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Article de méthode

Les Tregs CD8+CD103+ atténuent la maladie de l’œil sec grâce à la suppression de l’inflammation médiée par les cellules T CD4+ et la protection de l’intégrité de la surface oculaire chez la souris

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DOI :

10.3791/69110

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21 novembre 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan Second People's Hospital

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole démontrant le transfert adoptif des lymphocytes T régulateurs CD8+CD103+ comme intervention immunothérapeutique visant à atténuer la maladie de l’œil sec induit par le stress par la modulation complète des réponses pathogènes des lymphocytes T CD4+.

Résumé

Les lymphocytes T régulateurs CD8+CD103+ représentent une population immunosuppressive spécialisée avec un potentiel thérapeutique démontré dans les maladies auto-immunes ; cependant, leur rôle dans l’inflammation de la surface oculaire reste inexploré. Ce protocole décrit une approche systématique pour isoler les cellules T CD8+CD103+ chez des souris exposées à un stress desséché et évaluer leur efficacité thérapeutique par transfert adoptif dans la maladie oculaire sèche expérimentale. La méthodologie englobe le tri cellulaire activé par magnétisme pour la purification des lymphocytes T CD8+CD103+, l’induction standardisée du stress desséché, ainsi que des évaluations fonctionnelles complètes, incluant la mesure de la production de larmes, les tests de perméabilité de la barrière cornéenne et l’analyse moléculaire des médiateurs inflammatoires. Des résultats représentatifs démontrent que la thérapie par cellules T CD8+CD103+ a significativement restauré la production lacrymale, préservé les populations de cellules du gobelet conjonctival et maintenu l’intégrité de la barrière épithéliale cornéenne. Le traitement a permis une suppression substantielle de l’expression de la métalloprotéinase matricielle, une réduction de la mort cellulaire apoptotique et a modulé les profils cytokines de profils pro-inflammatoires à des motifs protecteurs tissulaires. Le protocole réduisait efficacement l’infiltration des lymphocytes T CD4+ dans les tissus oculaires, tout en supprimant simultanément la production pathogène d’IL-17A et d’IFN-γ et en augmentant les niveaux protecteurs d’IL-13. Cette approche fournit un cadre expérimental solide pour étudier l’immunomodulation médiée par les cellules T CD8+CD103+ dans les troubles de la surface oculaire et établit une méthodologie fondamentale pour développer de nouvelles thérapies cellulaires pour la prise en charge des maladies de l’œil sec.

Introduction

La maladie de l’œil sec (DED) représente un trouble de la surface oculaire répandu et invalidant qui s’est imposé comme une préoccupation sanitaire mondiale majeure, affectant 10 à 30 % de la population mondiale et compromettant considérablement la qualité de vie, la productivité au travail et le bien-être psychologique despatients 1,2,3. La physiopathologie de la DDE implique une interaction complexe entre l’instabilité du film lacrymal, l’inflammation de la surface oculaire et les anomalies neurosensorielles, qui perpétuent collectivement un cercle vicieux de lésions tissulaires et d’altérationfonctionnelle 4. Au niveau moléculaire, l’hyperosmolarité lacrymale agit comme un mécanisme pathogène central, déclenchant des événements inflammatoires en cascade qui activent les voies de réponse au stress, induisent la libération de médiateurs pro-inflammatoires et compromettent finalement l’équilibre homéostatique délicat du microenvironnement de la surface oculaire 5,6,7.

Le paysage immunologique de la DED est dominé par des réponses immunitaires adaptatives, l’immunité médiée par les cellules T CD4+ jouant un rôle clé dans l’orchestration de la détérioration de la surface oculaire et la perpétuation de l’inflammationchronique 8. Les lymphocytes T CD8+ constituent un composant essentiel de la population cellulaire immunitaire homéostatique normale dans les tissus oculaires, maintenant la surveillance immunitaire et l’intégrité tissulaire dans des conditionsphysiologiques 9. Des études fondamentales ont démontré que le stress desséchant (DS) active les cellules présentatrices d’antigènes et prépare ensuite les cellules T CD4+ à des phénotypes pathogènes, qui peuvent induire de manière autonome une kératoconjonctivite sèche lacrymo-immune (KCS) lorsqu’elle est transférée adoptivement à des souris nues déficientes en cellules T, récapitulant ainsi les caractéristiques clés de la DEDhumaine 10,11.

Compte tenu du rôle central des réponses dysrégulées des cellules T CD4+ dans la pathogenèse de la DED, des stratégies thérapeutiques ciblant la modulation de l’immunité pathogène des lymphocytes T se sont révélées être des approches prometteuses pour la prise en charge de cette maladie. Dans ce contexte, les lymphocytes T régulateurs CD8+ (Treg), en particulier le sous-ensemble CD8+CD103+, ont attiré une attention significative en raison de leurs puissantes capacités immunosuppressives et de leurs fonctions protectrices tissulaires dans diverses affections auto-immunes et inflammatoires. Ces populations régulatrices spécialisées modulent les réponses immunitaires par de multiples mecanismes, notamment la suppression médiée par cytokines, l’inhibition directe du contact cellulaire et la régulation métabolique de la fonction des lymphocyteseffecteurs 12,13,14. L’intégrine αEβ7 (CD103) agit comme un récepteur critique de la recherche de la recherche qui facilite le positionnement des lymphocytes intraépithéliaux à travers les tissus muqueuss, permettant aux Tregs CD8+CD103+ d’exercer des effets immunorégulateurs localisés aux sitesd’inflammation 15.

Il existe de plus en plus de preuves que les Tregs CD8+CD103+ présentent un potentiel thérapeutique significatif pour atténuer les réactions immunitaires nocives dans une gamme de conditions muqueusesauto-immunes 16,17,18. Ces cellules présentent des schémas de trafic uniques qui permettent leur accumulation préférentielle aux sites muqueus, où elles peuvent contrer efficacement les réponses immunitaires destructrices des tissus tout en favorisant la guérison et l’homéostasie. Des recherches récentes ont commencé à élucider le rôle des lymphocytes T CD8+CD103+ dans l’immunité de la surface oculaire, démontrant leur expansion numérique dans les ganglions lymphatiques cervicaux après exposition au DS et leur capacité à migrer vers les tissusconjonctivaux 19,20,21,22. Cependant, malgré ces observations intrigantes, les contributions fonctionnelles spécifiques des lymphocytes T CD8+CD103+ à la pathogénie de l’œil sec et leur potentiel thérapeutique pour moduler les lésions de la surface oculaire médiées par les cellules T CD4+ restent inentièrement comprises.

Le transfert adoptif des Tregs CD8+CD103+ représente une avancée nette par rapport aux approches thérapeutiques conventionnelles de la DED, incluant les larmes artificielles, les agents anti-inflammatoires et les immunosuppresseurs, en ciblant les mécanismes immunitaires pathogènes sous-jacents plutôt que de simplement traiter les manifestationssymptomatiques 23. Contrairement aux thérapies immunosuppressives systémiques qui suppriment globalement la fonction immunitaire, l’intervention basée sur le Treg CD8+CD103+ offre une modulation ciblée des réponses pathogènes des lymphocytes T CD4+ tout en préservant l’immunitéprotectrice 24. Cette approche complète les thérapies cellulaires existantes, telles que les applications des cellules souches mésenchymates et le transfert de Treg-Treg CD4+CD25+, en offrant une spécificité tissulaire muqueuse accrue grâce aux mécanismes de homing médiés par CD10325.

Le manque de connaissances critique concernant les mécanismes régulateurs par lesquels les cellules T CD8+CD103+ peuvent influencer la pathogéniose de l’œil sec représente un obstacle important au développement d’interventions immunothérapeutiques ciblées pour cette affection invalidante. De plus, l’interaction complexe entre les populations de lymphocytes T régulateurs et effecteurs dans l’inflammation de la surface oculaire nécessite une investigation systématique pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et optimiser les stratégies thérapeutiques. Cette étude vise à caractériser de manière exhaustive la régulation médiée par les cellules T CD8+CD103+ des processus pathogènes alimentés par les cellules T CD4+ dans un modèle murin bien établi de la maladie de l’œil sec. L’innovation méthodologique centrale consiste à isoler séquentiellement les cellules régulatrices CD8+CD103+, suivie d’un transfert adoptif et d’une évaluation complète des lectures fonctionnelles, histologiques et moléculaires afin d’établir l’efficacité thérapeutique et d’élucider les mécanismes sous-jacents. L’objectif ultime était d’améliorer notre compréhension des réponses immunitaires à la surface oculaire et de découvrir des stratégies thérapeutiques potentielles pour gérer la DED chez l’humain.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été menées en stricte conformité avec la Déclaration ARVO sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvées par le Comité d’éthique des animaux expérimentaux du Second Hôpital Populaire de Jinan. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale et réduire le nombre d’animaux utilisés conformément au principe des 3R (Remplaçant, Réduction et Raffinement).

1. Préparation animale et conception expérimentale

  1. Obtenez des femelles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines dans un établissement agréé pour animaux de laboratoire (code de souche : 027) présentant un état de santé spécifique sans pathogènes.
  2. Les animaux d’intérieur dans un environnement contrôlé, maintenant des cycles clair-obscurité de 12 h (lumières allumées de 06h00 à 18h00), une température de 22 ± 2 °C, et une humidité relative de 50-60 % grâce à des systèmes de surveillance environnementale.
  3. Permettre aux animaux de s’acclimater pendant une semaine avant les procédures expérimentales tout en fournissant à volonté la nourriture et l’eau standard en laboratoire.
  4. Randomisez 32 souris en quatre groupes expérimentaux (n = 8 par groupe) en utilisant une randomisation générée par ordinateur : contrôles non contraints (NS), contraintes desséquantes seules (DS), contraintes desséquantes avec contrôle véhicule (DS + VC), et contraintes desséchantes avec traitement des cellules T CD8+CD103+ (DS + CD8+CD103+).
    REMARQUE : Surveillez quotidiennement les animaux pour détecter des signes de détresse, tels qu’une diminution de l’activité ou une perte de poids supérieure à 10 %.

2. Induction de contrainte desséchée

  1. Préparez une solution d’hydrobromure de scopolamine en dissolvant 0,5 mg dans 0,2 mL de solution stérile phosphatée tamponnée (PBS) juste avant utilisation, atteignant ainsi une concentration finale de 2,5 mg/mL.
  2. Administrez la scopolamine par voie sous-cutanée à une dose de 0,5 mg/kg de poids corporel (environ 0,04 mL par souris de 20 g) quatre fois par jour à 8h00, 12h00, 15h00 et 18h00 pendant cinq jours consécutifs à l’aide d’aiguilles de 27 G.
  3. Positionnez des ventilateurs à vitesse variable pour générer un tirage d’air continu avec une vitesse standardisée de 15 m/s mesurée au niveau de la cage à l’aide d’un calibrage d’anémomètre numérique.
  4. Maintenir l’humidité ambiante en dessous de 40 % à l’aide de chambres dessiccantes contenant du gel de silice activé (maillage de grade 40, 6-12) tout en surveillant en continu les conditions environnementales avec des hygromètres numériques (précision ±2 % d’humidité relative à 2 %).
  5. Maintenez la température à 22 ± 1 °C pendant toute la période d’exposition en utilisant des systèmes de contrôle environnemental de précision avec surveillance continue.
  6. Surveillez les animaux deux fois par jour pour détecter des signes de déshydratation, de perte de poids (>15 % justifie une exclusion) ou des comportements de détresse, notamment un toilettage excessif ou une activité réduite.

3. Isolement et purification des cellules T CD8+CD103+

  1. Sacrifient des souris donneuses précédemment exposées à un stress desséché par asphyxie au CO₂, suivie d’une luxation cervicale, selon les protocoles d’euthanasie approuvés.
  2. Prélever les rates et les ganglions lymphatiques cervicoles superficiels dans des conditions stériles à l’aide d’instruments stériles dans une armoire de sécurité biologique, en plaçant les tissus dans un milieu RPMI-1640 glacé complété avec un sérum bovin fœtal à 10 %.
  3. Préparez les suspensions unicellulaires en perturbant mécaniquement les tissus à l’aide de passoires à 70 μm à l’aide de ventouses à seringues stériles, en lavant les cellules deux fois avec du PBS contenant 2 % de FBS et 1 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA).
  4. Isoler les lymphocytes T CD8+ en utilisant un tri cellulaire activé magnétiquement avec des microperles magnétiques conjuguées aux anticorps CD8 selon les instructions du fabricant.
  5. Évaluer la viabilité cellulaire à l’aide du test d’exclusion du bleu de trypan (solution à 0,4 %), en comptant les cellules viables et non viables à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé, en ne procédant qu’aux préparations dépassant 95 % de viabilité.
  6. Enrichir pour l’expression de CD103+ par incubation séquentielle avec un anticorps anti-CD103-APC à 1:100 dilué pendant 30 minutes à 4 °C dans le noir.
  7. Effectuer une séparation magnétique secondaire à l’aide de microperles anti-allophycocyanine (anti-APC) avec colonnes LS afin d’obtenir des cellules CD8+CD103+ doublement positives selon les protocoles du fabricant.
  8. Validez la pureté cellulaire à l’aide de cytométrie en colorant les aliquotes avec des anticorps anti-CD8-FITC et anti-CD103-APC, en assurant une population de >CD8+CD103+ doublement positives avant de procéder.

4. Protocole de transfert adoptif

  1. Préparez des suspensions de cellules T CD8+CD103+ à une concentration de 5 × 106 cellules/mL dans un sérum stérile tamponné phosphate en centrifugant les cellules à 300 × g pendant 5 minutes et en les resuspendant dans un volume approprié.
  2. Injectez 1 × 106 cellules dans 200 μL de PBS stérile intrapéritonéalement aux jours -2, 0 et +2 par rapport à l’initiation du stress desséché, en assurant un mélange doux avant chaque injection.
  3. Administrez des volumes équivalents de PBS stérile aux groupes témoins du véhicule en utilisant un même schéma d’injection et une technique identiques pour maintenir la cohérence expérimentale.
  4. Maintenir les préparations cellulaires sur glace et effectuer les transferts dans les 2 heures suivant l’isolement afin de préserver une viabilité et une fonction optimales.
  5. Faites tourner les sites d’injection entre le bas de l’abdomen gauche et droit pour minimiser l’inflammation locale et surveillez les animaux pendant 24 heures après l’injection pour détecter des réactions indésirables.

5. Procédure d’évaluation fonctionnelle

  1. Mesure de la production de larmes
    1. Effectuez des mesures régulières à 20h00 pour tenir compte des variations circadiennes de la production de larmes.
    2. Maîtrisez doucement la souris à l’aide de dispositifs de contention appropriés sans anesthésie pour éviter toute interférence avec les mécanismes naturels de production des larmes.
    3. Placez du fil de coton imprégné de rouge phénolé dans le fornix conjonctival inférieur pendant exactement 15 secondes à l’aide de pinces à pointe fine.
    4. Mesurez immédiatement la longueur du filetage mouillé à l’aide d’un étrier numérique de précision (précision ± 0,01 mm) sous des conditions d’éclairage fluorescent standardisé.
  2. Évaluation de la fonction de la barrièrecornéenne 26
    1. Anesthésiez brièvement la souris avec une inhalation d’isoflurane à 2 % lors de l’application du traceur pour garantir une instillation précise.
    2. Injectez 0,5 μL de solution vert-dextran Oregon de 50 mg/mL sur la surface cornéenne centrale à l’aide d’une micropipette de précision à pointes de déplacement positif.
    3. Rincez soigneusement les cornées avec du sérum stérile cinq fois après 1 minute d’incubation pour éliminer l’excès de traceur, assurant ainsi l’élimination complète de la fluorescence de surface.
    4. Photographier immédiatement les cornées à l’aide d’une microscopie à fluorescence avec un ensemble de filtres à isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (excitation 490 nm, émission 525 nm) et des paramètres d’exposition standardisés.
    5. Quantifier l’intensité de fluorescence à l’aide du logiciel ImageJ avec des protocoles cohérents de sélection de la région d’intérêt et de soustraction de fond.
      1. Convertir les images en niveaux de gris de 8 bits, définir une région circulaire d’intérêt (ROI) standardisée couvrant le diamètre central de 3 mm de la cornée.
      2. Mesurer la valeur moyenne de gris, soustraire la fluorescence de fond mesurée d’une région non cornéenne adjacente, et exprimer les résultats sous forme de fluorescence totale corrigée (CTF) calculée comme : CTF = Densité intégrée - (Aire de ROI × Fluorescence moyenne de fond)22.

6. Traitement histologique et analyse

  1. Retirez les yeux et les structures environnantes immédiatement après l’euthanasie, puis fixez du paraformoldéhyde à 4 % pendant 24 heures ou intégrez dans un composé à température de coupe optimale (OCT) pour les coupes congelées, afin d’assurer une bonne orientation pour la coupe sagittale.
  2. Préparez des sections sagittales en série (6 μm pour les congélés, 5 μm pour la paraffine) en utilisant des repères anatomiques standardisés (le nerf optique comme point de référence) pour des plans de coupe cohérents sur tous les spécimens.
  3. Effectuer une coloration périodique acide-Schiff (PAS) pour la quantification des cellules goblet en utilisant des protocoles standardisés avec des contrôles positifs et négatifs appropriés.
  4. Effectuer une coloration immunofluorescence à l’aide d’anticorps primaires : anti-MMP-3 (1:200), anti-MMP-9 (1:100), caspase-3 anti-activée (1:300), caspase-8 anti-activée (1:200) et anti-CD4 (1:100) avec incubation nocturne à 4 °C.
  5. Quantifier les cellules de gobelet par millimètre de longueur conjonctivale en utilisant des méthodes d’échantillonnage systématique, en comptant les cellules dans cinq champs de haute puissance non chevauchants par section et en moyennant les résultats.

7. Analyse moléculaire

  1. Extraire l’ARN total des tissus conjonctivals et cornéens regroupés en utilisant les protocoles d’extractionvalidés 27.
  2. Synthèse d’ADNcDNA et PCR quantitativeen temps réel 28
    1. Préparez des mélanges de réaction de transcription inverse contenant 1 μg d’ARN total, des amorces oligo-dT (50 μM), des amorces hexamères aléatoires (100 μM), une enzyme transcriptase inverse, un tampon de réaction et de l’eau sans nucléase dans un volume final de 20 μL.
    2. Incuber les mélanges de réaction dans un thermocycleur à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre la synthèse de l’ADNc de première place.
    3. Inactivez l’enzyme transcriptase inverse en chauffant à 85 °C pendant 5 secondes, puis refroidissez à 4 °C et stockez l’ADNc à -20 °C jusqu’à utilisation.
    4. Dilué a synthétisé l’ADN 1:10 avec de l’eau sans nucléase pour servir de modèle lors des réactions PCR ultérieures.
    5. Préparez des mélanges de réaction PCR en temps réel (volume final de 20 μL) contenant 1 μL de gabarit d’ADNc dilué, des amorces avant et arrière (concentration finale de 0,2 μM chacun), le mélange maître SYBR Green, et de l’eau sans nucléase.
    6. Charger les échantillons en triple exemplaire dans des plaques de réaction optique à 96 puits, incluant des contrôles sans gabarit pour chaque paire d’amorce.
    7. Programmez le thermocycleur avec les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 minutes, suivie de 40 cycles de dénaturation (95 °C pendant 15 s), recuit (60 °C pendant 30 s) et extension (72 °C pendant 30 s).
    8. Inclure une étape de la courbe de dissociation immédiatement après l’amplification : 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 minute, puis une augmentation progressive de la température à 95 °C à un taux de 0,3 °C/s pour vérifier l’amplification en produit unique.
    9. Analysez les courbes d’amplification et les valeurs de seuil de cycle (Ct) à l’aide d’un logiciel d’instrument, en assurant une efficacité d’amplification entre 90 et 110 % pour toutes les paires d’amorces.
    10. Normaliser l’expression des gènes cibles (IL-17A, IFN-γ, IL-13, MMP-3 et MMP-9) vers le gène de maintien GAPDH en utilisant la méthode 2-ΔΔCt .
    11. Utilisez les séquences d’amorce comme spécifié dans le tableau 1 pour tous les gènes cibles et de référence.
  3. Quantifiez les niveaux de protéines cytokines dans les extraits tissulaires à l’aide de kits ELISA disponibles dans le commerce, avec des courbes standard appropriées et des contrôles qualité.

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Résultats

La mise en œuvre réussie de ce protocole permet d’améliorer globalement la pathologie de la surface oculaire induite par le stress par desséchage grâce à l’immunomodulation médiée par les lymphocytes T CD8+CD103+. Les résultats positifs démontrent une restauration significative de la production de larmes, atteignant généralement une récupération de 60 à 80 % par rapport aux témoins non stressés, tandis que les animaux traités en véhicule présentent des dé...

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Discussion

Cette étude établit que les lymphocytes T régulateurs CD8+CD103+ sont des agents thérapeutiques puissants desséchant la maladie oculaire sèche induite par le stress grâce à une modulation complète des réponses pathogènes médiées par les cellules T CD4+. Les résultats révèlent que le transfert adoptif des lymphocytes T CD8+CD103+ permet d’assurer une protection multifacette de l’intégrité de la surface oculaire, englobant la restauration fonctionnelle de la production lacrymale, la préser...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrent, financier ou autre, qui pourrait influencer de manière inappropriée l’œuvre décrite dans ce manuscrit.

Remerciements

Nous reconnonçons le soutien technique fourni par le personnel de laboratoire du 2e hôpital populaire de Jinan ainsi que par le personnel des établissements de soins animaliers qui ont maintenu des conditions de logement optimales tout au long de la période expérimentale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-CD103-APCBiolégendeClone 2E7Cytométrie en flux et tri cellulaire
Microbilles magnétiques anti-CD8Miltenyi Biotec-Séparation des cellules magnétiques
Dextrane vert de l’Oregon cornéenInvitrogenD7172Poids moléculaire 70 000
Kit ELISA, IFN-& GAMMA ;eBioscienceBMS606Quantification des cytokines
ELISA kit IL-13eBioscienceBMS6015Quantification des cytokines
ELISA kit IL-17AeBioscienceBMS6001Quantification des cytokines
ImageJInstituts nationaux de la santéVersion 1.53K
Fils de coton rouge phénolZone-Quick, Yokota-Mesure de la production de larmes
Scopolamine hydrobromureMelonepharmaMB5860Antagoniste muscarinique

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