Article de méthode

Préconditionnement thermique lors de la perfusion pulmonaire ex-vivo pour la réhabilitation de greffons pulmonaires endommagés avant transplantation

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DOI :

10.3791/69084

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31 octobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente un modèle de perfusion pulmonaire ex-vivo chez le rat intégrant une exposition transitoire à un stress thermique calibré, favorisant des mécanismes de protection endogènes pour le reconditionnement thérapeutique des greffons pulmonaires endommagés. L’approche est évolutive et reproductible et soutient le développement de thérapies non médicamenteuses pour améliorer le succès de la transplantation pulmonaire.

Résumé

La perfusion pulmonaire ex-vivo (EVLP) est apparue comme une percée dans la transplantation pulmonaire, permettant à la fois l’évaluation fonctionnelle des poumons des donneurs et les interventions thérapeutiques pour réhabiliter les greffons marginaux. Les stratégies de reconditionnement comprennent des approches pharmacologiques et non pharmacologiques. Parmi ces derniers, nous avons démontré qu’un stress thermique transitoire et contrôlé (« préconditionnement thermique », TP) est un moyen efficace de restaurer les poumons endommagés en induisant une réponse de choc thermique protecteur endogène. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour un modèle EVLP de rat qui intègre la TP pour reconditionner les poumons soumis à une ischémie chaude, simulant le don après la mort circulatoire (DCD). Le protocole détaille la préparation pulmonaire, la canulation, la perfusion et l’induction de la réponse au choc thermique. La TP consiste en une augmentation de 30 minutes de la température de perfusat à 41,5 °C au début de l’EVLP, suivie d’un retour rapide à 37 °C pour le reste de la perfusion. Dans un modèle EVLP de 6 h, les poumons traités par TP (n = 30) ont montré une augmentation de l’expression de la protéine de choc thermique 70, une amélioration de la compliance pulmonaire statique, une réduction de l’œdème, une libération plus faible du facteur de von Willebrand (un biomarqueur des lésions endothéliales) et une atténuation des dommages histologiques par rapport aux témoins (n = 30). Le protocole permet de surveiller en temps réel la résistance vasculaire, les pressions des voies respiratoires, la compliance pulmonaire et l’oxygénation, et prend en charge les analyses moléculaires et morphologiques du perfusat et des tissus. Ce protocole reproductible et évolutif est adaptable à des systèmes EVLP animaux ou humains plus grands, fournissant une plate-forme translationnelle pratique pour l’étude d’interventions non pharmacologiques visant à améliorer les résultats de la transplantation.

Introduction

La perfusion pulmonaire ex-vivo (EVLP) a représenté une avancée majeure dans le domaine de la transplantation pulmonaire. Son impact principal réside dans l’élargissement du bassin de greffes pulmonaires de donneurs disponibles en permettant l’évaluation fonctionnelle des poumons marginaux pour permettre l’utilisation d’organes qui seraient autrement jetés pour la transplantation 1,2. Les poumons de donneurs marginaux (ou critères étendus) se réfèrent à un ou plusieurs des critères suivants : âge du donneur supérieur à 55 ans, PaO2/FiO2 inférieur à 300, temps d’ischémie supérieur à 6 h, microbiologie expectorative positive, radiographie anormale3. En plus de l’évaluation physiologique, l’EVLP peut servir de plate-forme pour l’application de diverses interventions thérapeutiques visant à améliorer la qualité du greffon avant la transplantation (concept de reconditionnement thérapeutique)4. En tant que tel, l’EVLP offre l’occasion unique de réhabiliter les poumons endommagés (marginaux) et de réduire le risque de dysfonctionnement primaire du greffon (DPI), une complication majeure compromettant à la fois les résultats précoces et à long terme après une transplantation pulmonaire 5,6. Le DPI est l’expression clinique du processus de lésion d’ischémie-reperfusion (IRI), dont la physiopathologie repose sur le stress oxydatif, l’inflammation, l’activation du complément et les cascades de coagulation, et l’induction des processus de mort cellulaire 7,8,9. En fin de compte, ces mécanismes contribuent à perturber les fonctions normales de l’endothélium et de l’épithélium pulmonaires, conduisant à un œdème pulmonaire non cardiogénique avec une capacité d’oxygénation réduite, les deux principales caractéristiques du DPI 6,10,11,12.

Un nombre croissant d’études expérimentales, tant précliniques que cliniques, ont démontré l’efficacité de diverses stratégies thérapeutiques ex-vivo pour atténuer l’IRI lors d’une transplantation pulmonaire. Les exemples incluent les agents pharmacologiques ciblant les oxydants et les radicaux libres, les voies de mort cellulaire, les médiateurs inflammatoires, ainsi que les thérapies cellulaires et géniques, pour n’en nommer que quelques-uns 13,14,15,16,17,18,19,20 . Au-delà de ces approches thérapeutiques, l’EVLP peut également servir de plate-forme pour l’application d’un stress physiologique directement sur le greffon pulmonaire, afin de susciter des mécanismes de protection intrinsèques offrant une tolérance adaptative aux agressions physiopathologiques ultérieures. L’une de ces stratégies consiste à appliquer un stress thermique transitoire et non létal à la greffe pulmonaire pendant l’EVLP. En effet, on sait depuis longtemps que les conditions de stress thermique favorisent une réponse adaptative au choc thermique, résultant de l’expression d’une série de protéines de choc thermique (HSP) agissant comme des chaperons moléculaires et conférant une résistance à une exposition ultérieure à divers stimuli stressants21. Outre l’induction de HSP, certaines adaptations cellulaires supplémentaires ont été identifiées à la suite d’une exposition à la chaleur, notamment (a) la voie antioxydante et cytoprotectrice du facteur 2 lié à NF-E2 (NRF2), dont l’activation lors du stress thermique régule notablement à la hausse le gène cytoprotecteur hème oxygénase22,23 ; (b) la réponse protéique dépliée (UPR), traitant du stress protéotoxique dans le réticulum endoplasmique (stress RE), et dont l’activation par la chaleur peut être protectrice ou préjudiciable, selon l’intensité du stress thermique 24,25,26 ; (c) l’autophagie, un processus cytoprotecteur favorisant la dégradation lysosomale des organites et des macromolécules endommagés, qui peuvent être activés ou inhibés par la chaleur en fonction de la température et du temps27,28.

Nous avons démontré qu’un tel « préconditionnement thermique » offre des avantages majeurs en termes de réduction du stress oxydatif, de l’inflammation, de la mort cellulaire et du dysfonctionnement endothélial, conduisant à une protection significative contre l’IRI pulmonaire. Par conséquent, nous avons proposé que le préconditionnement thermique puisse représenter une nouvelle méthode non pharmacologique pour la réhabilitation thérapeutique ex vivo de greffons pulmonaires endommagés avant la transplantation 29,30,31. Le préconditionnement thermique peut offrir plusieurs avantages par rapport aux stratégies pharmacologiques et non pharmacologiques existantes. En induisant une réponse endogène cellulaire intégrée, il peut simultanément fournir une protection contre des voies physiopathologiques distinctes relatives à l’IRI, alors que d’autres stratégies ciblent généralement une seule voie. De plus, il évite le risque d’effets secondaires potentiels associés à l’utilisation de composés pharmacologiques. L’objectif de cet article est de présenter un protocole détaillé, étape par étape, de préconditionnement thermique lors de la perfusion pulmonaire ex-vivo de poumons de rats endommagés, qui pourrait être appliqué dans divers contextes, notamment à des modèles animaux plus grands ou à des poumons humains à des fins de recherche.

Nous utilisons le système pulmonaire perfusé isolé chez le rat IPL-2 pour l’EVLP. La configuration est décrite à la figure 1 et comprend les éléments suivants : réservoir de perfusat (Figure 1-1) ; deux pompes à rouleaux, pour la circulation du perfusat (figure 1-2A) et l’échantillonnage du perfusat (figure 1-2B) ; un bain-marie thermostatique (Figure 1-3) pour le maintien de la température de perfusat ; un échangeur de gaz à membrane (figure 1-4) relié à un réservoir de gaz (non illustré) contenant un mélange de 6 % de O2, 10 % de CO2 et 84 % de N2 pour désoxygéner et carboxyler le perfusat d’entrée ; deux capteurs de pression (figure 1-5) pour surveiller les pressions de l’oreillette gauche (LA) et de l’artère pulmonaire (PA) (le capteur de pression PA n’est pas visible sur la figure) ; une chambre chauffée et scellée (Figure 1-6) abritant le bloc cœur-poumon avec des connexions dédiées pour les canules PA, LA, et trachéales ; un ventilateur (Figure 1-7) relié à la canule trachéale pour la ventilation pulmonaire et pour la mesure de la pression des voies respiratoires et de la compliance pulmonaire statique ; un thermomètre électronique (Figure 1-8) pour afficher la température de perfusat au niveau de l’entrée de PA. Une plate-forme de connexion (Figure 1-9) dont les éléments sont illustrés en détail à la Figure 2 : Connexion pour les canules PA (Figure 2-1), LA (Figure 2-2) et trachéale (Figure 2-3) ; connexion à un module de poids (Figure 2-4) pour la surveillance continue du poids du bloc cœur-poumon ; Un capteur de température (Figure 2-5) pour la surveillance de la température du perfusat à l’entrée du PA. Une description schématique détaillée du circuit se trouve ailleurs18.

Protocole

REMARQUE : Des rats Sprague-Dawley mâles adultes ont été utilisés pour cette étude (n = 60 ; âge, 8 à 11 semaines ; poids, 300 à 450 g). Les animaux ont été logés (2 rats/cage) dans notre animalerie locale, maintenue sous un cycle de 12 h de lumière / 12 h d’obscurité avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été traités conformément aux « Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals » (publication NIH n° 96-23), et toutes les expériences ont été réalisées dans le respect du protocole expérimental approuvé par notre comité local de protection des animaux (Direction Générale de l’Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l’Etat de Vaud (autorisations 3456a et 3456x1). La taille et le poids des animaux ont été sélectionnés sur la base de nos études précédentes dans le modèle EVLP du rat et pour des raisons de commodité anatomique (taille des poumons et des vaisseaux). La souche Sprague-Dawley a été choisie, étant donné que d’autres souches (notamment les rats Wistar) peuvent présenter des réactions d’hypersensibilité à la solution de dextran présente dans la solution de perfusat 1,32.

1. Description générale du circuit EVLP

REMARQUE : la configuration est décrite à la Figure 1 et les éléments de la plate-forme de connexion (Figure 1-9) sont illustrés en détail à la Figure 2. Une description schématique détaillée du circuit a été décrite précédemment18.

  1. Utilisez une solution extracellulaire acellulaire tamponnée pour la perfusion ex-vivo . Assurez-vous que le perfusat s’écoule du réservoir à travers l’échangeur de gaz et est dirigé à travers la canule PA pour la perfusion pulmonaire, puis sort par la canule LA vers le réservoir. Surveillez en permanence les pressions d’entrée (PA) et de sortie (LA).
  2. Connectez tous les transducteurs (pression PA, pression LA, poids pulmonaire, vitesse de la pompe) au convertisseur analogique/numérique (Figure 3). Ouvrez le logiciel BDAS (Basic Data Acquisition Software). Calibrez les signaux de pression à l’aide d’un étalonnage en deux points (0 ; 10 cm H2O) à l’aide d’une colonne d’eau. Calibrez le module de poids à l’aide d’un étalonnage en deux points (0 g et 1 g). Calibrer la vitesse de la pompe à l’aide d’un échantillonnage au perfusat de 1 min à 10 mL/min. Contrôlez la qualité des signaux en appliquant des pressions et une vitesse de pompe connues et en évaluant l’adéquation des résultats (le protocole détaillé et la vidéo pour l’étalonnage des signaux sont disponibles dans les documents supplémentaires).
  3. Enregistrez tous les paramètres clés (PA, pression LA, poids pulmonaire et débit) en temps réel à l’aide du logiciel système et observez leur affichage visuel sur un ordinateur personnel.
    REMARQUE : Les signaux physiologiques enregistrés par le BDAS sont exportés dans un fichier texte à l’aide de la commande Exportation de fichier dans la barre de menus. Les données extraites à des moments sélectionnés (toutes les 60 minutes) sont transférées dans une feuille de calcul, puis copiées/collées dans le logiciel pour une analyse statistique.
  4. Calculer la résistance vasculaire pulmonaire (PVR) à l’aide de l’équation (1) :
    figure-protocol-1(1)
  5. Prélever des échantillons (1 à 2 ml) du perfusat à des moments précis pour les mesures de divers marqueurs biologiques.

2. Application de préconditionnement thermique

  1. Connectez un bain-marie thermostatique (Figure 4-1) pour assurer une température de l’eau constante, précise et réglable pour le chauffage par perfusat. Utilisez une motopompe intégrée à l’intérieur du bain-marie pour faire circuler l’eau chauffée.
  2. Utilisez un récipient en verre à double paroi comme réservoir (figure 4-2) pour maintenir la température de perfusat en faisant circuler de l’eau chauffée entre les parois du récipient.
  3. À l’aide d’un serpentin chauffant muni d’un tube serpentin à l’intérieur d’un récipient d’eau chauffée (figure 4-3), le perfusat peut être échangé, ce qui permet l’échange de chaleur entre l’eau et le perfusat immédiatement avant qu’il n’entre dans la préparation pulmonaire ex vivo.
  4. Abritez le bloc cœur-poumon dans la chambre de l’organe (figure 4-4), un récipient à double paroi rempli d’eau circulant du bain-marie thermostatique pour maintenir un environnement chaud.
  5. Pour le capteur de température et le thermomètre (figures 2-5 et 4-5), appliquez fermement et solidement un capteur d’air/surface à billes de type K contre la canule d’entrée pour une surveillance continue de la température réelle du perfusat entrant dans l’artère pulmonaire (AP). La température est affichée sur un thermomètre numérique.
  6. Pour maintenir la température de l’entrée à 37 °C, réglez le bain-marie à 38-38,5 °C.
    REMARQUE : Pour compenser les pertes de chaleur dues au perfusat le long de son parcours dans le tube, nous avons déterminé dans nos conditions que la température du bain d’eau devait être réglée à 38-38,5 °C pour maintenir 37 °C à l’entrée. En fonction des pertes de chaleur dues au perfusat, il peut être nécessaire d’adapter ces paramètres pour garantir la température souhaitée à l’entrée.
  7. Initier le protocole de chauffage ex-vivo après 60 min d’EVLP en augmentant la température du bain d’eau jusqu’à 43 °C pour atteindre une température d’entrée de 41,5 °C, qui s’obtient sur 5 min et se maintient sur 30 min.
    REMARQUE : Dans notre travail précédent29, nous avons déterminé la température optimale pour le préconditionnement thermique (TP), en utilisant une plage de températures de 40 °C à 43,5 °C et un protocole EVLP de 3 h, comme illustré à la figure 5. La température de chauffage offrant une protection optimale sans aucun effet nocif (comme résumé à la figure 5B) s’est avérée être de 41,5 °C. Cette température a donc été utilisée dans toutes nos expériences ultérieures, avec des durées EVLP allant jusqu’à 6 h29,30,31.
  8. Après ce chauffage transitoire, ajoutez de la glace dans le bain-marie pour réduire rapidement (en 5 min) la température du bain d’eau à 38 °C pour ramener la température de perfusat dans la canule d’entrée à 37 °C et maintenir cette température jusqu’à la fin du protocole EVLP.
  9. Déterminer les variables physiologiques (compliance pulmonaire), la formation d’œdèmes et les paramètres moléculaires (expression des protéines de choc thermique, des enzymes antioxydantes, des cytokines inflammatoires et des biomarqueurs de l’apoptose, de l’autophagie, du stress du réticulum endoplasmique et des lésions des cellules endothéliales).

3. Protocole EVLP détaillé pour le préconditionnement thermique

  1. Préparation des animaux
    1. Préparez le matériel requis, y compris les canules et les instruments chirurgicaux (figure 6A, B et tableau des matériaux).
    2. Pesez l’animal pour calculer les doses appropriées pour toutes les substances administrées, le débit de perfusat et les paramètres de ventilation.
    3. Préparez le mélange anesthésique : 80 mg/kg de kétamine et 8 mg/kg de xylazine dans la même seringue.
      REMARQUE : Les agents anesthésiques doivent être stockés dans une armoire sécurisée.
    4. Préparez de l’héparine de 1,7 U/g de poids corporel dans une solution saline isotonique (seringue de 1 ml).
    5. Anesthésier l’animal à l’aide d’isoflurane à 5 % (vaporisé dans une chambre d’induction dédiée), puis injection intrapéritonéale du mélange anesthésique préparé. Maintenez l’anesthésie avec 1 à 2 % d’isoflurane à l’aide d’un masque facial.
      REMARQUE : Il est important de maintenir une anesthésie profonde pour éviter de haleter pendant l’exsanguination.
      Utilisez une configuration avec un système d’extraction d’isoflurane pour protéger l’opérateur.
      Jetez toutes les aiguilles et seringues dans des contenants appropriés pour les déchets biologiques et tranchants. Les contenants scellés, tranchants et présentant un risque biologique sont ensuite éliminés dans les flux de déchets désignés.
    6. Rasez l’animal de la gorge jusqu’à la région du pénis et retirez toute fourrure restante à l’aide de papier humide et chaud.
    7. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant la patte arrière ; Augmenter la concentration d’isoflurane si des réflexes sont présents.
    8. Placez l’animal en position couchée et fixez les quatre membres à l’aide de ruban adhésif.
  2. Extraction du bloc cœur-poumon pour l’EVLP
    REMARQUE : La procédure nécessite une formation intensive pour effectuer les différentes étapes de manière opportune, non traumatique et hautement reproductible. L’étape la plus délicate est la canulation de l’artère pulmonaire, qui doit être réalisée sous grossissement à l’aide d’un microscope opératoire spéculaire pour obtenir les meilleurs résultats. La procédure complète peut être effectuée par un seul enquêteur bien formé. Pour atteindre une telle indépendance expérimentale, un minimum de 15 procédures complètes sous la supervision d’un chercheur expérimenté est requis.
    1. Soulevez doucement la peau sur la ligne médiane de la gorge et faites une incision longitudinale de 5 cm le long de l’axe caudal à céphalique à l’aide de petits ciseaux.
    2. Séparez les lobes des glandes salivaires et disséquez soigneusement le fascia sur les muscles sterno-hyoïdiens à l’aide d’une pince incurvée jusqu’à ce que le larynx et la trachée soient clairement exposés.
    3. Passez une suture en soie 4-0 sous la trachée et préparez un nœud pré-fait, en laissant la pince en place sous la trachée.
    4. Calculez le volume courant (Vt) pour la ventilation in vivo et l’approvisionnement pulmonaire à l’aide de la formule33 de Stahl :
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. Réglez le ventilateur dédié à la ventilation in vivo et à l’approvisionnement pulmonaire (voir la table des matériaux) sur le volume courant calculé avec une fréquence respiratoire de 70 respirations/min, une fraction inspirée d’oxygène (FiO2) de 0,5 et une pression expiratoire positive (PEP) de 3 cm H2O.
      REMARQUE : Pour régler la PEP à 3 cm H2O, connectez le bras expiratoire du ventilateur à un tube en silicone durci au platine inséré à 3 cm sous la surface d’un récipient rempli d’eau.
    6. Créez une incision transversale entre deux anneaux cartilagineux, insérez une canule de 2 mm de diamètre extérieur (14 mm de longueur, canule de ventilation EVLP, Figure 6B) pour la ventilation et fixez-la en serrant la suture.
    7. Connectez la canule au ventilateur et confirmez l’efficacité de la ventilation par la présence de bulles dans le récipient rempli d’eau relié au bras expiratoire du ventilateur.
    8. À l’aide de ciseaux à bout émoussé, incisez la peau le long de l’abdomen et pénétrez dans la cavité péritonéale, continuez en incisant les muscles de la paroi abdominale médiane jusqu’au diaphragme.
    9. Écartez doucement les intestins à l’aide de cotons-tiges pour exposer la veine cave inférieure.
    10. Injectez la solution d’héparine préparée dans la veine et laissez-la circuler pendant 5 min. Ensuite, transectez la veine cave et l’aorte pour l’exsanguination.
    11. Une fois que l’animal est complètement exsangue et que la mort est confirmée, arrêtez la ventilation et débranchez le ventilateur de la canule trachéale pour permettre aux poumons de se dégonfler, marquant le début de l’ischémie chaude. Maintenez le temps ischémique chaud total (WIT) à 1 h.
      REMARQUE : Bien que la durée médiane rapportée dans le don clinique de poumons DCD soit de 33 min, aucun effet néfaste d’une durée allant jusqu’à 60 minutes sur la survie à 1 an n’a été signalé. Par conséquent, la plupart des centres s’accordent actuellement sur 60-90 min comme limite supérieure acceptable deWIT 34. Comme détaillé précédemment, l’utilisation de 1 h WIT dans notre modèle de rat est donc pertinente pour le scénario clinique35.
    12. Quinze minutes avant la fin du temps d’ischémie à chaud total de 1 h (c’est-à-dire après 45 min d’ischémie à chaud), remplissez une seringue de 60 mL (fixée sur un support) avec une solution de conservation froide (4 °C, conservée au réfrigérateur) (voir composition dans le tableau 1).
      REMARQUE : Le bas de la seringue est placé à 20 cm au-dessus de l’animal. Connectez la seringue à la canule PA à l’aide d’un tube en silicone immergé dans de l’eau glacée (Figure 6C).
    13. Effectuez une sternotomie médiane à l’aide de ciseaux Lister à extrémité émoussée pour éviter d’endommager les tissus et rétractez soigneusement la paroi thoracique à l’aide d’écarteurs émoussés attachés à des bandes élastiques et d’un hémostat micro-moustique attaché au diaphragme pour exposer les poumons. Eviter tout contact direct avec le parenchyme pulmonaire.
      REMARQUE : À partir de cette étape, pour éviter le dessèchement des tissus, appliquez une petite quantité de solution saline physiologique à la surface du poumon lorsque nécessaire.
    14. Faites une incision en « X » à l’apex du ventricule gauche du cœur et faites glisser les ciseaux à l’intérieur du cœur jusqu’à l’oreillette gauche pour faciliter l’insertion ultérieure de la canule LA.
    15. Passez une suture en soie 5-0 sous l’AP principal et préparez un double nœud pré-noué et tenez la suture d’un côté avec un support fait maison (Figure 6D et Figure 7A).
    16. Préparez une suture supplémentaire autour du cœur pour la fixation ultérieure de la canule AL (Figure 7B).
    17. Faites une petite incision dans l’AP principal et insérez la canule PA, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite.
    18. Perfuser immédiatement les poumons avec 25 ml de la solution de conservation du rhume via la canule PA, initiant le temps d’ischémie froide.
      REMARQUE : Utilisez une pression passive à partir de la hauteur de la seringue sur le support décrit ci-dessus pour cette perfusion.
    19. Fixez la canule en place avec la suture pré-attachée.
    20. Immédiatement après la canulation PA, reconnectez la canule trachéale au ventilateur et reprenez la ventilation avec les réglages initiaux, en réduisant la fréquence respiratoire à 25 respirations/min.
    21. Insérez la canule AL à travers l’incision du ventricule gauche dans l’oreillette gauche.
    22. Fixez la canule avec la deuxième suture pré-attachée (autour du cœur), en prenant soin d’éviter que l’écoulement ne soit entravé par l’oreillette gauche et laissez passer tout le volume de 25 ml de solution de conservation froide (cela prend ~15 min).
    23. À la fin de la perfusion de la solution de conservation, clampez la canule PA à l’aide d’une pince bouledogue (Figure 7C, cercle bleu) et débranchez-la de la tubulure.
    24. Disséquez soigneusement la trachée et les tissus environnants pour mobiliser les poumons.
    25. Clamper la trachée à l’aide d’une pince d’anévrisme (figure 7C, cercle rouge), pendant que les poumons sont complètement gonflés (un volume courant).
    26. Disséquez l’aorte descendante et les autres vaisseaux de soutien pour libérer le bloc cœur-poumon, en le soulevant en saisissant doucement la trachée.
    27. Placez le bloc cœur-poumon dans un plat contenant une solution de conservation en position couchée et conservez-le à 4 °C pendant un temps total d’ischémie à froid de 1 h.
      REMARQUE : À la fin de l’opération, placez les restes biologiques dans des sacs d’élimination des déchets pour une élimination ultérieure par le service dédié.
  3. Ex-vivo perfusion pulmonaire et préconditionnement thermique
    REMARQUE : Se reporter à l’organigramme décrivant les principales étapes pour guider la progression à travers les différentes étapes du protocole (Graphique 8).
    1. Placez un seau à glace dans le bain-marie thermostatique pour réduire la température de perfusat à 15 °C.
    2. Remplissez le réservoir de 100 ml de perfusat et laissez-le circuler dans le système. Utiliser la solution de perfusion à base d’albumine humaine (voir composition dans le tableau 1) comme solution extracellulaire tamponnée acellulaire pour la perfusion ex-vivo .
    3. Mesurez le pH du perfusat et maintenez-le à un niveau physiologique (7,35-7,45), ajoutez un tampon de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (THAM) en conséquence.
    4. Pesez le bloc cœur-poumon et montez-le sur le système EVLP, en commençant par la canule de ventilation tout en maintenant le clip d’anévrisme en place sur la trachée.
    5. Connectez la canule PA en évitant soigneusement l’introduction de bulles d’air dans le système vasculaire pulmonaire (assurez-vous que le piège à bulles est rempli).
    6. Laissez sortir quelques gouttes de la solution de perfusion et connectez la canule LA.
    7. Réglez la pression auriculaire gauche à 3 mm Hg en ajustant la hauteur de la conduite d’écoulement reliée au circuit de drainage.
    8. Mettez à zéro le module de poids et surveillez l’évolution du poids du bloc cœur-poumon tout au long de l’EVLP.
    9. Calculez le débit cardiaque (CO) théorique à l’aide de la formule développée par Lindstedt et Schaeffer :
      figure-protocol-4
    10. Commencer la perfusion (2 % du CO théorique) et augmenter progressivement le débit de perfusat (7,5 % du CO théorique) et la température en fonction des paramètres spécifiés, comme indiqué dans le tableau 2.
      REMARQUE : Pendant l’EVLP, le débit de perfusat est réglé entre 2 % et 7,5 % du CO théorique calculé. Ce faible débit de perfusat permet de maintenir la pression artérielle pulmonaire dans les limites normales et de réduire le risque d’œdème pulmonaire précoce, en particulier dans les poumons ischémiques chauds. Cela permet aux utilisateurs de maintenir la préparation pendant de longues périodes. D’autres chercheurs ont utilisé des débits comparables pour l’EVLP du rat, tandis que d’autres ont utilisé des débits allant jusqu’à 20 % du CO38 théorique.
    11. Ajustez la température du perfusat en augmentant progressivement la température du bain-marie.
      REMARQUE : Assurez-vous de garder les mains à l’écart de tout équipement de chauffage pour éviter d’éventuelles blessures.
    12. Une fois que la température du perfusat atteint 35 °C, initier la ventilation mécanique en retirant le clip d’anévrisme de la trachée et en démarrant le ventilateur dédié à la ventilation ex-vivo (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : L’étalonnage de la pression est effectué tous les 14 jours à l’aide d’un étalonnage en deux points (0 et 30 cm H2O). L’étalonnage des tubes est effectué à chaque utilisation selon un protocole programmé, afin de corriger les facteurs externes liés à la résistance des tubes et de la canule.
      1. Utilisez le logiciel référencé pour le réglage du ventilateur et l’acquisition de données, car il fournit des enregistrements continus des signaux respiratoires et de la compliance pulmonaire à des points temporels dédiés (voir organigramme, figure 8), selon un protocole programmé d’augmentation progressive du volume pulmonaire avec mesure concomitante de la pression des voies respiratoires.
      2. La compliance est ensuite calculée automatiquement par une équation ajustée à la branche de dégonflage de la boucle de volume de pression (équation de Salazar-Knowles).
      3. Affichez toutes les données ventilatoires, stockez-les sur un ordinateur personnel dédié et exportez-les vers une feuille de calcul. Extrayez des données à des moments sélectionnés, transférez-les dans une autre feuille de calcul, puis copiez/collez-les dans le logiciel d’analyse statistique.
    13. Régler la fréquence respiratoire et le volume courant à 7 coups/min et 3 ml/kg, respectivement, pendant 10 minutes, puis augmenter à 15 coups/min et 6 ml/kg pendant 10 minutes et enfin, 30 coups/min et 6 ml/kg jusqu’à la fin de l’EVLP. Réglez la pression positive en fin d’expiration (PEP) à 3 cm H2O tout au long de l’EVLP (Tableau 2).
    14. Appliquer une manœuvre de recrutement toutes les 30 min d’EVLP pour prévenir l’atélectasie en réglant la pression des voies respiratoires à 15 cm H2O pendant 6 s.
    15. À 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h et 6 h EVLP, appliquer un gonflage pulmonaire par étapes jusqu’à un volume pulmonaire total de 10 mL/kg de poids corporel pour déterminer la compliance pulmonaire et la pression inspiratoire maximale (Pmax).
      REMARQUE : Les mesures de conformité sont effectuées à la suite d’une manœuvre de recrutement décrite ci-dessus.
    16. Augmentez la température du perfusat pour atteindre 37 °C au niveau de la canule PA d’entrée après 60 min EVLP.
    17. Initier le protocole de chauffage ex-vivo après 60 min d’EVLP.
    18. Augmentez la température du bain-marie jusqu’à 43 °C pour atteindre 41,5 °C au niveau de la canule PA d’entrée (cela prend ~ 5 min), comme illustré sur les figures 2, 3 et 4-5.
    19. Maintenez cette température de 60 min à 90 min EVLP (total de 30 min).
      REMARQUE : Dans nos travaux précédents, nous avons montré que 41,5 °C pendant 30 min ne favorisait pas les lésions thermiques au niveau de l’ensemble du poumon29. Nous n’avons pas effectué d’essais spécifiques de viabilité cellulaire in vitro pour tester les lésions thermiques dans de telles conditions.
    20. Après 30 min de chauffage, ajoutez de la glace dans le bain-marie pour régler rapidement (5 min) la température à la canule d’entrée à 37 °C.
      REMARQUE : Dans le groupe témoin, la température du perfusat est maintenue à 37 °C pendant toute la durée de l’EVLP, sans application de préconditionnement thermique (voir tableau 2). Nous n’incorporons pas de groupe de « chauffage fictif » (par exemple, par ajustement de la chaleur du bain d’eau sans élévation de la température).
    21. Maintenir la température du perfusat à 37 °C au niveau de la canule d’entrée PA jusqu’à la fin de l’EVLP.
    22. Prélever des échantillons de solution de perfusat à 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h (1 à 2 mL à chaque point temporel) et 6 h (10 mL) d’EVLP, à partir de l’un des ports d’échantillonnage connectés au circuit (en amont ou en aval de la préparation pulmonaire), comme l’illustre la figure 1-2B. Utiliser immédiatement des échantillons pour l’analyse des gaz (mesure du pH, de la PCO2 et de la PO2, à l’aide de la cartouche CG4+). Pour d’autres mesures biochimiques, centrifuger les échantillons (500 × g, 10 min à 4 °C) et maintenir le surnageant clair à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
    23. Après 6 h EVLP, réappliquez le clip d’anévrisme sur la trachée (une fois le poumon complètement gonflé) et clampez la canule PA avec une pince bulldog.
    24. Pesez le bloc cœur-poumon pour obtenir son poids final.
      REMARQUE : l’augmentation du poids pendant l’EVLP peut être évaluée comme la différence entre le poids final et le poids initial ou peut être surveillée en permanence pendant l’EVLP avec le module de poids décrit ci-dessus.
    25. Disséquez soigneusement les poumons, en séparant les lobes individuels.
    26. Préserver le tissu pour les applications en aval : congélation instantanée dans de l’azote liquide et stockage à -80 °C pour les analyses biochimiques ou fixation dans du paraformaldéhyde (PFA) pour l’évaluation histologique. Le poumon gauche peut être conservé et préparé pour la transplantation pulmonaire.

4. Statistiques

  1. Répartir les animaux dans des groupes de traitement spécifiques (témoin ou préconditionnement thermique, n = 5/groupe pour chaque paramètre expérimental).
    REMARQUE : Nous n’attribuons pas les animaux au hasard à l’un ou l’autre des groupes, mais les groupes sont alternés chaque jour. Le protocole (chaleur vs contrôle) ne peut pas être réalisé en aveugle, en raison de la nécessité de connaître strictement la température du perfusat pendant les expériences. En revanche, les analyses biologiques et histologiques sont effectuées en aveugle, sans identification du groupe de traitement attribué.
  2. Analysez les données.
  3. Exprimer les résultats comme des moyens ± SEM.
  4. Vérifiez la distribution normale des données à l’aide du test de Kolmogorov-Smirnov.
  5. Pour les expériences ponctuelles dans le temps, évaluez les effets de l’allocation du temps et du groupe à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs, suivie du test post-hoc de Sidak pour les effets de groupe et de la correction de Bonferroni pour les effets temporels, en utilisant 1 h comme référence. Considérons une valeur p < 0,05 comme statistiquement significative. Envisager la transformation logarithmique des données en cas de distribution non normale avant d’appliquer l’ANOVA.
  6. Pour les analyses histologiques, déterminer (en aveugle) le score de lésion pulmonaire de chaque échantillon, en quantifiant l’œdème périvasculaire dans 10 champs/coupe.
    1. Utilisez le nombre relatif de vaisseaux présentant un œdème périvasculaire (A) : 0 : absent ; 1 : légère (<25 %) ; 2 : modérée (25 à 50 %) ; 3 : sévère (>50 %).
    2. Utilisez l’épaisseur de l’œdème périvasculaire (B), calculée en pourcentage du diamètre des vaisseaux internes (0 : pas d’œdème ; 1 : <25 % ; 2 : 25-50 % ; 3 : >50 %).
    3. Utilisez la somme de A + B dans les 10 sections examinées pour calculer le score31.
    4. Effectuer des comparaisons statistiques à l’aide du test de Mann-Whitney non paramétrique (en raison d’une distribution non normale des données), avec une signification attribuée à p < 0,05.

Résultats

Les variables physiologiques pulmonaires sont surveillées en permanence tout au long de la procédure, y compris la pression artérielle pulmonaire (PAP), la résistance vasculaire pulmonaire calculée et les paramètres ventilatoires, y compris la compliance pulmonaire statique (SPC) et la pression artérielle maximale (Pmax). De plus, le module de poids permet d’évaluer la formation d’œdème en fournissant une mesure indirecte de l’accumulation de liquide dans les poumons. Les avantages du préconditionnement thermique (TP) par rapport aux poumons témoins (Ctrl) comprennent une amélioration du SPC (Figure 9A, exprimé comme le rapport du SPC à chaque point temporel par rapport à la valeur SPC initiale, n = 5/groupe) et une réduction du gain de poids pulmonaire (Figure 9B, n = 5/groupe) pendant l’EVLP. Les données sont présentées comme des moyens ± SEM.

Le liquide perfusatif peut être dosé pour divers biomarqueurs. Par exemple, le préconditionnement thermique est associé à une libération significativement réduite de von Willebrand (vWF), un biomarqueur de cellule endothéliale à la fin de l’EVLP (Figure 9C, n = 5/groupe, moyennes ± MEB).

Les analyses morphologiques du tissu pulmonaire obtenues à la fin de l’EVLP comprennent l’histologie et l’immunohistochimie. Des exemples de coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) sont présentés à la figure 9D, montrant une réduction des lésions histologiques dans les poumons exposés au préconditionnement thermique, exprimée en score de lésion pulmonaire (figure 9E, n = 5/groupe). Le score a été établi en quantifiant l’œdème périvasculaire dans 10 champs/section (voir les étapes 4.6.1 et 4.6.2 du protocole). La somme de A + B dans les 10 sections examinées a été utilisée pour calculer le score31.

Les analyses moléculaires dans le tissu pulmonaire à la fin de l’EVLP incluent le profilage d’expression de l’ARN ou des protéines. À titre d’exemple, les niveaux d’expression protéique de la protéine de choc thermique inductible HSP70 peuvent être mesurés par ELISA, pour montrer le développement de la réponse au choc thermique dans les poumons exposés à un préconditionnement thermique (Figure 9F, montrant une expérience de parcours temporel avec différentes durées d’EVLP, n = 5/groupe à chaque point temporel). L’expression de HSP70 dans le groupe TP a atteint un pic après 3h d’EVLP, c’est-à-dire 90 minutes après la fin de l’EVLP, et est restée stable par la suite jusqu’à la fin de l’EVLP. Les données sont présentées comme des moyens ± SEM.

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Figure 1 : Description de la plateforme EVLP. (1) Réservoir à double paroi pour le perfusat. (2A) Pompe à rouleaux pour la circulation du perfusat. (2B) Pompe à rouleaux pour l’échantillonnage du perfusat (mesures biochimiques et analyses de gaz). (3) Bain-marie thermostatique. (4) Échangeur de gaz à membrane relié à un réservoir de gaz (non illustré). (5) Capteur de pression auriculaire gauche. (6) Chambre chauffée et scellée. (7) Ventilateur EVLP. (8) Sonde de température et thermomètre. (9) Plate-forme de connexion du bloc cœur-poumon, dont les éléments sont détaillés à la figure 2. (Remarque : le capteur de pression PA n’est pas visible). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Plate-forme de connexion pour le bloc cœur-poumon. (1) Canule d’entrée dans l’artère pulmonaire. (2) Canule d’écoulement de l’oreillette gauche. (3) Connexion pour la canule trachéale. (4) Module de poids. (5) Sonde de température conçue en interne solidement fixée contre la canule d’entrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Transducteurs/amplificateurs de signal et boîtier de conversion analogique/numérique. (A). Transducteur/amplificateur de pression artérielle pulmonaire. (B). Régulateur de débit de vitesse de pompe. (C). Transducteur/amplificateur de pression auriculaire gauche. (D). Module de poids pulmonaire. (E). Convertisseur analogique/numérique. (F). Ordinateur personnel pour l’affichage et l’enregistrement des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Maintien de la température du perfusat pendant l’EVLP. (1) Bain-marie thermostatique. (2) Réservoir de perfusat avec récipient en verre à double paroi où circule l’eau du bain-marie thermostatique. (3) Tube de serpentin chauffant à l’intérieur d’un récipient d’eau chauffée relié au bain-marie thermostatique. (4) Chambre d’orgue avec récipient en verre à double paroi pour la circulation de l’eau chaude du bain-marie. (5) Thermomètre électronique et sonde de température conçus en interne solidement fixés contre la canule d’entrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Identification de la température optimale pour le préconditionnement thermique. (A) Protocole EVLP pour l’évaluation des différentes températures de chauffage. De 60 min à 90 min d’EVLP, la température de perfusat a été augmentée aux températures indiquées. À 90 min d’EVLP, la température est revenue à 37 °C pendant 90 min jusqu’à la fin de l’EVLP, où diverses mesures physiologiques et moléculaires ont été effectuées. (B) Résumé des résultats des effets des différentes températures de chauffage sur les paramètres physiologiques et moléculaires (le vert indique les effets favorables, le rouge indique les effets défavorables et l’orange indique les effets mixtes). La température de chauffage de 41,5 °C a fourni les effets les plus protecteurs. Abréviations : EVLP = perfusion pulmonaire ex-vivo ; TP = préconditionnement thermique. Cette figure a été modifiée à partir d’Ojanguren et al.21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Matériel chirurgical. (A) Instruments pour l’extraction du bloc cœur-poumon : porte-clip d’anévrisme et microclip d’anévrisme (système Yasargil), pince bouledogue, ciseaux, microciseaux, écarteurs fixés à des élastiques. (B) Canules EVLP pour l’artère pulmonaire (AP), l’oreillette gauche (LA) et la trachée. (C) Système de perfusion fait maison pour le rinçage des poumons au perfusat froid. La distance entre le niveau du PA chez l’animal et le bas de la seringue est fixée à 20 cm. (C) Support fait maison. (Non illustré : microscope chirurgical, ventilateur et système d’anesthésie). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Images représentatives de la préparation chirurgicale (A) Nœud pré-noué autour de l’artère pulmonaire. (B) Nœud pré-noué autour de l’extrémité du cœur. (C) Pince Bulldog (cercle bleu) sur la canule PA et clip d’anévrisme (cercle rouge) sur la trachée. Abréviation : PA = artère pulmonaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Organigramme. Des étapes majeures pour guider la progression à travers les différentes étapes du protocole. La période entre 1 h et 1,5 h EVLP est amplifiée pour indiquer le protocole de traitement en fonction de l’affectation du groupe (contrôle vs préconditionnement thermique). Abréviations : IC = ischémie par le froid ; EVLP = perfusion pulmonaire ex-vivo ; PA = artère pulmonaire ; RCP = compliance pulmonaire statique ; TP = préconditionnement thermique ; WI = ischémie chaude. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 9 : Résultats représentatifs des effets du préconditionnement thermique dans les poumons de rats endommagés. Les poumons endommagés par 1 h d’ischémie chaude ont été perfusés dans un système EVLP pendant 6 h. De 60 à 90 min d’EVLP, un groupe de poumons a été soumis à un préconditionnement thermique à 41,5 °C (groupe TP). Un groupe témoin de poumons a été maintenu à 37 °C tout au long de l’EVLP. (A) Compliance pulmonaire statique (SPC), exprimée en rapport entre la valeur initiale, chez les poumons de contrôle (Ctrl, n = 5) et de TP (n = 5). Le SPC était mieux conservé dans les poumons TP. (B) Prise de poids des poumons pendant l’EVLP chez les poumons témoins (n = 5) et TP (n = 5). Il y a eu une réduction significative de la formation d’œdème dans le groupe TP. (C) La libération dans le perfusat du biomarqueur des cellules endothéliales du facteur von Willebrand a été supprimée dans le groupe TP (n = 5) par rapport aux témoins (n = 5). (D) Aspect macroscopique et microscopique pulmonaire (coloration à l’hématoxyline-éosine) à la fin de l’EVLP chez les poumons témoins (n = 5) et TP (n = 5). (E) Le score de lésion pulmonaire (pour la quantification des lésions histologiques) était plus faible dans le groupe TP (n = 5) que dans le groupe témoin (n = 5). (F) Niveaux protéiques de la protéine de choc thermique inductible HSP70 dans les extraits de tissus pulmonaires mesurés après 1, 2, 3, 4,5 et 6 h EVLP dans les groupes témoins et TP (n = 5/groupe à chaque point temporel), montrant une réponse marquée au choc thermique dans le groupe TP. L’expression de HSP70 dans le groupe TP a atteint un pic après 3 h EVLP (90 min après la fin de l’EVLP) et est restée stable par la suite jusqu’à la fin de l’EVLP.
Tous les graphiques montrent les moyennes ± SEM. Pour les expériences sur le parcours temporel (A-C,F), des comparaisons statistiques ont été effectuées à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs, suivie du test de Sidak pour l’effet de groupe et des ajustements de Bonferroni pour l’effet du temps (avec le temps 1 h comme référence). Pour le score de lésion pulmonaire (E), des comparaisons statistiques ont été effectuées à l’aide du test de Mann-Whitney. * p < 0,05 (différences intergroupes), † p < 0,05 vs 1 h EVLP. Abréviations : Ctrl = contrôle ; EVLP = perfusion pulmonaire ex-vivo ; HSP70 = protéine de choc thermique 70 ; RCP = compliance pulmonaire statique ; TP = préconditionnement thermique. Modifié d’après Parapanov et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des solutions utilisées dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Réglages EVLP pour le débit de perfusion, la température d’entrée (au niveau de la canule de l’artère pulmonaire) et la ventilation dans le temps. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Dépannage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Matériaux supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le développement d’un modèle EVLP reproductible et physiologiquement pertinent chez le rat représente une avancée significative dans la recherche sur la transplantation pulmonaire. Malgré des différences significatives entre les espèces du rat et du poumon humain (récemment examinées dans1), notamment la plus grande vulnérabilité du poumon du rat, le modèle EVLP du rat offre des interventions pharmacologiques et non pharmacologiques avec une reproductibilité élevée et un faible coût. L’EVLP offre une plate-forme unique pour évaluer la fonction pulmonaire du donneur, simuler des scénarios de lésions cliniques telles que les lésions d’ischémie-reperfusion et mettre en œuvre des interventions thérapeutiques avant la transplantation 2,39,40. Dans ce contexte, le modèle EVLP du rat permet des investigations mécanistes à haut débit dans des conditions étroitement contrôlées33. Au cours des dernières années, plusieurs groupes ont contribué à l’affinement des techniques EVLP chez le rat. Nelson et coll. ont fourni des conseils procéduraux fondamentaux39. Wang et al. ont proposé une configuration EVLP modulaire adaptée pour imiter la simulation du don après la mort circulatoire (DCD)41. Gouchoe et al. ont exploré de nouvelles formulations de perfusat en utilisant des transporteurs d’oxygène artificiels42 et Oliveira et al. se sont concentrés sur l’inflammation après une longue préservation de l’ischémie par le froid38. S’appuyant sur ces connaissances existantes, notre protocole actuel introduit une nouvelle stratégie non pharmacologique, à savoir le préconditionnement thermique, conçu pour activer des mécanismes de protection endogènes pour le reconditionnement des greffons de poumons de rat endommagés par l’ischémie chaude. Notre modèle de poumon endommagé, qui simule les conditions de DCD, a été réalisé chez des rats Sprague-Dawley mâles33.

L’établissement de ce protocole a nécessité une attention particulière à plusieurs étapes techniquement exigeantes qui influencent de manière critique la viabilité et la reproductibilité pulmonaires. Le prélèvement pulmonaire doit être effectué avec un minimum de manipulation pour éviter les lésions parenchymateuses. La profondeur de l’anesthésie est primordiale pour prévenir la congestion pulmonaire induite par le halètement et une mauvaise exsanguination. Il est essentiel d’éviter strictement les bulles d’air lors de la canulation et de l’amorçage du circuit, car même de petites embolies peuvent précipiter l’œdème43. Le Tableau 3 fournit des conseils de dépannage spécifiques pour les problèmes de protocole courants. Bien que les paramètres de ventilation et de perfusion puissent être ajustés dans des limites de sécurité, des stratégies de protection pulmonaire doivent être maintenues pour prévenir le barotraumatisme ou le volutraumatisme44. Le débit de perfusat peut être augmenté jusqu’à 20 % du débit cardiaque estimé chez le rat, contre 40 % chez les modèles plus grands comme les porcs et les humains, mais doit être soigneusement titré45. Dans notre protocole, nous utilisons un débit de perfusat plus faible (7,5 % du débit cardiaque théorique), pour prévenir les pics de pression artérielle pulmonaire et le développement d’un œdème pulmonaire précoce dans les poumons ischémiques chauds, permettant ainsi une préparation prolongée. Bien que certains laboratoires administrent des corticostéroïdes pendant la perfusion pour réduire l’inflammation46,47, leurs effets anti-inflammatoires connus pourraient fausser certains résultats expérimentaux, et nous ne les utilisons donc pas dans notre modèle pour préserver la capacité d’étudier les lésions pulmonaires et les processus inflammatoires.

Le préconditionnement thermique nécessite un contrôle précis de la température. Étant donné que la chaleur est perdue le long du tube du réservoir au poumon, la température de perfusat doit être surveillée au niveau de la canule d’entrée et le réglage du bain-marie maintenu légèrement au-dessus de la température d’entrée souhaitée pour atteindre l’objectif dans la préparation. Les capteurs sont étalonnés chaque année à l’aide d’un thermomètre numérique multicanaux PCE-T 1200 pour garantir la précision.

Nos résultats abordent également les principales limites de la thérapie par la chaleur conventionnelle. L’application systémique de la chaleur est limitée par une régulation imprécise de la température, des effets secondaires systémiques et un manque de spécificité d’organe. L’EVLP contourne ces barrières en fournissant un environnement contrôlé et localisé, permettant une livraison précise du stress thermique directement dans le tissu pulmonaire29. Cette méthode permet une modulation rigoureuse de l’amplitude et de la durée du stress thermique, deux paramètres essentiels pour optimiser la réponse cellulaire protectrice sans déclencher de lésion thermique. De plus, notre plateforme EVLP permet de multiples évaluations en aval, y compris des analyses moléculaires, histologiques et fonctionnelles. Il est important de noter que les poumons soumis à l’EVLP peuvent également être transplantés, ce qui permet d’évaluer directement la fonction du greffon post-EVLP in vivo29. Ainsi, le modèle soutient l’évaluation à la fois au niveau de l’organe isolé et au niveau post-transplantation. Dans ce contexte, l’intégration du préconditionnement thermique, une exposition transitoire à 41,5 °C pendant l’EVLP, apparaît comme une intervention prometteuse. En stimulant une réponse de choc thermique et d’autres voies d’adaptation au stress, cette méthode améliore la résilience du greffon sans facteurs de confusion pharmacologiques. Nos résultats montrent que le préconditionnement thermique améliore la physiologie du greffon pulmonaire, réduit la formation d’œdème et la libération de médiateurs inflammatoires et de biomarqueurs de lésions cellulaires (comme en témoignent les niveaux réduits de facteur de von Willebrand dans le perfusat EVLP des poumons traités thermiquement). Les analyses morphologiques confirment l’effet protecteur de cette intervention, avec une réduction des dommages structurels et une préservation de l’intégrité des tissus. La plupart des données expérimentales sur l’EVLP chez le rat ont été générées chez les mâles, ce qui limite les informations spécifiques au sexe ; Deux études ont rapporté des résultats divergents chez les femmes : réduction des lésions de reperfusion chez l’une et augmentation de l’inflammation chez l’autre48,49. Bien que notre étude ait utilisé des mâles, nous avons précédemment observé des avantages de la TP dans un modèle EVLP porcin utilisant des femelles29, suggérant une pertinence entre les sexes.

Les contraintes et les inconvénients importants de notre méthode doivent être soulignés. Tout d’abord, pour garantir que les poumons sont perfusés à la température réelle souhaitée, ces derniers doivent être surveillés au niveau de la canule d’entrée en appliquant fermement le capteur de température. Deuxièmement, il est obligatoire que les changements de température soient obtenus dans des délais très courts, ce qui nécessite l’utilisation d’un bain d’eau thermique à réponse rapide pour le chauffage et l’ajout de glace au bain-marie pour un refroidissement rapide. Troisièmement, la réponse physiologique au stress thermique peut différer selon les espèces utilisées et dépend fortement du niveau et de la durée du stress. Par conséquent, il est obligatoire d’effectuer des expériences pilotes en utilisant différentes températures de chauffage pendant des durées variables dans le cas où ce protocole est appliqué à différentes espèces animales ou à des poumons humains et d’évaluer des paramètres spécifiques relatifs à la fois aux effets protecteurs et aux effets néfastes potentiels du stress thermique appliqué. Quatrièmement, en raison de l’expression cinétique des gènes sensibles à la chaleur, les effets du préconditionnement thermique dépendent du temps de récupération après l’application du stress thermique. Des expériences utilisant différentes durées de stress post-thermique (c’est-à-dire avec différentes durées d’EVLP) sont nécessaires pour évaluer ces effets dépendants du temps de l’application de chaleur, comme le montre notre récente publication sur ce sujet30.

Dans l’ensemble, notre étude actuelle établit un protocole EVLP détaillé et reproductible chez le rat incorporant le préconditionnement thermique comme stratégie viable pour améliorer la qualité des poumons marginaux du donneur. Le protocole est évolutif et adaptable à des systèmes EVLP animaux ou humains plus grands, ce qui renforce sa pertinence translationnelle. En apportant à la fois rigueur méthodologique et fidélité physiologique, ce modèle ouvre de nouvelles voies pour explorer des interventions non pharmacologiques visant à réduire les lésions d’ischémie-reperfusion et à améliorer les résultats des greffes pulmonaires après la transplantation.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Soutenu par une subvention du Fonds national suisse de la recherche scientifique (Nr 310030_212252) à TK et LL).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement général
Clip d’anévrisme   ;B. BraunFE762K
Capteur thermique à billes d’air/surfaceTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Écarteurs émoussésOutils scientifiques finement18200-09
Serafines bouledoguesOutil scientifique fin18051-50
Compresses de regard   ;Promedical25404
Kit de connexion pour anesthésieHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3076
Coton-tige-cotonSA appliqué6001109
Ciseaux DisséqueursB. Braun & nbsp ;BC165R
Masque facial pour ratTem SegaPFM0006
Héparine 5000 U/mLB. Braun3522430
Chambre d’induction pour anesthésieHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard50-0116
Pinces disséquantes d’iris entièrement courbéesAesculap  ; OC022R
IsofluranProvet AG2222
Vapeur d’isofluran 19,3Rothacher MedicalCV30-310 O2/Air
Cartouche iSTAT4Axon lab AG03P85-25
Ketasol 100 (100 mg/mL)Dr E. Graeub AGQN01AX03
Ciseaux lister   ;B. BraunBC876R
Micro ciseaux, Émoussé courbé/ÉmousséAesculap  ;FM011R
Micro-Adson ForcepsOutil scientifique fin11018-12
Micro-Hémostats des moustiquesOutil scientifique fin13011-12
Microscope OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0,9 %  ;B. Braun534534
Aiguille 23 G x 25 mmBD Microlance 4300800
Aiguille 25 G x 25 mmBD Microlance 3300400
Perfadex (solution de préservation)Xvivo perfusion AB19811
Seringue à perfusion 60 ml luer lockBD plastik300865
RasorAesculap  ;GT-421
ÉchelleMettler ToledoPB602-L
Suture de soie 4-0B. BraunF1134035
Suture en soie 5-0B. BraunF1134027
Steen (solution de perfusion)Xvivo perfusion AB19004
Gants chirurgicauxAnsell93-843
Seringue 1 mL, Omnifix-FB. Braun9161406V
BandeLeukofix02136-00
ThermomètreTES Electrical Electronic Corp1303
Tubes contenant Formol  ;Biosystems Switzerland AG87-0960-00-10113
Ventilateur (EVLP) (Réglez le volume de marée selon le protocole EVLP)FlexiventFX3
Ventilateur (prélèvement pulmonaire) & nbsp ; (Réglez le volume de marée : 7,69*(poids corporel (kg))^1,04)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard683
Rétracteur WEITLANERB. BraunBV073R
Xylasol (1 mg/mL)Dr E. Graeub AGQN05CM92
Yasargil applierB. BraunFE502T
IPL-2 fort
Adaptateur pour pression positiveHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3635
AME 14 - Tube de pompe SC0062 (tygon) à collier 3 jeux, pack de 12Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0126
AME 24 - Tube de pompe SC0072 (tygon) à collier 3 jeux, pack de 12Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0155
Unité de base pour le poumon perfusé isolé taille 2 (IPL-2) type 829/2Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-2266
Kit de connexion pour oxygénateur à fibre D150Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3765
Module d’équilibre de l’œdème (EBM) avec capteurHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-4626
Oxygénateur à fibre de type D150, pack de 5Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3762
Support pour clampage de la canule aortique ou trachéale pour les tables OP taille 5Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3855
Porte-à-vôtres pour oxygénateursHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3061
Système de mesure de poids HSEHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-4604
Logiciel de base HSE-BDAS pour l’acquisition de données sous Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-1712
Matériel d’acquisition de données HSE-USB, boîtier USB autonome pour Windows 10 ou 11Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3330
ISM 827/230 V pompe à rouleaux analogue reglologique, 4 canaux, 0,003-35 ml/min (2 x)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0114
Canule de l’oreillette gauche (DD 4,0 mm)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0712
Mini électrode oxygène à flux direct avec raccords 1/16" (en option)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-4189
Kit de montage pour oxygénateur à fibre de type D150 sur supportsHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3759
Robinet d’arrêt à sens unique type 9500 (un pour la PA, un pour LA)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0097
OPPM plugsys module de pression partielle d’oxygène type 697  ; (Optionnel)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0210
Boîtier système Plugsys de base type 603Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0045
pO2 solution zéro 20 paquets de 20 ml  ; (Optionnel)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3812
Transducteur de pression P75 type 379/HSE, plage -75 à + 75 mm Hg (PA, LA)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0020
Canule de l’artère pulmonaire (DO 2,0 mm, diamètre de la tête, 2,5 mm)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0711
Réservoir (chemisée) pour la solution tamponHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3496
Contrôleur servo SCP plugsys pour type de perfusion 704Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-2806
Boîtier de blindage pour un capteur pO2 ou pCO2 mini capteur   ; (Optionnel)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-4196
Petite plaque de montage pour un seul capteur O2 ou CO2   ; (Optionnel)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3000
Module amplificateur transducteur TAM-A plugsys type 705/1 (un pour PA, un pour LA)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0065
Circulateur thermostatique E 103 (3 L)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0125
Robinet d’arrêt à trois voies de type 9560 R (un pour le PA, un pour LA)Hugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-0096
Ensemble de tubes pour réservoir tampon à cric avec vannes d’arrêt de conduite hydrauliqueHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3456
Canule de ventilation (trachéale) DO 2,0 mm, L 14 mmHugo Sachs Elektronik - Appareil de Harvard73-3384
Logiciels informatiques
Logiciel de base HSE-BDAS pour l’acquisition de données sous Windows 2000, XP, Windows 7Hugo Sachs Elektronik - Appareil de HarvardV2.0
ExcelMicrosoft2502, Microsoft 365
FlexiwareScireq8
GraphPad PrismGraphPad Software inc.10.0.1
Rats Sprague-Dawley & nbsp ;Laboratoires Charles River (Saint-Germain-Nuelles, France) & nbsp ;

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