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Méthode pour la privation sélective du sommeil paradoxal utilisant le mouvement sélectif du nez pour oublier le sommeil paradoxal (SNiFFer)

DOI:

10.3791/69042

April 21st, 2026

In This Article

Summary

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole novateur pour la privation sélective du sommeil REM (REM) chez les rongeurs.

Abstract

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le sommeil est globalement classé en stades de mouvement oculaire rapide (REM) et non-REM, et diverses techniques de privation de sommeil ont été développées pour étudier leurs fonctions. Les méthodes traditionnelles — telles que la stimulation mécanique ou le fait de laisser tomber l’animal pendant le sommeil paradoxal — conduisent souvent à une habituation rapide et à des effets de stress inattendus, rendant l’interprétation difficile. Ici, nous présentons une méthode nouvelle, douce et délicate pour la privation de sommeil paradoxal chez les rongeurs : le SNiFFer. Les rongeurs sont connus pour être très sensibles aux stimuli nasaux. Dans cette méthode, un pinceau doux caresse doucement le nez de l’animal pendant le sommeil paradoxal, déclenchant ainsi de manière fiable l’excitation. Pour appliquer sélectivement cette technique pendant le sommeil paradoxal, nous avons utilisé un système de classification des stades du sommeil en temps réel basé sur l’IA par électroencéphalographie (EEG). L’intervention n’a été déclenchée que lors des épisodes de sommeil paradoxal, et un groupe témoin attaché a été inclus, recevant le même schéma de stimulation quel que soit l’état de sommeil. Nous avons également appliqué SNiFFer dans un paradigme de conditionnement de la peur en trace pour tester si la privation de sommeil paradoxal dans les 6 heures suivant l’apprentissage interfère avec la consolidation de la mémoire. Comparés aux témoins en joug, les animaux traités par SNiFFer ont montré une diminution significative de la durée totale des épisodes de sommeil paradoxal et de la durée des épisodes de sommeil paradoxal, ce qui indique la spécificité et l’efficacité de la méthode. En conclusion, la technique SNiFFer propose une approche tactile très sélective et peu invasive pour la privation de sommeil paradoxal chez la souris. Il permet un contrôle précis des conditions expérimentales et ouvre de nouvelles possibilités pour étudier le rôle du sommeil paradoxal dans la mémoire et la cognition — avec une particularité délicate de chatouille.

Introduction

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Le sommeil à mouvement oculaire rapide (REM) joue un rôle central dans les processus cognitifs tels que la consolidation de la mémoire 1,2. Pour étudier la signification fonctionnelle du sommeil paradoxal dans le cerveau, la privation de sommeil paradoxal est couramment utilisée comme approche expérimentale. Actuellement, quatre méthodes principales sont largement utilisées pour induire la privation de sommeil paradoxal chez les rongeurs : la méthode du disquerotatif 1, la méthodedu pot de fleurs 3, la méthode du souffled’air 4, et les techniques de stimulation physique 5,6. Bien que les méthodes du disque rotatif et du pot de fleurs soient très efficaces pour éliminer le sommeil paradoxal, elles introduisent souvent un stress important à l’animal, comme une exposition à l’eau ou une fatiguephysique 7, ce qui peut perturber l’interprétation des résultats comportementaux et physiologiques. De même, les méthodes de souffle d’air et de stimulation physique conventionnelles tendent à transmettre des stimuli larges et non spécifiques au corps, ce qui entraîne une variabilité de l’intensité des stimuli et un choix limité des groupestémoins 4,8.

Nous avons mené une comparaison complète de la littérature couvrant plus de six décennies de recherches sur la privation de sommeil paradoxal paradoxal, fournie dans le Fichier Supplémentaire 1 et le Tableau Supplémentaire 1. Nous avons intégré des études historiques, mécanistiques, neurochimiques, hormonales et comportementales fondamentales issues des principales lignes de recherche, notamment Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen et Borbély. Le tableau supplémentaire 1 organise les travaux clés chronologiquement. Il retrace l’évolution méthodologique des techniques de privation du sommeil paradoxal et résume leurs principales observations biologiques, neurochimiques, hormonales, immunitaires, thermorégulatrices et comportementales. Puisque le présent manuscrit est structuré comme un article de méthodes plutôt qu’une revue historique complète, cela a été ajouté comme information complémentaire.

Pour remédier à ces limites, nous avons développé une méthode novatrice offrant une grande sélectivité pour la privation de sommeil paradoxal. Cette technique est conçue pour priver sélectivement les rongeurs du sommeil paradoxal de manière précisément contrôlée. Dans cette approche, nous limitons le stimulus au nez de l’animal — l’une des zones les plus sensibles chez lesrongeurs 9. De plus, nous utilisons un système de classification des stades du sommeil en temps réel par l’IA pour détecter et interrompre les épisodes de sommeil paradoxal avec une spécificitétemporelle 10. Ce système d’IA fait référence au signal EEG des 4 dernières années provenant d’un seul canal et évalue les stades actuels de sommeil de la souris. Cette configuration permet également la mise en œuvre de groupes témoins liés par le joug, permettant une intervention temporellement adaptée. Bien que classé comme une technique de privation de sommeil paradoxal basée sur la stimulation physique, notre protocole diffère des méthodes conventionnelles. Tout d’abord, nous avons appliqué une analyse en temps réel des stades du sommeil à l’aide de l’IA pour une intervention précise et cohérente spécifique au REM. Deuxièmement, elle limite la région de stimulation uniquement au sommet du nez, qui est l’une des zones les plus sensibles chez lasouris 6, ce qui entraîne une variation minimale de la durée et de la force de la stimulation. Enfin, nous avons récemment mis en place un groupe témoin attaché qui a reçu la même quantité de stimulation pour contrôler les facteurs de confusion. Ce protocole propose une méthode pour étudier les fonctions spécifiques au sommeil paradoxal.

Pour évaluer l’utilité de cette méthode, nous l’avons appliquée pour étudier le rôle du sommeil paradoxal dans la consolidation de la mémoire de peur trace. Des études antérieures ont rapporté que la privation de sommeil paradoxal altère la consolidation de la mémoire de peur dépendante de l’hippocampe, y compris les souvenirs de peurretardés 11,12. Cependant, il existe des preuves contradictoires quant à l’impact de la privation de sommeil paradoxal sur les processus de mémoire qui activent les circuits cérébraux distribués etcomplexes 5,13. La consolidation de la mémoire de la peur trace nécessite l’association d’un choc du pied (stimulus inconditionné), d’un signal auditif (stimulus conditionné) et de l’intervalle trace entre eux — un processus connu pour recruter plusieurs régions cérébrales, notamment l’hippocampe, le cortex préfrontal médian etl’amygdale 14. Par conséquent, nous avons privé les souris du sommeil paradoxal pendant 6 heures immédiatement après le conditionnement de peur trace15, une fenêtre temporelle connue comme cruciale pour la consolidation de la mémoire16. En utilisant ce protocole, nous avons évalué l’effet de la privation de sommeil paradoxal sur la consolidation des traces de mémoire qui dépendent de l’activité coordonnée des systèmes neuronaux distribués. Cet article présente une méthode novatrice décrivant un protocole expérimental détaillé testant les effets.

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Protocol

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Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Tsukuba. Des souris mâles et femelles C57BL/6J (11–13 semaines, 20–35 g) ont été utilisées dans cette étude. La liste complète des matériaux et instruments utilisés dans cette étude est fournie dans le tableau des matériaux.

1. Implantation chirurgicale d’électrodes EEG17

  1. Anesthésie et préparation de l’animal
    1. Induire une anesthésie avec 4 % d’isoflurane mélangé à de l’air en 3 minutes. Une anesthésie adéquate a été confirmée par l’absence du réflexe de retrait des pédales et du tonus musculaire, ainsi que par des schémas respiratoires stables.
    2. Rasez la région dorsale de la tête et du cou, de la nuque jusqu’à la zone entre les yeux, à l’aide d’un rasoir électrique. Quand une souris indique un éveil, comme un mouvement de moustache, provoquez à nouveau l’anesthésie.
  2. Fixation de la tête et exposition au crâne
    1. Fixez l’animal dans un cadre stéréotaxial, en assurant l’alignement nasal et crânien. De cette date jusqu’à la fin de toute l’opération, l’anesthésie a été maintenue en continu via un système de pompe vaporisatrice à isoflurane.
    2. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter la sécheresse cornéenne. Enlevez les poils restants avec une crème dépilatoire.
    3. Réalisez une incision médiane du cuir chevelu et rétractez doucement la peau pour exposer le crâne de la ligne de l’oreille postérieure à la ligne antérieure de l’œil. Retirez le tissu muqueusement avec un coton-tige-coton.
  3. Identification et nivellement des monuments
    1. Identifier bregma et lambda ; Ajustez le bras stéréotaxique pour que ces points soient à ±0,05 mm. Vérifiez que les coordonnées latérales ±3,0 mm de la bregma sont également de niveau (±0,05 mm).
  4. Perçage et placement des vis
    1. Marquez les coordonnées suivantes par rapport à la brème. Percez quatre trous pilotes comme coordonnées. Antérieur–postérieur / médial–latéral : +1,5 mm / ±1,5 mm, –3,0 mm / ±1,7 mm.
    2. Implantez des vis d’enregistrement EEG dans chaque trou et fixez-les avec une colle gel à base de cyanoacrylate. Enveloppez et couvrez le crâne et les pattes exposés avec une fine couche de ciment dentaire.
  5. Soins postopératoires
    1. Administrez 0,5 mL de solution de glucose à 5 % et 0,13 mL d’ibuprofène (ou d’analgésique équivalent).
    2. Ramenez la souris dans sa cage d’origine, une cage cylindrique en plexiglas (21,9 cm de diamètre, 31,6 cm de hauteur) placée à l’intérieur d’une chambre isolée (45,7 x 50,8 x 85,4 cm). La chambre est maintenue à une température de 23,5 ± 2,0 °C, une humidité relative de 50,0 % ± 10,0 %, et un cycle lumineux/sombre de 12 heures (phase claire : 9h00 à 21h00).
    3. Placez l’animal dans une cage de récupération chauffée. Attends devant la cage jusqu’à ce qu’une souris se réveille. Après l’opération, les animaux ont été maintenus dans des logements individuels et n’ont pas été renvoyés en groupe pendant toute la durée de l’expérience.

2. Manipulation et habituation

  1. Calendrier des expérimentations
    1. Commencez la manipulation pendant la phase légère 24 à 48 heures après l’opération. Continuez pendant quatre jours consécutifs.
  2. Procédure opératoire
    1. Le premier jour, mets une souris à portée de main pendant 2 minutes pour 2 fois. Placez la souris sur la paume ouverte de l’expérimentateur, les doigts étendus et la paume tournée vers le haut. Placez la paume légèrement plus haut que l’avant-bras, car les souris ont naturellement tendance à grimper sur des surfaces surélevées. Laissez la souris se déplacer librement sans contrainte ; Si la souris tente de grimper sur l’avant-bras, reposez-le doucement dans la paume en tenant légèrement la base de la queue. Chaque intervalle dure plus de 20 minutes. Cela doit être effectué pendant la phase lumineuse.
      REMARQUE : Si une souris saute de la main ou la mord, utilisez du tissu ou du papier mouchoir pour couvrir la main uniquement le premier jour. Les vêtements peuvent être réutilisés et doivent être lavés toutes les deux semaines.
    2. Du 2 au 4e jour, mets une souris à portée de main pendant 2 minutes 3 fois. Chaque intervalle et la période dirigée sont identiques au jour 1. Évaluer l’habituation comportementale : les souris non habituées tentent généralement de s’échapper en sautant ou en mordant violemment, tandis que les souris habituées explorent activement la paume avec peu de tentatives d’évasion et peu ou pas de morsures violentes.
    3. À la fin de la dernière séance de manipulation, connectez la souris au câble d’enregistrement EEG.
      REMARQUE : Lorsque le matériau de la literie est excessif pour gêner le nez d’une souris, cueillez-en manuellement et retirez-les pendant la manipulation ou au moment de la connexion.

3. Enregistrement EEG de référence

  1. Commencez par les jours 5 et 6 postopératoires. Enregistrez un EEG continu de 11h00 à 17h00 chaque jour. Si le matériau de la litière obstrue l’accès au nez de la souris, retirez progressivement l’excès de litière pour garantir un accès nasal clair tout en minimisant les perturbations pour l’animal lors d’un processus ultérieur.

4. Conditionnement de la peur18,19

  1. Commencez le jour 7 (ou 8) postopératoire entre 10h00 et 11h00. En préparation, vaporisez 70 % d’éthanol dans la chambre de conditionnement (30 x 25 x 24 cm), composée de parois en acrylique transparent et d’un plancher en grille en acier inoxydable (tiges de 2,0 mm de diamètre espacées de 6,0 mm).
  2. Protocole d’entraînement (session totale 1 100 s)
    1. Livrez cinq indices auditifs (son ascendant de 20 s, 5–20 kHz à 1,25 Hz, durée de 0,8 s) à 180 s, 400 s, 620 s, 840 s et 1060 s. Associez chaque signal sonore à un amortisseur de pied (1,0 mA, 2 s) délivré à 218 s, 438 s, 658 s, 878 s et 1098 s.

5. Privation de sommeil paradoxal paradoxal

  1. Groupe de privation de sommeil paradoxal (groupe RSD)
    1. Immédiatement après le conditionnement de la peur (ZT2-ZT8), surveillez l’EEG en temps réel en activant le système de classification des stades du sommeil basé sur l’IA pour permettre la détection en temps réel du sommeil paradoxal. Lors de la détection du sommeil paradoxal, chatouillez doucement le nez de l’animal avec un pinceau doux jusqu’à ce qu’il se réveille, avec une latence moyenne entre le début du stimulus et l’excitation de 0,89 ± 0,063 s (moyenne ± SEM).
    2. Au cours de l’expérience, l’excitation a été définie comme une réponse comportementale au stimulus tactile, en particulier au mouvement de la moustache après la stimulation. Notez l’horodatage de chaque chatouille pour une analyse ultérieure.
      REMARQUE : Le mouvement de chatouille a été effectué sans schéma directionnel fixe (par exemple, d’avant en arrière, vers le haut ou circulaire), tout en maintenant une stimulation tactile légère et constante limitée au sommet du nez. Si le nez est obstrué, la stimulation est dirigée vers la région vibreuse (moustache), qui est généralement exposée. Si la souris est tournée dos au pinceau, faites pivoter la cage selon les besoins pour assurer un accès libre à la région nasale. Lors de l’utilisation d’une cage à dessus ouvert, une stimulation peut également être appliquée depuis le haut pour assurer un accès nasal ou vibrissal cohérent.
  2. Groupe de contrôle engagé (groupe enjoué)
    1. Associez chaque souris en yoked à une pendant privée de REM. Appliquez des chatouilles sur le nez de la souris attachée en synchronisation avec les épisodes de sommeil paradoxal de son partenaire, en correspondant à la fois au début et à la durée. Chaque souris utilise le même pinceau dédié tout au long de l’expérience de privation de sommeil paradoxal. Après chaque utilisation, vaporisez la brosse avec de l’eau légèrement acide et essuyez avec du mouchoir. Prévoyez au moins 24 heures entre les utilisations pour vous assurer que le pinceau nettoyé est complètement sec.

6. Tests de rappel de la mémoire

  1. Test de rappel contextuel (Test A)
    1. Commencez à 24 h (±3 h) après la privation de sommeil. Remis la souris dans la chambre de conditionnement d’origine (avec une odeur d’éthanol à 70 %). Enregistrez le comportement de gel pendant 5 minutes.
  2. Test de rappel sonore (Test B)
    1. Conduisez la session 3 heures après l’Examen A.
    2. Préparation du contexte : Projection d’eau dans le contexte B (prisme triangulaire (30 cm de hauteur) composé de trois parois de 31 cm, 24 cm et 24 cm de longueurs latérales. Deux des murs sont recouverts de papier blanc, et le troisième mur est en acrylique transparent à travers lequel un rectangle bleu est visible en arrière-plan. La structure possède un sol en plastique et un plafond en acrylique transparent).
    3. Enregistrer le comportement de gel pendant 6 minutes. Donnez un signal auditif à 180 s identique à l’entraînement à 180 s.

7. Analyse des données

  1. Notation du stade du sommeil (Figure 1C-G)17
    1. Pour chaque éveil/NREM/REM, calculez le montant total, le nombre d’épisodes, la durée moyenne des épisodes et le nombre de transition du sommeil en fonction des données évaluées par des experts humains. Les critères de chaque étape sont les suivants.
      Sillage : basse amplitude, haute fréquence (β/γ)
      NREM : Haute amplitude, basse fréquence (δ)
      REM : faible amplitude, dominant thêta
  2. Qualité de privation (Figure 1B)
    1. Évaluez le stade du sommeil durant lequel chaque stimulus de chatouille est appliqué en comparant son horodatage avec les données EEG annotées par un expert humain.
  3. Comportement de gel (Figure 1H,J-K)
    1. Utilisez FreezeFrame4 (Actimétriques) pour quantifier l’immobilité (hors respiration) lors des tests de conditionnement de la peur et de rappel.
      1. Lance le logiciel FreezeFrame 4 et sélectionne le mode enregistreur . Depuis le menu Fichier (coin supérieur gauche), spécifiez le dossier de destination pour sauvegarder les fichiers d’enregistrement. Dans les quatre champs d’entrée blancs du panneau de gauche, entrez des identifiants uniques correspondant à chaque souris, assurant ainsi l’alignement avec les quatre fenêtres d’affichage des fichiers sur le côté droit de l’écran.
      2. Cliquez sur le panneau Protocole en bas de l’interface et définissez les paramètres d’enregistrement, y compris la durée totale de l’enregistrement et le timing des indices auditifs et des chocs de pied selon le plan expérimental.
      3. Cliquez sur Référence au centre de l’écran pour obtenir l’image de référence d’arrière-plan. Placez la souris dans la chambre de conditionnement, puis cliquez sur Démarrer pour commencer l’enregistrement.
  4. Analyse de l’indice de discrimination (Figure 1L)
    1. Calculez l’indice de discrimination selon la formule suivante :
      Congélation en 5 minutes moyenne au test A - Congélation dans les 3 premières minutes moyenne au test B) / congélation maximale en 5 minutes moyenne au test A, moyenne de gel dans les 3 premières minutes au test B.
  5. Analyse de l’indice de réactivité des chocs (Figure 1I)
    1. Utilisez la piste à la main pour mesurer le mouvement bidimensionnel des animaux 2 avant et après le choc lors d’une séance de conditionnement de la peur. Calculez l’indice de réactivité des chocs selon la formule suivante :
      Mouvement pendant le choc - Mouvement pré-choc / Mouvement pendant le choc + Mouvement pré-choc

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Results

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Implantation chirurgicale des électrodes EEG
Les souris doivent être complètement anesthésiées pendant l’opération. S’ils présentent des signes d’échec de l’anesthésie, comme des difficultés, ils doivent être retirés du protocole. De même, si le saignement dure plus de 10 s, il peut causer de graves dommages au cerveau de la souris, et il est recommandé de le retirer de l’expérience. Après l’opération, la plupart des souris se réveillent généralement dans l’heure qui ...

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Discussion

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Ce protocole permet la privation sélective du sommeil paradoxal chez les souris avec des souris témoins attachées. Contrairement aux méthodes traditionnelles telles que les techniques du pot de fleurs et du disque rotatif, ce système permet la mise en œuvre de groupes témoins finement assortis, dans lesquels les animaux reçoivent une stimulation identique au même moment circadien. De plus, cette approche minimise la variabilité de la localisation de la stimulation, une limitation courant...

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Disclosures

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgements

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Nous remercions Y. Nakata pour la classification du stade du sommeil. Nous remercions tous les membres de l’IIIS. Ce travail est soutenu par des subventions d’AMED JP21zf0127005, JP21km0908001, JP23wm0525003, de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (26H02428, 24H00894, 23H02784, 22H00469, 16H06280 à M.S., 23K19393 et 24K18212 à I.K., 25KJ0664 à C.K., 24H00893 à T.N.), et de la Takeda Science Foundation.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5 % de glucoseOtsukba35061410
En-tête 6 brochesHirose172-0989
AdhésifKonishi16351
Machine anesthésiqueShinano SeisakushoSN-487-0T
Boîtier sertisseurHirose688-9095
Douille sertieHirose688-8982
Freezeflame4Associés en médecineRRID : SCR_014429Version 4.104
GraphPad PrismGraphPadRRID : SCR_002798Version 10.5.0
IbuprofèneIndustrie chimique de TokyoI0415
IsofluraneViatris901036504
Loctite454HenkelUFI :  ; MAK2-7WRP-G202-F235
Souris (C57BL/6J)Le laboratoire JacksonRRID : IMSR_JAX :00066411,0 - 13,0 semaines d’âge lors de la séance de conditionnement de la peur
PinceauNamurataiseidou4943668000448SDflat n°8, longueur de pointe : 8,2 mm ; largeur : 18,8 mm
Liquide ProviniceShofu21400BZZ00451000250 mL
Poudre ProviniceShofu21400BZZ00451000250 g
SleepSignRecorderKISSEI COMTECRRID : SCR_018200Version 1.2.10
Vis en acier inoxydableYamazakiN/A&phi ; 1.0 & les fois ; 2.0
Instruments stéréotaxiques standardsALA Scientific68038
Huile de tournesolSigma-AldrichS5007-250ML
Pétrolatum blancTaiyo PharmaceuticalK09-TS

References

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