.

Résumé

Les altérations de la composition des métabolites sériques sont de plus en plus associées au lupus érythémateux disséminé (LED), mais les effets directs de ces métabolites sur la fonction des cellules immunitaires restent mal définis. Cette étude visait à identifier les métabolites sanguins périphériques associés au LED et à évaluer leur impact sur l’apoptose et la sécrétion de cytokines dans les lymphocytes dérivés de patients atteints de LED.

Nous avons effectué une analyse de randomisation mendélienne (RM) à deux échantillons pour étudier la relation entre 565 métabolites sériques et le LED, en utilisant le modèle pondéré par la variance inverse comme approche analytique principale. Des résultats significatifs ont été validés à l’aide de données métabolomiques non ciblées précédemment publiées basées sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS). Dans des expériences fonctionnelles, des lymphocytes isolés de patients atteints de LED ont été stimulés par des métabolites cibles, suivis d’une évaluation de l’apoptose et de la sécrétion de cytokines.

L’analyse par résonance magnétique a permis d’identifier 28 métabolites significativement associés au LED. Parmi ceux-ci, le cholestérol (RC = 1,462, IC à 95 % : 1,100-1,940, P = 0,008) et le stéaramide (RC = 0,125, IC à 95 % : 0,020-0,660, P = 0,014) ont été validés par LC-MS et se sont révélés élevés chez les patients atteints de LED. L’analyse des caractéristiques de fonctionnement du récepteur a démontré une forte performance diagnostique (AUC = 0,999 pour le cholestérol ; AUC = 1.000 pour le stéaramide). Sur le plan fonctionnel, les deux métabolites ont induit une augmentation de l’apoptose et une sécrétion accrue de TNF-α, d’IFN-γ et de TGF-β1 dans les lymphocytes du LED.

En résumé, notre approche intégrée combinant l’association génétique, le profilage des métabolites et les dosages fonctionnels révèle que le cholestérol peut contribuer à la dérégulation immunitaire dans le LED. Bien que le stéaramide ait montré une association négative avec le risque de LED dans l’analyse RM, ses effets in vitro reflétaient ceux du cholestérol, suggérant un rôle complexe et dépendant du contexte. Ces résultats soulignent l’importance du métabolisme des lipides dans le LED et soutiennent la poursuite de l’étude mécaniste et clinique de son impact immunologique.

Introduction

Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune chronique, caractérisée par une pathogenèse complexe et diverses manifestations cliniques, qui touche des millions de personnes dans le monde1. L’hétérogénéité du LED, où les symptômes varient considérablement d’un individu à l’autre et évoluent au fil du temps, crée des défis importants en matière de diagnostic, de surveillance de l’activité de la maladie et d’adaptation des plans de traitement personnalisés 2,3. Bien que les critères de classification 2019 de la Ligue européenne contre le rhumatisme et de l’American College of Rheumatology (EULAR/ACR) SLE aient amélioré la précision du diagnostic4, ces critères ne capturent pas toutes les manifestations de la maladie et dépendent souvent de procédures invasives telles que la biopsie rénale, qui peuvent être peu pratiques et lourdes pour les patients.

Au cours des dernières années, la recherche sur les métabolites en tant que biomarqueurs du LED s’est intensifiée, démontrant leur énorme potentiel dans le diagnostic précoce des maladies, le typage et l’évaluation pronostique 5,6,7. Cependant, le potentiel translationnel de la recherche basée sur les métabolites dans le LED reste limité par plusieurs défis clés. Tout d’abord, la petite taille des échantillons est une contrainte majeure8. À ce jour, la plupart des études métabolomiques ont impliqué relativement peu de participants, ce qui limite leur capacité à saisir l’hétérogénéité clinique complète du LED. Étant donné que le LED peut aller d’une légère atteinte cutanée à des manifestations rénales ou neurologiques graves, les études avec une diversité d’échantillon insuffisante peuvent souffrir d’une faible reproductibilité et d’une généralisabilité limitée9. Deuxièmement, la profondeur mécaniste fait toujours défaut. Bien que des études antérieures aient démontré des associations entre des métabolites spécifiques et l’activité de la maladie, des lésions organiques ou des caractéristiques cliniques particulières, la plupart des résultats restent de nature descriptive10. Ces recherches se sont largement concentrées sur les différences quantitatives dans les niveaux de métabolites et leurs corrélations statistiques avec les indicateurs cliniques, sans explorer les rôles causaux des métabolites dans l’immunopathologie du LED. Étant donné que la dérégulation immunitaire, y compris l’apoptose aberrante des lymphocytes et la sécrétion déséquilibrée de cytokines, est essentielle à la pathogenèse du LED, il est crucial de comprendre comment les métabolites influencent ces processus11. À l’heure actuelle, peu d’études ont examiné directement comment des métabolites spécifiques modulent l’apoptose des cellules immunitaires ou la production de cytokines dans le contexte du LED.

Ici, cette étude vise à identifier des biomarqueurs métaboliques associés au LE par l’intégration de la randomisation mendélienne (RM) et des analyses métabolomiques non ciblées LC-MS, et à élucider les rôles fonctionnels de ces métabolites candidats dans la modulation de l’apoptose lymphocytaire et la production de cytokines inflammatoires à l’aide de tests cellulaires ciblés, comme le montre la figure 1.

Il s’agit de la première étude à intégrer l’IRM, la validation métabolomique et les tests fonctionnels in vitro pour étudier les rôles causaux et mécanistes des métabolites lipidiques, en particulier le cholestérol et la stéaramide, dans la pathogenèse du LED. En combinant des preuves génétiques, métaboliques et expérimentales, ce travail fournit un aperçu complet et multidimensionnel de la façon dont des altérations lipidiques spécifiques peuvent influencer la dérégulation immunitaire dans le LED. Cette approche intégrative offre un nouveau cadre pour l’identification de biomarqueurs métaboliques potentiels et de cibles thérapeutiques dans les maladies auto-immunes12.

Protocole

Cette étude a été menée selon les critères de classification EULAR/ACR 2019. Cette étude a été approuvée par l’hôpital populaire de Shenzhen (numéro d’approbation du comité d’éthique LL-KY-2019514).

Analyse de randomisation mendélienne (RM)

Sources de données GWAS
Les données d’association génétique pour le LED et 565 métabolites ont été obtenues à partir de la base de données OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Les ensembles de données GWAS sur les maladies sont résumés dans le tableau 1, tandis que les sources et la taille des échantillons pour les données GWAS sur les métabolites sont détaillées dans le tableau 2. Ces ensembles de données ont servi de base à l’analyse RM visant à explorer les relations causales entre les métabolites et les LED13, 14, 15 et 16.

Sélection des variables instrumentales
Les variantes génétiques associées aux métabolites sanguins et au LED ont été sélectionnées comme variables instrumentales (IV) pour l’analyse RM. Les IV ont été choisis sur la base des trois hypothèses fondamentales de la RM : pertinence, indépendance et restriction d’exclusion17. Plus précisément, les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) associés aux métabolites à un seuil de signification à l’échelle du génome de P < 5 × 10-8 ont été sélectionnés18. Pour assurer l’indépendance entre les IV, un agglomération de déséquilibre de liaison (LD) a été effectué avec un seuil de r2 < 0,001 et une distance physique de 10 000 kb en utilisant la population européenne comme panel de référence19. Ce processus a minimisé la redondance et a permis de s’assurer que chaque IV fournissait des informations uniques pour l’analyse RM.

Analyses statistiques
La principale approche statistique pour l’analyse RM était la méthode pondérée en fonction de l’inverse de la variance (IVW), qui combine les effets de plusieurs IV pour estimer l’effet causal des métabolites sur l’ELS20. Pour tenir compte de la pléiotropie potentielle, des analyses de sensibilité ont été effectuées à l’aide de la régression MR-Egger21. La force de chaque IV a été évaluée à l’aide de statistiques F, seuls les SNP présentant F > 10 ont été retenus pour assurer une force d’instrument robustede 22. Les SNP avec des statistiques F plus faibles ont été exclus pour éviter un biais d’instrument faible. Les analyses RM finales n’ont été effectuées que lorsqu’aucune hétérogénéité ou pléiotropie significative n’a été détectée, ce qui garantit la fiabilité des estimations causales23.

Analyses de sensibilité
Plusieurs analyses de sensibilité ont été utilisées pour évaluer la robustesse des résultats de l’IRM. L’hétérogénéité entre les IV a été évaluée à l’aide du test Q de Cochran, tandis que la pléiotropie a été évaluée à l’aide de la régression MR-Egger24. De plus, une analyse a été effectuée pour déterminer si les résultats de l’IRM étaient influencés de manière disproportionnée par un seul SNP25. Des graphiques forestiers ont été générés pour visualiser les effets individuels et combinés des IV. Ces analyses ont permis de s’assurer collectivement que les résultats de la RM n’étaient pas biaisés par des effets pléiotropiques ou des SNP aberrants.

Source de données métabolomique
Les données métabolomiques utilisées dans cette étude sont dérivées d’une étude précédemment publiée par notre groupe de recherche10. Dans cette étude, nous avons effectué des analyses métabolomiques sur des échantillons de sérum de 121 patients atteints de LED et de 106 individus en bonne santé. Un profilage métabolomique non ciblé a été réalisé à l’aide d’une chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à une spectrométrie de masse (UHPLC-MS). Les données ont été traitées à l’aide de flux de travail métabolomiques standard, y compris la détection des pics, l’alignement et la normalisation, afin d’identifier les métabolites significativement associés au LED. Ces métabolites ont ensuite été croisés avec les résultats de l’analyse RM afin d’identifier les métabolites qui se chevauchent. Des informations plus détaillées sont disponibles dans la publication précédente10. Les métabolites significativement associés dans l’analyse métabolomique et ceux présentant des associations causales significatives dans l’analyse RM ont été cartographiés à leurs identifiants HMDB respectifs à l’aide de la plateforme MetaboAnalyst. Les métabolites communs ont ensuite été identifiés en croisant les deux ensembles d’identifiants HMDB.

Mesures de cytokines et dosage de l’apoptose
Au total, 3 patients atteints de LED ont été recrutés (tableau 3), conformément aux critères de classification EULAR/ACR 2019.

Prélèvement d’échantillons de sang périphérique et isolement des lymphocytes
Des échantillons de sang périphérique (3 à 6 ml) ont été prélevés chez les participants à l’aide de tubes à vide contenant de l’héparine sodique comme anticoagulant. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été isolées par centrifugation à gradient de densité Ficoll-Paque (400-800 × g pendant 20-30 min). Les cellules isolées ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, HyClone) par centrifugation à basse vitesse (250 × g pendant 10 min) et remises en suspension dans un milieu RPMI-1640 complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal. La densité des cellules a été ajustée à 1 × 106 cellules/mL, comme vérifié par un compteur automatique de cellules. La suspension cellulaire a été ensemencée dans des plaques de culture et pré-incubée pendant 2 heures à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pour favoriser l’adhérence. Après la pré-incubation, les cellules non adhérentes du surnageant de culture ont été soigneusement prélevées et soumises à l’isolement des lymphocytes. La suspension collectée a été délicatement superposée sur Ficoll-Paque et centrifugée à nouveau à 400 × g pendant 20 min sans frein. La couche cellulaire mononucléaire à l’interface plasma-Ficoll a été soigneusement aspirée, lavée deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remise en suspension dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de sérum fœtal bovin. La viabilité et la concentration des cellules ont été évaluées à l’aide du compteur automatique de cellules, et les lymphocytes ont ensuite été utilisés pour des applications en aval.

Traitement cellulaire et culture
Les cellules ont été divisées en cinq groupes pour le traitement : Groupe témoin : Traité avec un volume égal de DMSO. Groupe de traitement du cholestérol : Traité avec du cholestérol à une concentration de 1,5 mmol/L. La concentration de 1,5 mmol/L de cholestérol libre utilisée dans cette étude a été sélectionnée pour simuler un microenvironnement riche en lipides au-delà des niveaux physiologiques. Le cholestérol libre circulant chez les personnes en bonne santé varie généralement de 0,9 à 1,3 mmol/L. La concentration légèrement élevée utilisée dans ces expériences visait à imiter l’accumulation pathologique de lipides qui peut se produire dans les tissus enflammés ou métaboliquement perturbés du LED. Groupes de traitement au stéaramide : Traité avec du stéaramide à des concentrations de 5 μmol/L et 10 μmol/L. Les concentrations de stéaramide (5 et 10 μmol/L) ont été choisies sur la base d’un rapport antérieur26, qui suggérait que des concentrations de stéaramide de l’ordre de 5 à 10 μmol/L pourraient imiter une accumulation élevée de lipides dans des conditions pathologiques. L’intention ici était d’explorer les effets pro-apoptotiques et immunomodulateurs d’une exposition à des lipides à haute concentration sur les lymphocytes LED, en simulant des états inflammatoires ou métaboliquement dérégulés. Le cholestérol et le stéaramide ont d’abord été dissous dans du DMSO pour préparer des solutions mères à haute concentration, qui ont ensuite été diluées dans un milieu de culture pour atteindre les concentrations cibles. La concentration finale de DMSO dans tous les groupes n’a pas dépassé 0,1 % (v/v). Après l’ajout des traitements respectifs, les plaques ont été doucement secouées pour assurer une répartition uniforme et incubées pendant 48 h à 37 °C dans un environnement à 5 % de CO2.

Dosage de l’apoptose
Pour les expériences d’apoptose, 1 × 106 à 3 × 106 cellules ont été prélevées et lavées deux fois avec du PBS pré-réfrigéré. Un groupe témoin positif a été préparé en remettant les cellules en suspension dans 500 μL de solution de contrôle positive à l’apoptose pré-refroidie et en les incubant sur de la glace pendant 30 minutes, suivies d’un autre lavage PBS. Les groupes expérimentaux ont été traités comme décrit à la rubrique 1.7, avec des traitements témoins, au cholestérol (1,5 mmol/L) et au stéaramide (10 μmol/L). Après le traitement, 1 à 10 × 105 cellules (y compris celles du surnageant de culture) ont été recueillies et remises en suspension dans 500 μL de tampon de liaison 1× (préparé en diluant 5× solution mère avec de l’eau doublement distillée). Chaque échantillon a été mélangé avec un nombre égal de cellules vivantes non traitées, et le volume a été ajusté à 1,5 mL avec un tampon de liaison de 1× pré-refroidi. La suspension a ensuite été divisée en trois tubes : un pour le contrôle des flans et deux pour la compensation de la tache unique (Annexin V-FITC et PI). À chaque tube expérimental, 5 μL d’Annexin V-FITC et 10 μL de solution de coloration PI ont été ajoutés, suivis d’un vortex et d’une incubation à température ambiante dans l’obscurité pendant 5 minutes. La cytométrie en flux a été réalisée à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm pour détecter l’annexine V-FITC (émission à 530 nm) et PI (émission à 615 nm). Le tube de contrôle à blanc a été utilisé pour régler les tensions de diffusion directe (FSC), de diffusion latérale (SSC) et de canal de fluorescence, tandis que les tubes à coloration unique ont été utilisés pour la compensation de fluorescence. L’apoptose a été analysée à l’aide de diagrammes de dispersion à deux paramètres pour évaluer la proportion de cellules apoptotiques27,28.

Détection des facteurs immunitaires
Après l’incubation de 48 heures, les suspensions cellulaires ont été centrifugées (250 × g pendant 5 min) pour recueillir les surnageants de culture, qui ont été stockés à -80 °C jusqu’à l’analyse. La quantification des cytokines a été effectuée à l’aide d’un panel commercial de réponse immunitaire essentielle humaine, en suivant les instructions du fabricant avec des optimisations pour l’instrument. En bref, 25 μL de tampon d’essai et 25 μL d’étalons (allant de 2,4 à 10 000 pg/mL) ou d’échantillons ont été ajoutés à chaque puits d’une microplaque. Le mélange de billes a été vortex pendant 30 s et ajouté aux puits, ce qui a porté le volume total de réaction à 75 μL. La plaque a été incubée en secouant (800 tr/min) à température ambiante pendant 2 h dans l’obscurité. Après deux lavages automatisés (1× tampon de lavage, 250 × g pendant 5 min), 25 μL d’anticorps de détection biotinylés ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 1 h. Par la suite, 25 μL de streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) ont été ajoutés pendant 30 minutes pour amplifier le signal.

L’acquisition des données a été réalisée à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un laser d’excitation de 488 nm et d’un filtre de 575/26 nm pour la détection de l’EP. Avant chaque expérience, des billes d’étalonnage ont été utilisées pour optimiser les tensions des tubes photomultiplicateurs et la compensation spectrale. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel LEGENDplex v8.0, les concentrations de cytokines étant déterminées par ajustement de la courbe logistique à cinq paramètres (5PL). Les limites de détection pour chaque cytokine variaient de 0,68 pg/mL à 1,97 pg/mL, et les expériences ont été menées en double pour assurer la précision (coefficient de variation entre puits <10 %). Les résultats ont été exprimés en moyenne ±± en écart-type, et les différences statistiques entre les groupes ont été évaluées à l’aide d’une ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc de Tukey dans un logiciel d’analyse statistique approprié. La période d’incubation de 48 heures a été choisie en fonction des changements dynamiques de la sécrétion de cytokines afin de saisir la réponse immunitaire de manière exhaustive. L’étalonnage quotidien de l’instrument et le contrôle de la concentration de DMSO (≤0,1 %) ont assuré la fiabilité et la reproductibilité des résultats 29,30,31.

Résultats

Association entre les métabolites clés et les manifestations cliniques dans le LED

Dans cette étude, l’analyse par RM de 565 métabolites atteints de LED a permis d’identifier des associations causales significatives. Comme le montre la figure 2, un total de 28 métabolites significativement associés au LED ont été identifiés, englobant des catégories telles que les peptides, les acides aminés, l’énergie, les lipides, les glucides et les acides gras. Des peptides tels que la gamma-glutamylphénylalanine et la pro-hydroxy-pro, des acides aminés tels que le tryptophane, la bétaïne et l’asparagine, et des métabolites énergétiques comme l’alpha-cétoglutarate étaient négativement corrélés avec le LED. À l’inverse, la plupart des métabolites lipidiques étaient positivement corrélés avec le LED, y compris les métabolites liés au cholestérol tels que le cholestérol libre dans les très gros HDL, le cholestérol total dans les LDI très élevés, le cholestérol libre, les triglycérides dans les HDL très grands, le diamètre moyen des particules de HDL, les lipides totaux dans les LDI et les lipides totaux dans les HDL très importants. De plus, d’autres lipides tels que la palmitoylcarnitine, le palmitoléate (16:1n7), la 2-palmitoylglycérophosphocholine et les acides biliaires comme l’ursodésoxycholate et le taurodésoxycholate étaient également positivement corrélés avec le LED. Fait intéressant, le stéaramide est le seul lipide qui est négativement corrélé avec le LED. Dans le même temps, le lactate et l’acétate se sont également avérés être négativement corrélés avec la maladie. Le test Q de Cochran n’a indiqué aucune hétérogénéité, et le test d’interception MR-Egger n’a montré aucun signe de pléiotropie horizontale (figure supplémentaire 1). Des études antérieures ont indiqué que l’alpha-cétoglutarate atténue la parodontite dans des modèles murins32, que le pipecolate est positivement associé à des lésions rénales33, que le tryptophane bétaïne exerce un effet protecteur contre les symptômes neuropsychiatriques liés au LLES34 et que le 4-méthyl-2-oxopentanoate est lié à un risque accru de maladie cardiovasculaire chronique chez les patients atteints de LED35 . Ces résultats sont cohérents avec les résultats obtenus dans cette étude.

La métabolomique non ciblée par LC-MS combinée à l’analyse RM identifie le cholestérol et le stéaramide comme métabolites associés au LE (figure 3)

Dans notre étude précédente, nous avons analysé les données métabolomiques du sang périphérique de 106 témoins sains et de 121 patients atteints de LED. En appliquant un critère de dépistage d’importance variable en projection (VIP) supérieur à 1 et une valeur p inférieure à 0,05, nous avons identifié 76 métabolites présentant des différences significatives. Des informations plus détaillées sont disponibles dans la publication précédente10. Par la suite, en superposant ces résultats avec les résultats de l’analyse de randomisation mendélienne (RM), le cholestérol et la stéaramide ont été validés et confirmés comme les principaux métabolites associés au LED (figure 3A). Les graphiques de violon générés à partir des données métabolomiques ont montré des niveaux significativement élevés de ces métabolites chez les patients atteints de LED par rapport aux témoins sains (figures 3B et 3D). De plus, l’analyse de la courbe ROC (AUC = 0,999 pour le cholestérol, AUC = 1,000 pour le stéaramide) a mis en évidence le potentiel diagnostique du cholestérol et du stéaramide en tant que biomarqueurs du LED (Figure 3C,E).

Impact du cholestérol et du stéaramide sur l’apoptose des lymphocytes chez les patients atteints de LED (Figure 4)
L’analyse de faible cytométrie a révélé des effets significatifs du traitement au cholestérol ou au stéaramide sur l’apoptose des lymphocytes, comme le montrent les données représentatives de la figure 4A. Le groupe traité au cholestérol et le groupe traité au stéaramide ont tous deux présenté une augmentation significative des taux d’apoptose (p < 0,05) (figure 4B). Ces résultats indiquent qu’un métabolisme anormal des lipides chez les patients atteints de LED favorise significativement l’apoptose dans leurs lymphocytes.

Le cholestérol et le stéaramide réduisent la sécrétion de cytokines dans les lymphocytes dérivés du LE (Figure 5)
Pour évaluer les effets du cholestérol et du stéaramide sur la fonction lymphocytaire chez les patients atteints de LED, nous avons utilisé un panel commercial de réponse immunitaire essentielle chez l’homme, une plateforme de cytométrie en flux multiplexe basée sur des billes, pour quantifier les niveaux de cytokines multiples liées au système immunitaire dans les surnageants de culture cellulaire. Les cytokines analysées comprenaient TGF-1, CXCL8 (IL-8), IL-12p70, IFN-, IL-10, IL-6, IL-17A, TNF-α, CXCL10, IL-2, IL-4 et IL-1. Les résultats ont montré que les taux d’IFN-γ, de TNF-α, de TGF-β1, d’IL-1β et d’IL-4 étaient élevés dans le groupe traité au cholestérol à 1,5 mmol/L (figure 5A). Dans le groupe traité à 5 μmol/L de stéaramide, les concentrations de TNF-α et de TGF-β1 ont augmenté (figure 5B). Dans le groupe traité à 10 μmol/L de stéaramide, les taux de TGF-β1, d’IFN-γ et d’IL-4 étaient significativement élevés (figure 5C). Ces résultats suggèrent que la stimulation lipidique à haute concentration augmente la sécrétion de cytokines inflammatoires par les lymphocytes chez les patients atteints de LED, exacerbant ainsi la réponse inflammatoire dans le corps.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les données des profils d’expression des métabolites ont été téléchargées sur Zenodo (https://zenodo.org/record/4898488).

figure-results-1
Figure 1 : Organigramme de la conception expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Graphique forestier des résultats de la randomisation mendélienne pour les associations métabolite-LED. 
Des rapports de cotes (RC) avec des intervalles de confiance (IC) à 95 % sont indiqués pour chaque métabolite. OR > 1 indique des facteurs de risque de LED, tandis que OR < 1 indique des facteurs de protection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Distribution du cholestérol et du stéaramide entre les patients atteints de LED (n = 121) et les témoins sains (n = 106) sur la base de l’analyse métabolomique. (A) Diagramme de Venn montrant le chevauchement entre les données métabolomiques et les données d’analyse RM. (B) Graphique en violon montrant la distribution du cholestérol dans les données métabolomiques entre les témoins sains et les groupes LED. (C) Courbe ROC pour le cholestérol. (D) Graphique en violon montrant la distribution du stéaramide dans les données métabolomiques entre les témoins sains et les groupes de LED. (E) Courbe ROC pour le stéaamide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Modifications de l’apoptose cellulaire après un traitement par cholestérol et stéaramide. (A) L’apoptose des lymphocytes du sang périphérique chez les patients atteints de LED a été évaluée par cytométrie en flux à l’aide de l’annexine V-FITC et d’une double coloration PI après 48 h de traitement avec 1,5 mmol/L de cholestérol et 10 μmol/L de stéaramide. (B) Les résultats de l’analyse statistique montrent le taux d’apoptose des lymphocytes des patients atteints de LED après incubation avec du cholestéral ou du stéaramide **, P < 0,01 par Anova à un facteur suivi d’un test de Holm-sidak Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Concentrations de cytokines chez les patients atteints de LED sous stimulation avec différentes concentrations de lipides. (A) Concentrations de cytokines pour 1,5 mmol/L de cholestérol. (B) Concentrations de cytokines pour 5 μmol/L de stéaramide. (C) Concentrations de cytokines pour 10 μmol/L de stéaramide
Aucune différence significative n’a été observée dans les taux d’autres cytokines non incluses dans la figure. *, P < 0,05 ; **, P < 0,01 ; , P < 0,001 par test t apparié Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Données sur les résultatsIdentifiant GWASN.casN.contrôles
SLEebi-a-GCST900118664,2228,43,112
SLEebi-a-GCST0031565,2019,06,612
SLEIEU-A-8151,3111,78,313

Tableau 1 : Informations de la base de données OpenGWAS sur le LED dans cette étude.

Données d’expositionCompteAuteur
Métabolites sanguins humains analysés442Shin et coll.15.
Métabolites circulants analysés123Kettunen et al.16.

Tableau 2 : Informations de la base de données OpenGWAS sur les métabolites de cette étude.

VariablesSLE
Le sexe - non. (%)
Mâle0 (0%)
Femelle3 (100%)
Âge-années Moyenne (ET)32 (1.4)
anticorps anti-ADNdbPositif
anticorps anti-nucléosomePositif
anticorps anti-histonesPositif
anticorps anti-SS-APositif
anticorps anti-Ro52Positif

Tableau 3 : Informations cliniques des échantillons.

Figure supplémentaire 1 : L’analyse de randomisation mendélienne : analyse d’hétérogénéité des métabolites avec une signification statistiquement significative. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Discussion

Notre étude démontre que 1,5 mmol/L de cholestérol, 5 μmol/L de stéaramide et 10 μmol/L de stéaramide induisent des schémas similaires d’apoptose et de sécrétion de cytokines dans les lymphocytes des patients atteints de LED, bien que des variations d’ampleur aient été observées. Plus précisément, le cholestérol de 1,5 mmol/L et le stéaramide de 5 μmol/L augmentaient significativement l’apoptose dans les lymphocytes du LED. De plus, le traitement avec 1,5 mmol/L de cholestérol en association avec de la stéaramide de 5 μmol/L ou de 10 μmol/L a encore amélioré la sécrétion de facteurs immunitaires pertinents. Les résultats expérimentaux ont révélé des taux élevés d’IFN-γ, de TNF-α, de TGF-β1, d’IL-1β et d’IL-4 dans le groupe traité au cholestérol à 1,5 mmol/L ; augmentation des taux de TNF-α et de TGF-β1 dans le groupe traité à 5 μmol/L de stéaramide ; et des taux significativement élevés de TGF-β1, d’IFN-γ et d’IL-4 dans le groupe traité à 10 μmol/L de stéaramide.

Les mécanismes sous-jacents par lesquels des concentrations élevées de cholestérol et de stéaramide influencent les lymphocytes du LED restent incomplètement compris. Les voies potentielles peuvent inclure des augmentations de la rigidité de la membrane induites par le cholestérol, ce qui peut altérer la fonction des protéines membranaires et perturber la signalisation intracellulaire, déclenchant finalement l’apoptose. Le stéaramide peut modifier le métabolisme cellulaire ou les voies de signalisation grâce à ses propriétés bioactives. De plus, la dérégulation immunitaire associée à la maladie dans le LED peut rendre les lymphocytes plus sensibles au stress induit par les lipides. L’accumulation de lipides intracellulaires pourrait également entraîner un stress oxydatif et des réponses inflammatoires, favorisant l’apoptose par les voies de stress du réticulum mitochondrial ou endoplasmique 36,37,38.

Notamment, alors que l’analyse RM a indiqué une association négative entre les niveaux de stéaramide circulant et le risque de LED, des expériences in vitro ont révélé des effets pro-apoptotiques et pro-inflammatoires de la stéaramide sur les lymphocytes du LED. Cet écart peut refléter des différences entre l’exposition à long terme, prédite génétiquement, capturée par RM et les réponses cellulaires aiguës observées dans des conditions expérimentales. De plus, le stéaramide peut présenter des effets dépendants de la dose ou spécifiques au contexte qui varient selon les états pathologiques et les environnements cellulaires39,40. Ces résultats soulignent la complexité de la signalisation lipidique dans le LED et l’importance d’utiliser plusieurs approches complémentaires pour caractériser pleinement leurs rôles biologiques. Ces résultats, bien qu’ils soient fondés sur des analyses in vitro, peuvent avoir d’importantes implications cliniques. Les réponses pro-apoptotiques et pro-inflammatoires observées à des taux élevés de cholestérol et de stéaramide suggèrent que des perturbations métaboliques lipidiques pourraient contribuer à la dérégulation immunitaire dans le LED. S’ils sont confirmés dans des cohortes de patients, ces métabolites peuvent servir de biomarqueurs potentiels de l’activité de la maladie ou du profil de risque métabolique.

Cette étude présente plusieurs limites. Tout d’abord, aucun calcul formel de la taille de l’échantillon n’a été effectué pour les tests fonctionnels, ce qui a entraîné une puissance statistique limitée. Deuxièmement, en raison de contraintes de ressources, aucune enquête mécaniste approfondie n’a été menée. Troisièmement, bien que nos résultats suggèrent un lien potentiel entre le cholestérol et la dérégulation immunitaire dans le LED, nous n’avons pas évalué les effets des médicaments hypolipidémiants tels que les statines. La validation pharmacologique à l’aide de statines ou d’autres modulateurs du métabolisme des lipides sera essentielle pour clarifier davantage les implications thérapeutiques. Quatrièmement, cette étude n’incluait pas d’analyse concentration-réponse complète pour le cholestérol ou la stéaamide. La concentration de cholestérol utilisée (1,5 mmol/L) dépasse légèrement la plage physiologique typique chez les individus en bonne santé (0,9-1,3 mmol/L) et a été sélectionnée pour modéliser un microenvironnement inflammatoire enrichi en lipides. Les concentrations de stéaramide (5 et 10 μmol/L) ont été choisies sur la base de rapports antérieurs pour refléter des taux élevés de lipides dans des conditions pathologiques 41,42,43. Néanmoins, les études futures devraient intégrer des expériences dose-réponse et un profilage lipidomique longitudinal dans des cohortes de patients afin d’évaluer à la fois la pertinence mécaniste et le potentiel des biomarqueurs.

En conclusion, les résultats suggèrent que des taux élevés de cholestérol et de stéaramide peuvent moduler l’apoptose des lymphocytes et la sécrétion de cytokines dans le LED, impliquant leurs rôles potentiels dans la dérégulation immunitaire associée à la maladie. Bien que ces résultats offrent un aperçu de l’implication des lipides dans le LED, nous soulignons qu’ils représentent des données préliminaires. Une validation supplémentaire par le biais d’études mécanistes, d’interventions pharmacologiques et d’études longitudinales auprès de patients est nécessaire pour établir leur signification clinique et leur potentiel thérapeutique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le projet du Fonds d’innovation pour les diplômés de l’Université des sciences et technologies de l’Anhui (n° 2024cx2204), le poste de travail de l’académicien de la province de l’Anhui (techniques de diagnostic des maladies auto-immunes), Université des sciences et technologies de l’Anhui, Huainan, Anhui 232001, Chine) (Document n° 317 [2023], publié par le Département des sciences et de la technologie de la province de l’Anhui), Fonds de recherche fondamentale fondamentale et appliquée de la province du Guangdong (n° 2021A1515110250), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82271824).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’apoptose Annexin V-FITC/PIMulti-sciencesAP101Pour la détection de l’apoptose via cytométrie en flux
CholestérolShanghai Jinpan Biotech Co., Ltd.JP1210051Utilisé pour des expériences de stimulation chez les PBMC (10 g)
Insert de puits de contre-puitsCorningCBG10001Utilisé pour séparer physiquement les cellules dans des expériences de coculture
Cytomètre en fluxBeckman CoulterCytoFLEXAnalyse cytométrique en flux
Logiciel GraphPad PrismGraphPadAnalyse statistique et graphiques
LEGENDplex Panel de la réponse immunitaire essentielle humaineBioLegend740390Détection multiplex des cytokines liées au système immunitaire
Ensemble de micropipettes   ;EppendorfDiversManipulation des liquides et transfert de volume (0,1 & ndash ; 10 & mu ; L, 10 et ndash ; 100 & mu ; L, 100 et n-trait ; 1000 & mu ; L)
Milieu de séparation des lymphocytes du sang périphériqueFabricant nationalB1.1420AUtilisé pour l’isolation PBMC (200 mL)
RPMI-1640 MoyenGibcoC22400500BTMédium culturel pour les PBMC
StéaramideShanghai Jinpan Biotech Co., Ltd.1267285Utilisé pour la stimulation lipidique des PBMC (100 g)
Plaque stérile à 24 puitsFabricant nationalBLJ182APour la culture cellulaire
CountStarShanghai Ruiyu BiotechnologieCS200Compteur automatique de cellules
PBSHyclone10010023Lavage des cellules
Ficoll-Paque  ;Cytiva17-5442-03Isolement des cellules synoviales
LEGENDplex software  ;BioLegendVersion 8Analyse des données de cytométrie en flux
GraphPad Prism 9.0Logiciel GraphPadVersion 9Analyse statistique

Références

  1. Barber, M. R., et al. Global epidemiology of systemic lupus erythematosus. Nat Rev Rheumatol. 17 (8), 515-532 (2021).
  2. Owen, K. A., Grammer, A. C., Lipsky, P. E. Deconvoluting the heterogeneity of SLE: the contribution of ancestry. J Allergy Clin Immunol. 149 (1), 12-23 (2022).
  3. Allen, M. E., Rus, V., Szeto, G. L. Leveraging heterogeneity in systemic lupus erythematosus for new therapies. Trends Mol Med. 27 (2), 152-171 (2021).
  4. Aringer, M., et al. European League against Rheumatism (EULAR)/American College of Rheumatology (ACR) SLE classification criteria item performance. Ann Rheum Dis. 80 (6), 775-781 (2021).
  5. Yoon, N., Jang, A. K., Seo, Y., Jung, B. H. Metabolomics in autoimmune diseases: Focus on rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematous, and multiple sclerosis. Metabolites. 11 (8), 812(2021).
  6. Liang, J., et al. Targeted metabolomics combined with machine learning to identify and validate new biomarkers for early SLE diagnosis and disease activity. Clin Immunol. 264, 110235(2024).
  7. Liu, Y., Yang, X. A review on the novel biomarkers of systemic lupus erythematosus discovered via metabolomic profiling. Front Immunol. 15, 1443440(2024).
  8. Cheng, S., et al. Uncovering potential biomarkers and metabolic pathways in systemic lupus erythematosus and lupus nephritis through integrated microbiome and metabolome analysis. BMC Microbiol. 25 (1), 275(2025).
  9. Júnior, V. F. A. J. A., Silva, S. M., Amaral, A. L., Perini, J. V. deF. V., dos Santos, J. E. N. Systemic lupus erythematosus (SLE): Most common clinical manifestations and renal complications. Braz J Implantol Health Sci. 6, 647-660 (2024).
  10. He, J., et al. Serum proteome and metabolome uncover novel biomarkers for the assessment of disease activity and diagnosing of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 251, 109330(2023).
  11. Moysidou, E., et al. Lymphocytes change their phenotype and function in systemic lupus erythematosus and lupus nephritis. Int J Mol Sci. 25, 10905(2024).
  12. Deng, P., Li, Z., Yi, B., Leng, Y. A Mendelian randomization study to assess the genetic liability of type 1 diabetes mellitus for IgA nephropathy. Front Endocrinol. 13, 874562(2022).
  13. Wang, Y. F., et al. Identification of 38 novel loci for systemic lupus erythematosus and genetic heterogeneity between ancestral groups. Nat Commun. 12, 772(2021).
  14. Hom, G., et al. Association of systemic lupus erythematosus with C8orf13-BLK and ITGAM-ITGAX. N Engl J Med. 358, 900-909 (2008).
  15. Shin, S. Y., et al. An atlas of genetic influences on human blood metabolites. Nat Genet. 46, 543-550 (2014).
  16. Kettunen, J., et al. Genome-wide study for circulating metabolites identifies 62 loci and reveals novel systemic effects of LPA. Nat Commun. 7, 11122(2016).
  17. Moodie, E. E., le Cessie, S. Instrumental variables analysis and mendelian randomization for causal inference. J Infect Dis. 231 (3), 556-558 (2025).
  18. Zhang, S., Zhang, W., Sun, H., Xue, R., Lv, Q. Therapeutic potential of single-nucleotide polymorphism-mediated interleukin-6 receptor blockade in cancer treatment: A Mendelian randomization study. Heliyon. 9, (2023).
  19. Yuan, S., Larsson, S. C., Gill, D., Burgess, S. Concerns about instrumental variable selection for biological effect versus uptake of proton pump inhibitors in Mendelian randomisation analysis. Gut. 74, e6-e6 (2025).
  20. Lin, Z., Deng, Y., Pan, W. Combining the strengths of inverse-variance weighting and Egger regression in Mendelian randomization using a mixture of regressions model. PLoS Genet. 17 (1), e1009922(2021).
  21. Markozannes, G., et al. Systematic review of Mendelian randomization studies on risk of cancer. BMC Med. 20, 41(2022).
  22. Li, Y., et al. The effects of coagulation factors on the risk of endometriosis: a Mendelian randomization study. BMC Med. 21, 195(2023).
  23. Grant, A. J., Burgess, S. Pleiotropy robust methods for multivariable Mendelian randomization. Stat Med. 40 (25), 5813-5830 (2021).
  24. Wang, C., Zhang, J., Han, F., Liu, D., Han, Y. No evidence for a causal link between Helicobacter pylori infection and irritable bowel syndrome: a Mendelian randomization study. Front Microbiol. 14, 1268492(2024).
  25. Zhu, K., Shi, J., Yang, R., Zhou, C., Liu, Z. Evidence based on Mendelian randomization: causal relationship between mitochondrial biological function and lung cancer and its subtypes. Neoplasia. 46, 100950(2023).
  26. Lin, F., Wang, Z., Xiang, L., Deng, L., Cui, W. Charge-guided micro/nano-hydrogel microsphere for penetrating cartilage matrix. Adv Funct Mater. 31, 2101132(2021).
  27. Chen, L. J., et al. Long non-coding RNA 01614 hyperactivates WNT/β-catenin signaling to promote pancreatic cancer progression by suppressing GSK-3β. Int J Oncol. 61, 116(2022).
  28. Zhao, J., Liang, K., Zhong, H., Liu, S., He, R., Sun, P. A cold-water polysaccharide-protein complex from Grifola frondosa exhibited antiproliferative activity via mitochondrial apoptotic and Fas/FasL pathways in HepG2 cells. Int J Biol Macromol. 218, 1021-1032 (2022).
  29. Tovar Acero, C., et al. IL-4, IL-10, CCL2 and TGF-β as potential biomarkers for severity in Plasmodium vivax malaria. PLoS Negl Trop Dis. 16, e0010798(2022).
  30. Strengert, M., et al. Cellular and humoral immunogenicity of a SARS-CoV-2 mRNA vaccine in patients on haemodialysis. EBioMedicine. 70, 103524(2021).
  31. Bhandi, S., et al. Modulation of the dental pulp stem cell secretory profile by hypoxia induction using cobalt chloride. J Pers Med. 11, 247(2021).
  32. Mao, C., et al. Alpha-ketoglutarate alleviates systemic lupus erythematosus-associated periodontitis in a novel murine model. J Clin Periodontol. 52, 457-470 (2025).
  33. Vaishnav, P., Yoo, Y. J., Yoon, Y. J., Demain, A. L. Immunosuppressants: Remarkable Microbial Products. Bioactive Nat. Prod. Chem. Biol. , 43-82 (2014).
  34. Shi, W., et al. Causal effect of three autoimmune diseases on brain functional networks and cerebrospinal fluid metabolites to underlie the pathogenesis of autoimmune psychosis: a two-sample Mendelian randomization analysis. J Transl Med. 23, 440(2025).
  35. Baig, S., Vanarsa, K., Ding, H., Titus, A., McMahon, M., Mohan, C. Baseline elevations of leukotriene metabolites and altered plasmalogens are prognostic biomarkers of plaque progression in systemic lupus erythematosus. Front Cardiovasc Med. 9, 861724(2022).
  36. Warda, M., et al. Lipid rafts: novel therapeutic targets for metabolic, neurodegenerative, oncological, and cardiovascular diseases. Lipids Health Dis. 24, 147(2025).
  37. Hu, C., Wu, H., Zhu, Q., Cao, N., Wang, H. Cholesterol metabolism in T-cell aging: accomplices or victims. FASEB J. 37, e23136(2023).
  38. Song, Y., Liu, J., Zhao, K., Gao, L., Zhao, J. Cholesterol-induced toxicity: an integrated view of the role of cholesterol in multiple diseases. Cell Metab. 33, 1911-1925 (2021).
  39. Wei, Y., Wang, D., Topczewski, F., Demain, A. L. Saturated fatty acids induce endoplasmic reticulum stress and apoptosis independently of ceramide in liver cells. Am J Physiol-Endocrinol Metab. 291 (2), E275-E281 (2006).
  40. Rámek, J., Němcová-Fürstová, V., Pavlíková, N., Kovář, J. Effect of saturated stearic acid on MAP kinase and ER stress signaling pathways during apoptosis induction in human pancreatic β-cells is inhibited by unsaturated oleic acid. Int J Mol Sci. 18 (11), 2313(2017).
  41. Westerterp, M., et al. Cholesterol accumulation in dendritic cells links the inflammasome to acquired immunity. Cell Metab. 25 (6), 1294-1304.e6 (2017).
  42. Chen, J., et al. UPLC-MS/MS-based plasma lipidomics reveal a distinctive signature in systemic lupus erythematosus patients. MedComm (2020). 2 (2), 269-278 (2021).
  43. López, P., et al. Low-density granulocytes and monocytes as biomarkers of cardiovascular risk in systemic lupus erythematosus. Rheumatology (Oxford). 59 (7), 1795(2020).

Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Cholesterol and Stearamide Mediate Lymphocyte Apoptosis and Cytokine Secretion in Systemic Lupus Erythematosus
Posted by JoVE Editors on 11/18/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69038

Explorer plus d’articles

Métabolites sériquesrandomisation mendéliennemétabolisme du cholestéroleffets de la stéaramidechromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de massedysrégulation immunitairemétabolisme lipidique
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.